Name: ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Yazarlar, Jules Morin'e el yazması hakkındaki anlayışlı yorumları için teşekkür etmek isterler. Bu araştırma, KAR Amacı Gütmeyen Umut Organizasyonumuz, Kadın Sağlığı ve Araştırma Merkezi ve NHLBI R01HL136636 (FD) tarafından finanse edilmiştir.

Tüm deneyler Colorado Üniversitesi, Anschutz Tıp Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine göre yapıldı.
1. Çözümler
<ol><li>Diseksiyon için MOPS-tamponlu tuzlu kullanın ve numuneleri kullanılmadan önce 4 °C'de tutun. Çözeltiye gaz yapmayın. Aşağıdaki bileşimi ile MOPS tamponlu tuzlu hazırlayın: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2.5 ...

<ol>
	<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+fragile+aspects+of+cortical+blood+flow+in+relation+to+the+underlying+angioarchitecture.">Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+Myogenic+Tone,+and+Vasodilator+Responses+in+Middle+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles:+Effect+of+Ischemia+and+Reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion.</a> Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).</li><li>De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cerebral+Arteries+and+Parenchymal+Arterioles+with+Aging:+Role+of+Rho+Kinase+2+and+Impact+of+Genetic+Background.">Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background.</a> Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).</li><li>Koide, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+KV+channels+in+cerebral+small+vessel+pathologies.">The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies.</a> Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).</li><li>Girouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+endfoot+Ca2++and+BK+channels+determine+both+arteriolar+dilation+and+constriction.">Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).</li><li>Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unitary+TRPV3+channel+Ca2++influx+events+elicit+endothelium-dependent+dilation+of+cerebral+parenchymal+arterioles.">Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles.</a> AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).</li><li>Johnson, A. C., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+hippocampal+arteriole+structure+and+function+in+a+rat+model+of+preeclampsia:+Potential+role+in+impaired+seizure-induced+hyperemia.">Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).</li><li>Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+impairment+in+spontaneously+hypertensive+rats+is+associated+with+hippocampal+hypoperfusion+and+hippocampal+vascular+dysfunction.">Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. , (2019).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Neurovascular+Unit+Coming+of+Age:+A+Journey+through+Neurovascular+Coupling+in+Health+and+Disease.">The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease.</a> Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).</li><li>Roy, C. S., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Regulation+of+the+Blood-supply+of+the+Brain.">On the Regulation of the Blood-supply of the Brain.</a> The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).</li><li>Longden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+K+-sensing+initiates+retrograde+hyperpolarization+to+increase+local+cerebral+blood+flow.">Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+GqPCR+activity+controls+capillary+electrical+signaling+and+brain+blood+flow+through+PIP2+depletion.">Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).</li><li>Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+depletion+promotes+TRPV4+channel+activity+in+mouse+brain+capillary+endothelial+cells.">PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells.</a> eLife. 7, 351 (2018).</li><li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+description+of+membrane+current+and+its+application+to+conduction+and+excitation+in+nerve.">A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve.</a> The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).</li><li>Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+and+microenvironment+of+rat+dorsal+vagal+cells+in+vitro+during+energy+depletion.">Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion.</a> The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).</li><li>Filosa, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+potassium+signaling+couples+neuronal+activity+to+vasodilation+in+the+brain.">Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).</li><li>Attwell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow.">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li><li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+patterns+of+the+rat+hippocampal+formation.">Vascular patterns of the rat hippocampal formation.</a> Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).</li><li>Wang, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+the+K(ir)2+family+of+inward+rectifier+potassium+channels+by+a+small+molecule+probe:+the+discovery,+SAR,+and+pharmacological+characterization+of+ML133.">Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133.</a> ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).</li><li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles.">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li><li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure.">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li><li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus.">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis,+potentially+impacting+cognitive+functions.">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li></ol>

Bu el yazmasında açıklanan basınçlı HiCaPA (hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol) hazırlığı, parenkimal arteriyol29'u izole etmek, basınçlandırmak ve çalışma prosedürümüzün bir uzantısıdır29. Yakın zamanda beyin kapiller endotel hücrelerinde Kir2.1 kanallarının sinirsel aktivasyonile ilişkili [K+]o hissartışları olduğunu ve yukarı yayılan arteriyoles20'yigenişleten bir hiperpolarize sinyal ürettiğini bildirdik. ...

