Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
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这里描述的协议源于森古普塔等人发表的《细胞科学杂志》，132 （6）， jcs222315 （2019）48。这项工作得到了国家卫生研究院的R01GM10092（至S.M.）和AI081077（R.V.S.）的资助，来自印第安纳州临床和转化科学研究所的CTSI-106564（至S.M.）和普渡大学炎症、免疫学和传染病研究所的PI4D-209263（至S.M.）。

1. 细胞培养和转染
<ol><li>种子HEK-293T细胞在直径60毫米或更大的组织培养皿上，在37°C和5%CO2的细胞培养箱中生长到60%~90%的汇合。</li>
	<li>根据制造商的指示，使用转染试剂（参见材料表）使用APEX2标记的哺乳动物表达质粒转染细胞。</li>
	<li>在转染后12~15小时，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞一次。用PBS轻轻清洗，从盘子里去除细胞。如果需要给定的细胞类型，可以使用分?...

此处介绍的 CryoAPEX 协议提供了一种可靠的方法来描述细胞环境中膜蛋白的定位。使用基因编码的APEX2标签不仅提供感兴趣的蛋白质的精确定位，而且使用低温和低温脱水为周围的细胞超结构提供了出色的保存和染色。综合起来，这些方法是一个强大的工具，用于在其亚细胞上下文中高精度地本地化蛋白质。
该方法的症结在于，传统TEM方法制备后超结构损失主要来自脱水步骤?...

生物学研究通常包括解决细胞和细胞器内的亚细胞蛋白定位问题。免疫荧光显微镜提供了一个有用的低分辨率的蛋白质定位视图，和超分辨率成像的最新进展正在推动荧光标记蛋白质1，2，3的分辨率边界。然而，电子显微镜（EM）仍然是成像高分辨率细胞超结构的黄金标准，尽管蛋白质的标记是一个挑战。
从历史上看，一些EM方法被用来处理超结构蛋白质定位问题。最常用的方法之一是免疫电子显微镜（IEM），其中抗原特异性初级抗体用于检测感兴趣的蛋白质。EM信号是由与电子致密粒子结合的二级抗体产生的，最常见的是胶体金4，5。另外，与马萝卜过氧化物酶（HRP）等酶结合的抗体可用于产生电子致密的沉淀物6、7、8。IEM 有两种主要方法，称为预嵌入和嵌入后标记。在预嵌入IEM中，抗体被直接引入细胞，这需要光固定和渗透细胞9，10，11。两个步骤都可能损坏超结构12，13。开发明显更小的抗体，由与1.4nm纳米金结合的抗体Fab片段组成，允许使用非常温和的渗透条件;然而，纳米金太小，不能直接可视化在TEM下，需要额外的增强步骤，成为可见的14，15，16。在嵌入后IEM中，抗体被应用于通过固定、脱水和嵌入树脂17而完全处理的细胞的薄部分。虽然这种方法避免了渗透步骤，但在整个样品制备过程中保持感兴趣的表位是具有挑战性的18，19，20。Tokuyasu 的光固定方法，其次是冷冻、冷冻切片和抗体检测，可提供改进的表位保存21、22。然而，低温超微切除术的技术要求，以及细胞中实现的次优对比度，都是缺点23。
使用基因编码标签消除了IEM在检测感兴趣的蛋白质方面的许多困难。有多种标签可供选择，包括HRP，铁蛋白，ReAsH，miniSOG，和金属洛西宁24，25，26，27，28，29，30，31，32。与以前的方法相比，每个方法都有优点，但每种方法也有阻止广泛使用的缺点。这些缺点包括：在细胞醇中HRP的不活动性，到铁蛋白标签的较大尺寸，ReAsH的光敏性，以及体积小，与金属洛酮的细胞染色缺乏兼容性。最近，一种来自抗坏血素过氧化物酶的蛋白质被设计成EM标签，名为APEX233，34。作为过氧化物酶，APEX2可以催化3，3'二氨基苯甲酸（DAB）的氧化，产生一种沉淀物，与四氧化二铵发生反应，以最小的扩散方式从感兴趣的蛋白质（小于25纳米）33，35提供局部EM对比度。与传统的基于HRP的方法不同，APEX2非常稳定，在所有细胞隔间中保持活跃33。样品可以使用传统的EM样品染色和方法为TEM处理，使周围结构的良好可视化33，34，36。由于其体积小、稳定性和多功能性，APEX2 已成为具有巨大潜力的 EM 标签。
上文讨论的许多方法要么不能或尚未与目前超结构保存、低温冷冻替代的最先进的技术相结合。因此，他们遭受缺乏膜保存和/或细胞染色，以确定准确的蛋白质定位。这必然限制了对可获取数据的解析和解释。高压冷冻（HPF）的冷冻包括高压（±2，100bar）在液氮中快速冷冻样品，导致水性样品的结晶，而不是水样结晶，从而将细胞保留在近原生状态37、38、39。HPF 随后是冷冻替代 （FS），丙酮中的低温 （-90 °C） 脱水与典型的 EM 染色剂（如四氧化二氮和醋酸二铵）结合孵化。与传统的化学固定（一种较长的过程可能导致人工制品）和酒精脱水在室温或冰上（可导致脂质和糖的提取）相比，HPF 和 FS 具有明显的优势，因此最好与最佳 EM 标记相结合，用于蛋白质检测。
HPF/FS 未与 APEX2 标签结合的一个原因是，轻化学固定是过氧化物酶反应的先决条件，从而限制了 DAB 反应产物的扩散。在APEX2研究中，到目前为止，固定和过氧化物酶反应遵循传统的EM方法染色和酒精脱水33，36。然而，已经表明，使用HPF/FS进行化学固定后，在保存方面比传统的化学固定和酒精脱水仅40具有明显的优势。传统TEM样品中超结构完整性的丧失似乎与固定性联系较少，而脱水通常使用酒精在室温或冰上进行，并可能导致脂质和糖的提取40，41。为了开发CryoAPEX方法，我们假设化学固定和过氧化物酶反应，其次是HPF和FS，在超结构保存方面会产生最佳结果。
在这里，我们介绍的cryoAPEX协议，它结合了APEX2标记与低温和冻结替代方法（图1）。这种简单的协议包括APEX2标记的感兴趣蛋白的转染、细胞的化学固定和过氧化物酶反应。然后执行 HPF 和 FS，然后执行典型的树脂嵌入和薄切片。TEM成像显示，该方法对超结构的保存效果非常好。此外，还观察到内质性视网膜（ER）流明蛋白的高分辨率亚细胞定位和空间分布。该方法对于检测细胞内膜蛋白定位进行电子显微镜分析具有广泛应用能力。在我们的手中，该方法已经成功地适用于组织培养中生长的各种细胞系，包括HEK-293T（人类胚胎肾）、HeLa（人类宫颈癌）、Cos7（非洲绿猴肾成纤维细胞）和BHK（婴儿仓鼠肾）。详细说明如下，使用HEK-293T细胞。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

