Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Författarna skulle vilja tacka Jules Morin för insiktsfulla kommentarer på manuskriptet. Denna forskning finansierades av utmärkelser från CADASIL tillsammans har vi hopp ideell organisation, centrum för kvinnors hälsa och forskning, och NHLBI R01HL136636 (FD).

Alla experiment godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Colorado, Anschutz Medical campus och utfördes enligt riktlinjerna från National Institutes of Health.
1. lösningar
<ol><li>Använd MOPS-buffrad saltlösning för dissektion och för att hålla proverna vid 4 ° c före användning. Gasa inte lösningen. Förbered MOPS buffrad saltlösning med följande sammansättning: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2Po4,...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

Den trycksatta hicapa (Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole) beredning beskrivs i det nuvarande manuskriptet är en förlängning av vår väletablerade förfarande för att isolera, tryck, och studera parenkymal arterioler29. Vi rapporterade nyligen att Kir 2,1 kanaler i hjärnan kapillära endotelceller känsla ökar i [K+]o i samband med neurala aktivering, och generera en stigande hyperpolariserande signal som Vidar uppströms arterioler20. A...

Den piala cirkulationen på hjärnans yta har varit föremål för mycket studie, delvis på grund av dess experimentella tillgänglighet. Dock skapar topologin för cerebral kärlsystemet distinkta regioner. I motsats till den robusta Arvika nätverk rik på anastomoser med betydande kapacitet för att omdirigera blodflödet, intracerebral parenkymala arterioler (PAS) nuvarande begränsade säkerheter försörjning, var och en av dem parfymera en diskret volym av nervvävnad1,2. Detta skapar en flaskhals effekt på blodflödet som, kombinerat med unika fysiologiska funktioner3,4,5,6,7,8, gör intracerebral arterioler en avgörande plats för cerebralt blodflöde (CBF)regel 9,10. Trots de tekniska utmaningarna i samband med isolering och kanylering av utbetalande organen har det senaste decenniet sett ett ökat intresse för ex vivo funktionella studier med tryckkärl11,12,13,14,15,16,17. En av anledningarna till detta ökade intresse är den avsevärda forskningsinsatser som bedrivs på neurovaskulär koppling (NVC), mekanismen upprätthålla hjärnans funktionella hyperemi18.
Regionalt, CBF kan snabbt öka efter lokala neurala aktiveringen19. Den cellulära mekanismer och signalering egenskaper kontrollera NVC är ofullständigt förstås. Emellertid, vi identifierade en tidigare oväntad roll för hjärnans kapillärer under NVC i avkänning Neural aktivitet och översätta den till en hyperpolariserande elektrisk signal till vidga uppströms arterioler20,21,22. Actionpotentialer23,24 och öppnande av stor-conductance ca2 +-aktiverad K+ (BK) kanaler på astrocytic endfeet25,26 öka interstitiell kalium Jon koncentrationen [k+]o, vilket resulterar i aktivering av stark aktiv likriktare K+ (KIR) kanaler i det vaskulära endotelet i kapillärerna. Denna kanal aktiveras av externa K+ men också av hyperpolarisering själv. Spridning genom gap korsningar, den hyperpolariserande strömmen sedan återskapar i angränsande kapillära endotelceller upp till arteriole, där det orsakar myocyt avslappning och CBF öka20,21. Studiet av denna mekanism ledde oss att utveckla en trycksatt kapillär-parenkymal arteriole (Capa) beredning för att mäta arteriolär diametern under kapillärstimulering med vasoaktiva agenter. Den CaPA preparatet består av en kanylerad intracerebral arteriole segment med en intakt, nedströms kapillär ramification. Kapillärändarna komprimeras mot kammarens glasbotten med en mikropipett, som ockluderar och stabiliserar hela vaskulär bildningen20,21.
Vi har tidigare gjort instrumentella innovationer genom Imaging Capa preparat från mus barken20,21 och arterioler från råtta amygdala13 och Hippocampus16,17. Som Hippocampus kärlsystemet får mer uppmärksamhet på grund av dess mottaglighet för patologiska tillstånd, här ger vi en steg-för-steg-metod för Capa beredning från musen Hippocampus (hicapa) som inte bara kan användas i funktionella NVC studier men också i molekylärbiologi, immunokemi, och elektrofysiologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