Beyin yüzeyinde pial dolaşım çok çalışmanın nesnesi olmuştur, kısmen deneysel erişilebilirlik nedeniyle. Ancak serebral vaskülatürün topolojisi farklı bölgeler oluşturur. Kan akışını yönlendirmek için önemli kapasite ile anastomozlar açısından zengin sağlam pial ağ aksine, intraserebral parenkimal arterioller (PAs) mevcut sınırlı teminat kaynağı, her biri sinirdokusununayrı bir hacim perfüzyon 1,2. Bu, benzersiz fizyolojik özellikleri ile birlikte3,4,5,6,7,8, intraserebral arterioller serebral kan akımı için önemli bir site yapar kan akışı üzerinde bir darboğaz etkisi oluşturur (CBF) yönetmelik9,10. Izolasyon ve PAs cannülasyonu doğasında teknik zorluklara rağmen, son on yılda basınçlıkaplar 11 ,12,13,14,15,16,17kullanarak ex vivo fonksiyonel çalışmalarda artan bir ilgi gördü. Bu artan ilgi nin nedenlerinden biri nörovasküler kaplin (NVC), beyin fonksiyonel hiperemi18sürdüren mekanizma üzerinde yürütülen önemli araştırma çabasıdır.
Bölgesel olarak, CBF hızla lokal nöral aktivasyon19aşağıdaki artabilir. NVC'yi kontrol eden hücresel mekanizmalar ve sinyal özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak, nöral aktivite algılama ve yukarı arteriyol20,21,22dilate bir hiperpolarize elektrik sinyali içine çevirerek NVC sırasında beyin kılcal damarları için daha önce beklenmedik bir rol tespit . Eylem potansiyelleri23,24 ve astrositik endfeet üzerinde büyük iletkenlik Ca2 +aktive K+ (BK) kanallarının açılması25,26 interstisyel potasyum iyon konsantrasyonu artırmak [K+]o, hangi kılcal damar damar endotel güçlü içe doğrulayıcı K+ (Kir) kanallarının aktivasyonu ile sonuçlanır. Bu kanal harici K+ tarafından değil, aynı zamanda hiperpolarizasyon kendisi tarafından aktive edilir. Boşluk kavşakları ile yayılan, hiperpolarize akım sonra arteriyol kadar komşu kapiller endotel hücrelerinde yeniler, nerede miyosit gevşeme ve CBF artış nedenolur 20,21. Bu mekanizmanın çalışması bize vazoaktif ajanlar ile kapiller stimülasyon sırasında arterioler çapı ölçmek için basınçlı kapiller-parankimal arteriyol (CaPA) hazırlık geliştirmek için yol açtı. CaPA preparat bozulmamış bir kanüle intraserebral arteriyol segmenti oluşur, aşağı kapiller ramification. Kılcal uçlar bir mikropipet ile oda cam alt karşı sıkıştırılır, hangi tıkabasır ve tüm vasküler oluşumu stabilize20,21.
Daha önce fare korteks20,21 ve sıçan amigdala13 ve hipokampus16,17arteriyollerden CaPA preparatları görüntüleyerek enstrümantal yenilikler yaptık. Hipokampal vaskülatür patolojik koşullara yatkınlığı nedeniyle daha fazla dikkat alır gibi, burada fare hipokampus CaPA hazırlık için bir adım adım yöntem sağlamak (HiCaPA) sadece fonksiyonel NVC çalışmalarda değil, aynı zamanda moleküler biyoloji, immünokimya ve elektrofizyoloji kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Syringe Filters</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-0 Nylon (12cm) Black</td>
			<td>Microsurgery Instruments, Inc</td>
			<td>S12-0 NYLON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>B120-69-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &#8212; complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14063-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline Water Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integra&#8482; Miltex&#8482;Tissue Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ML 133 hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS309</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>PS-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PP-83</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study