信号转导和膜贩运等关键细胞事件依赖于细胞隔间内适当的蛋白质位置。因此，了解蛋白质的精确亚细胞定位对于回答许多生物学问题非常重要。寻求一个可靠的标签来识别蛋白质的定位，结合足够的细胞保存和染色，在历史上一直具有挑战性。电子显微镜（EM）成像的最新进展导致许多方法和策略的发展，以增加细胞保存和标签目标蛋白。一个相对较新的基于过氧化物酶的基因标记APEX2是可克隆的EM活性标签中一个有前途的领导者。近年来，随着高压冷冻（HPF）和低温脱水和通过冷冻替代（FS）染色的低温化的出现，传输电子显微镜（TEM）的样品制备也有所进步。HPF 和 FS 为 TEM 成像提供了出色的细胞超结构保存，仅次于对葡萄样品的直接低温成像。在这里，我们提出了一个用于cryoAPEX方法的协议，该方法将APEX2标签的使用与HPF和FS相结合。在此协议中，感兴趣的蛋白质被标记为APEX2，然后是化学固定和过氧化物酶反应。代替传统的染色和酒精脱水在室温下，样品是冷冻的，并通过FS在低温下进行脱水和染色。使用cryoAPEX，不仅可以在亚细胞腔内识别感兴趣的蛋白质，还可以解决结构保存膜内有关其拓扑的其他信息。我们表明，该方法可以提供足够高的分辨率，以破译细胞器流明内的蛋白质分布模式，并区分一个细胞器内蛋白质在靠近其他未标记的细胞器的分割。此外，低温APEX在程序上简单明了，适合在组织培养中生长的细胞。它在技术上没有比典型的低温和冷冻替代方法更具挑战性。CryoAPEX 广泛适用于任何可基因标记的膜蛋白的 TEM 分析。

为了将使用cryoAPEX方法的超结构保存与传统固定和脱水进行比较，我们制备了样品，其中内质视网膜膜（ERM;ER膜）肽被APEX2标记并转染成HEK-293T细胞。ERM-APEX2 对 ER 的细胞质面进行本地化，并将 ER 结构重塑为形态上截然不同的结构，称为组织平滑 ER （OSER） 34、42、43 。OSER 形态包括光滑、平行、密集堆叠膜的区域，这些膜是比较...