Från subtila beteendemässiga förändringar till sent stadium demens, vaskulär kognitiv svikt utvecklas typiskt efter cerebral ischit. Stroke och hjärtstillestånd är anmärkningsvärt sexuellt dimorfiska sjukdomar, och båda inducera cerebral ischa. Emellertid, framsteg i förståelsen av vaskulär kognitiv svikt, och sedan utveckla könsspecifika behandlingar, har delvis begränsats av utmaningar i att undersöka hjärnans mikrocirkulation från musmodeller i funktionella studier. Här presenterar vi en metod för att undersöka kapillär-till-arteriole signalering i en ex vivo Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole (HiCaPA) beredning från mushjärna. Vi beskriver hur man isolerar, kanylera, och pressa mikrocirkulationen för att mäta arteriolär diameter som svar på kapillärstimulering. Vi visar vilka lämpliga funktionella kontroller kan användas för att validera HiCaPA förberedelse integritet och Visa typiska resultat, inklusive testning av kalium som en neurovaskulär koppling agent och effekten av den nyligen kännetecknas hämmare av Kir2 inåt korrigera kalium kanal familj, ML133. Vidare jämför vi svaren i beredningar erhållna från manliga och kvinnliga möss. Även om dessa data återspeglar funktionella utredningar, kan vår metod också användas inom molekylärbiologi, immunokemi och elektrofysiologiska studier.

Endotelial Small-conductance (SK) och Intermediate-conductance (IK) ca2 +-känsliga K+ kanaler utövar en dilaterande inverkan på diametern på Pas. Bad applicering av 1 μM NS309, en syntetisk IK och SK-kanalagonist, orsakad nära maximal dilatation (figur 2a, B). Emellertid, kapillärendotelceller saknar IK och SK kanaler och inte hyperpolarize som svar på NS30920. Som ett resultat, stimuleran...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Den nuvarande manuskript Detaljer hur man isolerar Hippocampus arterioler och kapillärer från mus hjärnan och hur man pressar dem för tryck myography, immunofluorescenser, biokemi, och molekylära studier.

Ex vivo trycksatt Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole förberedelse för funktionell studie