İnce davranışsal değişikliklerden geç evre demansa kadar, vasküler kognitif bozukluk genellikle serebral iskemi sonrasında gelişir. İnme ve kardiyak arrest son derece cinsel dimorfik hastalıklardır, ve her ikisi de serebral iskemi neden. Ancak, vasküler bilişsel bozukluğu anlamada ilerleme, ve daha sonra cinsiyete özgü tedaviler geliştirme, kısmen fonksiyonel çalışmalarda fare modellerinden beyin mikrosirkülasyon soruşturma zorlukları ile sınırlı olmuştur. Burada, fare beyninden ex vivo hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol (HiCaPA) preparatında kapiller-arteriyol sinyalini incelemek için bir yaklaşım salıyoruz. Kapiller stimülasyona yanıt olarak arterioler çapı ölçmek için mikrosirkülasyonu nasıl izole edebileceğimizi, kanülasyonu nasıl bastırabileceğimizi ve basınçlendirebileceğimizi anlatıyoruz. Biz uygun fonksiyonel kontroller HiCaPA hazırlık bütünlüğünü doğrulamak ve tipik sonuçlar görüntülemek için kullanılabilir göstermek, bir nörovasküler kaplin ajan olarak potasyum test ve Kir2 içe doğrulayan potasyum kanal ailesinin son karakterize inhibitörü etkisi de dahil olmak üzere, ML133. Ayrıca, erkek ve dişi farelerden elde edilen preparatlarda yanıtları karşılaştırıyoruz. Bu veriler fonksiyonel araştırmaları yansıtırken, yaklaşımımız moleküler biyoloji, immünkimya ve elektrofizyoloji çalışmalarında da kullanılabilir.

Endotel küçük iletkenliği (SK) ve ara iletkenlik (IK) Ca2+duyarlı K+ kanalları PA'ların çapı üzerinde dilatrasyon etkisi uygular. Sentetik IK ve SK kanal agonisti olan 1 μM NS309'un banyo uygulaması maksimal genişlemeye neden olur(Şekil 2A,B). Ancak, kapiller endotel hücreleri IK ve SK kanalları eksikliği ve NS30920yanıt olarak hiperpolarize vermedi. Sonuç olarak, fokal basınç...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study at JoVE.com

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Mevcut el yazması, hipokampal arteriyol ve kılcal damarları fare beyninden nasıl izole edilebildiğini ve basınç miyografisi, immünoresans, biyokimya ve moleküler çalışmalar için nasıl basınçlandırılabildiğini ayrıntılarıyla anlatmaktadır.

Fonksiyonel Çalışma için Ex Vivo Basınçlı Hipokampal Kapiller-Parenkimal Arteriyol Hazırlığı