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The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

该协议描述了CryoAPEX方法，其中APEX2标记膜蛋白可以通过传输电子显微镜在最佳保存的细胞超结构内进行局部化。

超结构保存细胞内膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

这种方法结合了膜蛋白染色的能力，同时保留了膜的完整性和亚细胞结构。因此，它对于精确定位膜相关蛋白非常强大。该技术的主要优点是，它结合了使用强大的基因可克隆标签，APEX2，与最先进的方法在细胞保存电子显微镜，包括冷冻修复和冷冻替代。总之，这些允许在保存完好的细胞内精确定位蛋白质。该协议可用于剖析病毒在宿主细胞内复制的机制。病毒通常会在感染过程中劫持宿主蛋白质。病毒是小基因组，它们利用这些宿主细胞内部复制。最近，我们已经能够在未发布的数据中，利用这种技术标记这些蛋白质，以了解病毒是如何复制的。这项技术在最近一项有关细菌毒素的合作研究中被证明是非常关键的，这种研究会导致高尔吉分解。使用低温APEX，我们能够精确定位毒素与碎片的戈尔吉片，这是很难看到，否则使用正常的免疫荧光技术。展示这项技术的将是伊莱恩·米赫尔克，一个研究生，和研究员，斯蒂芬妮·安吉尔，从我们的实验室。在培养皿中播种 HEK293 细胞后，使用 APEX2 标记哺乳动物表达质粒的细胞根据制造商的指示使用转染试剂转染细胞。转染后12-15小时，用PBS清洗细胞一次。然后，用PBS将细胞从培养皿中洗入15毫升的圆锥管中。以 500 x g 离心五分钟。小心地去除上流剂，并在室温下在 pH 7.4 下将颗粒重新悬浮在两毫升的 2%谷胱甘肽和 0.1 摩尔钠二甲酸酯缓冲液中。将样品放在冰上孵育30分钟。然后，在 4 摄氏度下以 500 x g 的样品对样品进行 5 分钟。在4摄氏度下离心，用两毫升0.1摩尔钠二甲酸酯缓冲液将颗粒清洗5分钟。。离心后，取出上经剂。要进行过氧化物酶反应，在 DAB 溶液中重新悬浮三毫升，然后以 500 x g 的颗粒进行 5 分钟，清洗颗粒。然后，用5.88毫摩尔过氧化氢将颗粒重新悬浮在DAB溶液的三毫升中。在室温下孵育30分钟。颗粒明显变成棕色，表明存在不溶性DAB反应产品。根据手稿，在DMEM中再次用仙人掌钠缓冲液清洗后，将含有10%胎儿牛血清和15%牛血清白蛋白的DMEM低温保护溶液的500微升中的细胞颗粒重新悬浮。将细胞悬浮液转移到0.5毫升微离心管。再次丸，稍微提高离心机速度从500x g。丢弃大部分上清液，确保留下足够的液体，使颗粒不会干涸。使用实验室抹布或纸巾的一角，将细胞颗粒中剩余的液体吸走。让足够的液体保持，颗粒形成一个糊状物，在一致性上类似于牙膏。吸气细胞颗粒的两到三微升，并沉积到膜载体上。完全填充膜托架的孔，使表面张力在顶部产生轻微的圆顶。将膜托架滑入墨盒并固定。将墨盒放入已准备和加底的 HPF 机器中，然后按开始冻结。使墨盒浸入液氮中，从墨盒中取出膜托架。放入塑料胶囊中，将塑料胶囊放入充满液氮的克里夫。在化学罩中，在克里维亚尔的丙酮中，用量坦酸和5%DI水制备溶液溶液中0.2%重量的毫升。将它们放入液氮中冻结。将冷冻替代混合物一个小瓶和含有冷冻细胞颗粒的冷冻体放入冷冻替换单元样品室。将含有膜载体的内胶囊从液氮小瓶转移到包含冷冻替代混合物的相应小瓶中。在 90 摄氏度下启动冻结替换协议。24小时后，暂停冷冻替代，用已冷却到90摄氏度的丙酮洗样品三次，5分钟。接下来，在化学罩中，制备每样品1毫升的甲氧二氧化氮、0.2%醋酸尿碱和5%DI水，在Cylial中用丙酮进行，并把它们放在液氮中进行冷冻。将冷冻替代混合物中的冷冻液放入冷冻替代单元中，将胶囊从第三丙酮洗涤转移到冷冻替代混合物两瓶中。孵育它们，并在90摄氏度下冷冻22小时，随后在12-18小时内逐渐升温至零摄氏度。将温度保持在零摄氏度，并将预冷丙酮加入小瓶中，每次清洗三次，每次10分钟。根据制造商的指示，在塑料烧杯中准备选择树脂的树脂混合物，并将 2%4% 和 8% 的树脂加入小瓶中，以浸入胶囊。在零摄氏度下各孵育两小时。然后，在室温下，在15%30%60%和100%树脂成分的 A、B 和 D 中孵育仅四小时。20小时后，准备树脂成分 A、B、C 和 D 的混合物，孵育 4 小时。