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Vår metod möjliggör studier av blodkärl som ligger i strukturer som annars skulle vara svåra att avbilda i Vivo, såsom hippocampus. Eftersom blodkärlen avlägsnas från hjärnvävnaden, signalering mellan kapillärerna och arteriole kan studeras utan off-target effekter på den omgivande vävnaden. För att isolera hippocampus, använd små dissection saxar för att skära huden längs mittlinjen på toppen av huvudet på musen och flytta huden åt sidorna.Med början vid skallens kaudala sida, skär skallen längs mittlinjen tills luktglödlamporna har nåtts och ta bort delar av skallen tills storhjärnan är utsatt. Börjar nära näsan på musen, långsamt bort hjärnan, med hjälp av saxen för att skära igenom luktlökar, kranialnerv och ryggmärg. Submerge hjärnan, ventrala sidan ner i MOPS Buffrad Koksalt, i mitten av en dissekering platta, och placera plattan under en dissekering mikroskop.Hålla den skarpa kanten parallellt med botten av skålen, använd rakblad för att skära hjärnan på mitten längsgående spricka i ett slag. Placera en halvklot i mitten av plattan med mittlinjen vänd nedåt och tryck rakbladet rakt genom vävnaden längs tvärgående spricka för att avlägsna lillhjärnan och hjärnstammen. Rotera halvklotet så att den mediala sidan är vänd uppåt och använd en spatel för att hålla hjärnan på plats.Sätt in spetsen på en andra spatel under corpus callosum, ösa under vävnaden för att ta bort thalamus, septum, och hypotalamus från hippocampus. Hippocampus bör nu vara synlig som en böjd struktur nära den bakre sidan av storhjärnan. Använd en spatel för att hålla storhjärnan på plats, använd den andra spatel för att skopa hippocampus ur storhjärnan.Överför sedan hippocampi till en ny dissektionsplatta, fylld ungefär halvvägs med färsk MOP-lösning. För hippocampus arteriole isolering, placera små stift i varje ände av en hippocampus för att säkra provet hippocampus artär sidan upp. Använda mycket skarpa tänjningar, försiktigt sträcka små delar av hippocampi att lossa vävnaden som omger arterioler.Och sök igenom dorsala hippocampus vävnader för att identifiera de yttre tvärgående artärerna. När artären har lokaliserats, ta tag i den yttre tvärgående artären från hippocampus och långsamt dra bort den från vävnaden för att samla in arterioler och kapillärer. Artären från varje hippocampus avlägsnas separat.När det inte finns några fler fartyg som ska tas bort, placera proverna på is och kasta den återstående hippocampus vävnaden. För kanylulation av arterioler, lokalisera och arteriole med en gren som slutar med kapillärer och placera arteriole i en orgel kammare. Tryck försiktigt kanylspetsen genom arterioleväggen nedanför målområdet för att montera blodkärlet.Sedan försiktigt glida fartyget på kanylen tills det finns tillräckligt med vävnad som att placera slips. Använd 12-0 nylon suturer för att göra en lös knut som kommer att passa över blodkärlet och kanylen, och använda en halv hitch knut för att säkra banden, dra ändarna för att dra åt knuten för att säkra arteriole till kanylen. Säkra en annan slips på andra änden av arteriole att täta den.På motsatt sida av kammaren, sänk en andra kanyl tills kanylens punkt stift ner slipsen på arteriolens ände. Använd sedan en tredje kanyl för att fästa kapillärgrenen på täckplattan, placera spetsen nära slutet av grenen, samtidigt som ändarna på kapillärerna exponeras. Som hjärnans mikrocirkulation är utsökt bräcklig, se till att minimera sträckning och hantering av kärlen under cannulation förfarandet för att säkerställa överlevnad av arterioler.För tryck myografi analys, överföra kammaren till ett ljus mikroskop skede med inspelning programvara och ansluta inflöde och utflöde slangar till kammaren för profusion. Starta profusion med 37 grader Celsius Konstgjord cerebrospinalvätska vid en fyra milliliter per minut flödeshastighet, och fäst den pressande kanylen till peristaltisk pump i kombination med en tryckgivare. Ta med det inre trycket till 20 millimeter Merkurius och starta inspelningsprogramvaran.Justera mikroskopet och bildinställningarna för att uppnå en så tydliga bild som möjligt. Och använda Edge Detection programvara för att kontrollera att arteriole är ca 15 till 30 mikrometer i diameter när den är helt vidgade. När inställningarna har optimerats, påbörja inspelningen och öka det intravaskulära trycket i kärlet upp till 40 millimeter Mercury, samtidigt som du spelar in arteriole diameter med Edge Detection-programvaran.Sedan ymnig kammaren i 15 till 20 minuter för att tvätta ur MOP-lösningen. För att testa livskraften hos kärlet, applicera en mikromolar NS309 lösning på badet profusion, bör arteriolar segmentet vidgas, visar en 30 till 40%myogenic ton. När baslinjen tonen för arteriole har fastställts, använd en glas puller att göra kanylerna med en fin punkt i ena änden, och använda forceps för att bryta spetsen på varje kanyl, så att läkemedlet av intresse kan flöda smidigt genom spetsen på fem pounds av tryck per kvadrattum.Fyll kanylen med drogen av intresse. Och ladda kanylen på en treaxlad mikromanipulator fäst vid mikroskopet. Anslut slangen från tryckutskjutningssystemet till kanylen, och sänk långsamt ner kanylen i badet nära kapillärerna, var noga med att inte träffa någon del av kärlet eller kammaren.För att stimulera kapillärerna, sänk kanylen till täckbladet precis intill kapillärerna och aktivera tryckutskjutningssystemet med önskad utskjutningstid. Vid slutet av stimuleringen höjer du kanylen något för att undvika ytterligare stimulering. För att bekräfta att endast kapillärerna stimulerades, fyll den nya kanylen med en mikromolekyl av NS309-lösning och stimulera kapillärerna som visats.Erhåll därefter maximalen vasodilation, genom att bada förberedelsen med Den Calcium-fria lösningen. Badapplikation av en en micromolar NS309 orsakar en nära maximal dilation av arteriolen tack vare det Calcium-känsliga Potassium kanaliserar i endotheliumet. Kapillär endotelceller dock saknar mellanliggande och små ledningskanaler och inte hyperpolarisera inte som svar på agonisten, som ett resultat, stimulerande kapillär slutar med NS309, inte orsakar uppströms arteriolar dilation, detta indikerar att NS309 inte nådde arteriole, och kan användas som en kontroll för att komma åt spacial begränsning av föreningen tillämpas på kapillärer av tryckutskjutning.Använda hippocampus kapillär parenchymal arteriole preparatet som visats, tillämpningen av en Artificiell cerebrospinalvätska kompletteras med 10 millimolar Kalium till kapillärändarna, resulterar i en uppströms arteriolar dilation som inte skiljer sig mellan preparat från manliga och kvinnliga möss. Vidare, tillsats av Kir2-hämmare ML 133, praktiskt taget avskaffar kapillärinducerade arteriolar dilation, som svar på 10 millimolar Kalium i preparat från både manliga och kvinnliga möss. Vid montering av blodet vesssel, begränsa direkta interaktioner med blodkärlet för att minimera skadan på, och öka livskraften hos kärlet.När blodkärlet har isolerats, olika läkemedelsföreningar kan testas eller blodkärlet kan bearbetas ytterligare för olecular biologi, immunokemi, eller elektrofysiologi studier.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Beredning av akut hippocampus Skivor från råttor och transgena möss för studier av Synaptic Förändringar under åldrandet och Amyloid patologi

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Metoder för studier av Neuronal Morfogenes:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporation i embryonal Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mus bakhjäman<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur att studera Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex vivo optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Implantation av kronisk Silicon sonder och inspelning av hippocampus plats celler i en berikad löpband apparat

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Beredning av akut mänskliga Hippocampus skivor för elektrofysiologiska Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Beredning av råtta ischiasnerv för ex vivo neurofysiologi

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Ex Vivo OCT-baserad multimodal avbildning av mänskliga donatorögon för forskning om åldersrelaterad makuladegeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...