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Yöntemimiz aksi takdirde hipokampus gibi Vivo görüntü zor olurdu yapılarda bulunan kan damarlarının çalışma sağlar. Kan damarları beyin dokusundan çıkarıldığı için, kılcal damarlar ve arteriyol arasındaki sinyal, çevredeki doku üzerinde hedef dışı etkisi olmadan incelenebilir. Hipokampus izole etmek için, fare başının üst kısmında orta hat boyunca deri kesmek ve yanlara deri taşımak için küçük diseksiyon makası kullanın.Kafatasının kaudal tarafında başlayarak, koku ampuller ulaşıncaya kadar orta hat boyunca kafatası kesilmiş ve beyin maruz kalana kadar kafatasının bölümlerini çıkarın. Farenin burun yakın başlayarak, yavaş yavaş koku ampuller, kranial sinirler ve omurilik kesmek için makas kullanarak, beyin kaldırın. Beyni batırın, Ventral tarafı MOPS Tamponlu Tuzlu'da, bir diseksiyon plakasının ortasına, ve plakayı bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.Çanak alt paralel keskin kenar tutarak, tek bir vuruşta uzunlamasına çatlak boyunca beyni ikiye kesmek için jilet kullanın. Orta çizgi aşağı bakacak şekilde plakanın ortasına bir yarımküre yerleştirin ve beyincik ve beyin sapını çıkarmak için enine çatlak boyunca dokuyu düz itin. Medial tarafı yukarı bakacak şekilde yarımküreyi döndürün ve beyni yerinde tutmak için bir spatula kullanın.Corpus callosum altında ikinci bir spatula ucunu yerleştirin, hipokampus talamus kaldırmak için doku altında kepçe, septum, ve hipotalamus. Hipokampus artık serebrumun arka tarafına yakın kavisli bir yapı olarak görülmelidir. Serebrum yerinde tutmak için bir spatula kullanarak, serebrum hipokampus kepçe için ikinci spatula kullanın.Sonra yeni bir diseksiyon plaka sıyrık hippocampi aktarın, taze MOP çözeltisi ile yaklaşık yarım dolu. Hipokampal arter izolasyonu için, örnek hipokampal arter tarafını sabitlemek için bir hipokampusun her iki ucuna küçük iğneler yerleştirin. Çok keskin forceps kullanarak, yavaşça arteriyolçevreleyen doku gevşetmek için hipokampi küçük bölümleri germek.Ve dış enine arterleri tanımlamak için dorsal hipokampal dokuları arayın. Arter bulunduğunda, hipokampus dış enine arter kapmak ve yavaş yavaş arteriyol ve kılcal damarlar toplamak için doku dan çekin. Her hipokampus arter ayrı ayrı kaldırılır.Çıkarılacak başka damar olmadığında, örnekleri buza yerleştirin ve kalan hipokampal dokuyu atın. Arteriollerin kanülasyonu için, kapiller ile biten bir dal ile bulmak ve arteriol ve bir organ odasına arteriol yerleştirin. Kan damarını monte etmek için kanül ucunu hedef alanın altındaki arteriyol duvarından dikkatlice itin.Daha sonra, dikkatle kravat yerleştirmek için yeterli doku olana kadar kanül üzerine damar kaydırın. Kan damarı ve kanül üzerinde uyacak gevşek bir düğüm yapmak için 12-0 naylon dikişler kullanın ve bağları güvenli bir yarım aksaklık düğüm kullanın, kanül arteriol güvenli hale getirmek için düğüm sıkmak için uçları çekin. Kapatmak için arteriyol'un diğer ucuna bir kravat daha bağlayın.Odanın karşı tarafında, kanül noktası arteriol sonunda kravat aşağı pins kadar ikinci bir kanül düşürün. Daha sonra kılcal damarların uçlarını açıkta bırakarak ucu şubenin sonuna yakın bir yere yerleştirerek kılcal damar ı coverslip'e sabitlemek için üçüncü bir kanül kullanın. Beyin mikrosirkülasyonu zarif kırılgan olduğu gibi, arteriyollerin hayatta kalmasını sağlamak için kanülasyon işlemi sırasında damarların germe ve işleme en aza indirmek için emin olun.Basınç miyografi analizi için, odayı kayıt yazılımı ile hafif bir mikroskop aşamasına aktarın ve giriş ve çıkış borularını profüzyon için hazneye bağlayın. Dakikada dört mililitre akış hızında 37 santigrat derece Yapay beyin omurilik sıvısı ile profüzyon başlayın