将具有细胞颗粒侧的膜载体向上放入扁平嵌入模具中，并填充树脂混合物 A、B、C 和 D。将它们放入烤箱中，在 60 摄氏度下聚合 24-36 小时。聚合后，从模具中取出块，将样品放在超微原子的垂直夹头中，在那里可以放大图像。将膜载体与块分离，将膜载体上的液氮混合在一起，将金属与塑料分离，并使用剃刀刀片将膜载体周围的树脂切开。分离时，轻轻抬起膜载体，将细胞颗粒圆顶留在块的面上。将外露细胞颗粒朝上放置到比第一个模具稍深的扁平嵌入模具中，并在 60 摄氏度下填充树脂成分 A、B、C 和 D。使用剃须刀刀片修剪细胞颗粒周围的块。然后将块放在超微原子的切块臂上的样品夹头中。使用玻璃或金刚石刀，将方块修剪成紧围绕细胞颗粒的梯形形状。使用玻璃或金刚石刀获得 90 纳米超薄的细胞颗粒部分。选取 TEM 网格上的节带。通过将边缘印在一张滤纸上并将其存储在 TEM 网格存储盒中来干燥网格。将网格安装在 TEM 支架上，然后将支架放入显微镜中。使用 80 千伏的 Tecnai T12 筛选低温APEX样品。使用 APEX2 标签获取感兴趣的细胞和亚细胞结构的图像。在这项研究中，用传统的APEX方法制备样品，可以明确标记有组织、光滑的内质性内质结构。在高放大率下，堆叠膜出现褶皱，同心膜密度之间存在不均匀的间隙，表明膜保存不良和脂质提取。CryoAPEX制备的样品也有明确定义的标签，有组织，光滑的内质膜结构，但是，膜是光滑和平行的，很少或没有脂质提取看到。TEM对90纳米薄部分的分析表明，亨廷顿酵母相互作用蛋白E存在于周围内质神经和核包络中。此外，亨廷顿酵母相互作用蛋白E密度被分解成沿发光内质膜的定期空间的foci。亨廷顿酵母相互作用的蛋白质E分布和foci也可见于用传统固定和脱水制备的样品中。然而，存在广泛的膜破坏和提取，使样品次优。APEX2 标记使用三个细胞标记进行，其中线托-V5-APEX2 仅提供线粒体的特定染色，CAAX-APEX2 仅产生对等离子膜的明显染色。在细胞内细胞器中未观察到任何标记。戈尔吉流明的染色也评估使用阿尔法 MAN2-APEX2 标记，如我们原来的 Sengupta 等人手稿所述。按照此过程，可以执行三维方法，如电子断层扫描或聚焦离子束扫描电子显微镜，以研究感兴趣的蛋白质的三维分布。本议定书中使用的许多化学品都是有毒的，因此在使用前应查阅安全数据表，以确保使用适当的个人防护设备处理这些化学品，并按照机构准则进行处置。

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

纳米有限元分析：蛋白质定位的光激活定位显微镜和电子显微镜

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

科研

生物学

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

一个标准化的方法肝窦内皮细胞的分析及其窗孔用扫描电子显微镜

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

通过低温扫描电子显微镜研究光合膜内冻结，割断叶片组织的超分子组织

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Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

线粒体钙和线粒体膜的同时测量通过荧光显微镜活细胞的潜在

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

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活体哺乳动物细胞器中单膜蛋白的多色定位显微术

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

高压冷冻、微波辅助对比度增强和最小树脂嵌入在体积成像中的生物样品制备

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Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

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