ve bir basınç transdüser ile eşleştirilmiş peristaltik pompa ya basınçlı kanül takın. İç basıncı 20 milimetre Merkür'e getirin ve kayıt yazılımını başlatın.Mümkün olan en net görüntüyü elde etmek için mikroskobu ve görüntü ayarlarını ayarlayın. Ve arteriyol çapı yaklaşık 15-30 mikrometre olup olmadığını kontrol etmek için Kenar Algılama yazılımı kullanın tam olarak genişlemiş olduğunda. Ayarlar optimize edildikten sonra, kayda başlayın ve damardaki damar içi basıncı 40 milimetreci Merkür'e kadar artırın ve edge detection yazılımı ile arteriyol çapını kaydedin.Sonra MOP çözeltisi yıkamak için 15 ila 20 dakika boyunca oda bol. Geminin canlılığını test etmek için, banyo profüzyonu için bir mikromolar NS309 çözeltisi uygulamak, arterioler segment iliklenmeli, gösteren 30-40%myojenik sesi. Arteriyol için temel sesi kurulduktan sonra, bir ucunda ince bir nokta ile kanüller yapmak için bir cam çekmece kullanın, ve her kanül ucu kırmak için forseps kullanın, böylece ilgi ilaç inç kare başına basınç beş kilo ucundan sorunsuz akabilir.Kanülleri ilgi çekici ilaçla doldurun. Ve kanülü mikroskoba bağlı üç eksenli bir mikromanipülatöre yükleyin. Basınç fırlatma sisteminden kanüle boru bağlayın ve yavaşça kapiller yakınındaki banyoiçine kanül aşağı, geminin veya odanın herhangi bir parçası vurmak için dikkat.Kılcal damarları uyarmak için, kapillerin hemen yanındaki kasayı kapağına indirin ve istenilen fırlatma süresiyle basınç çıkarma sistemini etkinleştirin. Uyarım sonunda, daha fazla uyarılma önlemek için biraz kanül yükseltmek. Sadece kılcal damarların uyarıldığını doğrulamak için, yeni kanülü bir mikromolar NS309 çözeltisi ile doldurun ve gösterildiği gibi kılcal damarları uyarın.Daha sonra kalsiyumsuz çözelti ile preparat yıkanarak maksimal vazodilatasyon elde edin. Bir mikromolar NS309 banyo uygulaması endotel kalsiyum duyarlı Potasyum kanalları nedeniyle arteriol yakın maksimal dilatasyon neden olur. Kapiller endotel hücreleri ancak, orta ve küçük iletkenlik kanalları eksikliği ve agonist yanıt olarak hiperpolarize yok, sonuç olarak, uyarıcı kapiller NS309 ile biter, upstream arterioler dilatasyona neden olmaz, Bu NS309 arteriole ulaşmadı gösterir, ve basınç ejeksiyon üzerine uygulanan bileşik sipac kısıtlama erişmek için bir kontrol olarak kullanılabilir.Gösterildiği gibi hipokampal kapiller parenkim parenkar arteriyol preparatının kullanılması, kılcal uçlara 10 milimolar Potasyum ile desteklenen yapay beyin-omurilik sıvısı uygulaması, erkek ve dişi farelerin preparatları arasında farklılık göstermeyen upstream arteriolar genişleme ile sonuçlanır. Ayrıca, Kir2 inhibitörü ML 133 eklenmesi, neredeyse kılcal damar genişlemesi ile ortadan kaldırır, yanıt olarak 10 milimolar Potasyum hem erkek hem de dişi farelerin preparatları. Kan vesssel montaj, zarar en aza indirmek için kan damarı ile doğrudan etkileşimleri sınırlamak, ve damarın canlılığını artırmak.Bir kez kan damarı izole edilmiştir, farklı ilaç bileşikleri test edilebilir veya kan damarı daha fazla oleküler biyoloji, immünkimya, veya elektrofizyoloji çalışmaları için işlenebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Fare Beyin<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

Kronik silikon sondalar ve kayıt bir zenginleştirilmiş koşu bandı aparat Hipokampal yer hücre implantasyonu

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Ex Vivo Nörofizyoloji için Sıçan Siyatik Sinirinin Hazırlanması

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration (Video) | JoVE 

Ex Vivo Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu Araştırmaları için İnsan Donör Gözlerinin OCT Tabanlı Multimodal Görüntülemesi

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...