Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

Den protokol, der er beskrevet her, stammer fra en publikation af Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dette arbejde understøttes af tilskud R01GM10092 (til SM) og AI081077 (R.V.S.) fra National Institutes of Health, CTSI-106564 (til S.M.) fra Indiana Clinical and Translational Sciences Institute og PI4D-209263 (til SM) fra Purdue University Institute for Inflammation, Immunologi og infektiøs sygdom.

1. Cellekultur og omladning
<ol><li>Frø HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller større væv kultur parabol og vokse til 60% -90% sammenløb i en celle kultur inkubator ved 37 °C og 5% CO2.</li>
	<li>Transfect celler med APEX2-mærkede pattedyr udtryk plasmider ved hjælp af transfektionsreagens (se Tabel over materialer)i henhold til producentens anvisninger.</li>
	<li>Ved 12-15 timer efter omladning en gang med fosfat buffered saltvand (PBS). Fjern celler fra skålen ved skånsom vas...

Den cryoAPEX protokol præsenteres her giver en robust metode til at karakterisere lokaliseringen af membran proteiner i cellulære miljø. Ikke alene giver brugen af et genetisk kodet APEX2-tag præcis lokalisering af et protein af interesse, men brugen af kryoixation og lavtemperaturdehydrering giver fremragende bevarelse og farvning af den omgivende cellulære ultrastruktur. Kombineret er disse tilgange et kraftfuldt værktøj til lokalisering af et protein med høj præcision i sin undercellulære kontekst.
<p cl...

Biologiske undersøgelser omfatter ofte spørgsmål om løsning af subcellulær proteinlokalisering i celler og organeller. Immunfluorescensmikroskopi giver en nyttig lav opløsning opfattelse af protein lokalisering, og de seneste fremskridt i super-opløsning imaging skubber grænserne for opløsning for fluorescerende mærkede proteiner1,2,3. Men elektronmikroskopi (EM) forbliver guldstandarden for billeddannelse cellulære ultrastruktur med høj opløsning, selv om mærkning af proteiner er en udfordring.
Historisk set er flere EM-metoder blevet anvendt til at behandle spørgsmål om ultrastrukturel proteinlokalisering. En af de mest almindeligt anvendte metoder er immunelektronmikroskopi (IEM), hvor antigen-specifikke primære antistoffer bruges til at detektere protein af interesse. EM-signalet genereres ved anvendelse af sekundære antistoffer konjugeret med elektrontætte partikler, oftest kolloidguld4,5. Alternativt kan antistoffer konjugeret med enzymer som hesteradisk peroxidase (HRP) anvendes til at producere en elektrontæt bundfald6,7,8. Der findes to hovedtilgange til IEM, der kaldes forindlejring og postintegreringsmærkning. Ved præintegrering i IEM indføres antistoffer direkte i celler, hvilket kræver lysfiksering og permeabilisering af cellerne9,10,11. Begge trin kan beskadige ultrastruktur12,13. Udvikling af betydeligt mindre antistoffer bestående af et antistof Fab fragment konjugeret med 1,4 nm nanoguld tillader meget blid permeabilisering betingelser, der skal anvendes; Nanoguld er dog for lille til direkte visualisering under TEM og kræver yderligere forbedringstrin for at blive synlige14,15,16. Ved post-indlejring IEM anvendes antistoffer på tynde dele af celler, som er blevet fuldt behandlet ved fiksering, dehydrering og indlejring i harpiks17. Selv om denne fremgangsmåde undgår gennemtrængelighedstrinnet, er det en udfordring at bevare interesseepicentret under hele prøveforberedelsen18,19,20. Tokuyasu-metoden til lysfiksering efterfulgt af frysning, kryo-skæring og antistofdetektion giver forbedret epitopkonservering21,22. Men de tekniske krav til kryo-ultramikrotomi, samt den sub-optimale kontrast opnået i cellen, er ulemper23.
Brugen af genetisk kodede tags eliminerer mange af de vanskeligheder, iiem i forbindelse med påvisning af protein af interesse. En række tags er tilgængelige, herunder HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG, og metallothionin24,25,26,27,28,29,30,31,32. Hver af disse har fordele i forhold til tidligere metoder, men hver har også ulemper, der forhindrer udbredt brug. Disse ulemper spænder fra inaktivitet af HRP i cytosol til den store størrelse af ferritin tag, lys følsomhed ReAsH, og lille størrelse og manglende kompatibilitet med cellulære farvning af metallothionin. For nylig, et protein fremstillet af ascorbat peroxidase er blevet manipuleret som en EM-tag, opkaldt APEX233,34. Som peroxidase kan APEX2 katalysere oxidationen af 3,3' diaminobenzidin (DAB), der producerer en bundfald, der reagerer med osmiumtetroxid for at give lokal EM-kontrast med minimal diffusion fra proteinaf interesse (mindre end 25 nm)33,35. I modsætning til traditionelle HRP-baserede metoder er APEX2 ekstremt stabil og forbliver aktiv i alle cellerum33. Prøver kan forarbejdes for TEM ved hjælp af traditionel EM-prøvefarvning og metoder , der giver mulighed for god visualisering af de omkringliggende konstruktioner33,34,36. På grund af sin lille størrelse, stabilitet og alsidighed, apex2 har vist sig som en EM tag med stort potentiale.
Mange af de tilgange, der er beskrevet ovenfor, kan enten ikke kombineres med den aktuelle tekniske situation inden for ultrastrukturel konservering, kryoviation og frysesubstitution ved lav temperatur. Således lider de af mangel på membran konservering og / eller celle farvning at bestemme nøjagtig protein lokalisering. Dette begrænser nødvendigvis opløsningen og fortolkningen af de data, der kan indhentes. Kryofixation ved højtryksfrysning (HPF) indebærer hurtig frysning af prøver i flydende nitrogen ved et højt tryk (~ 2.100 bar), som forårsager vitrification snarere end krystallisering af vandige prøver, og dermed bevare celler i en næsten hjemmehørende tilstand37,38,39. HPF efterfølges af frysesubstitution (FS), en lav temperatur (-90 °C) dehydrering i acetone kombineret med inkubation med typiske EM-pletter såsom osmiumtetroxid og uranylacetat. HPF og FS giver tilsammen en klar fordel i forhold til traditionel kemisk fiksering (en længere proces, der kan føre til artefakter) og alkoholdehydrering ved stuetemperatur eller is (hvilket kan føre til udvinding af lipider og sukker), og derfor er ønskeligt at kombinere med de bedste EM-tags til påvisning af protein.
En af grundene til, at HPF/FS ikke er blevet kombineret med APEX2-mærkning, er, at lyskemisk fiksering er en forudsætning for peroxidasereaktionen, hvilket begrænser udbredelsen af DAB-reaktionsproduktet. I APEX2-undersøgelser indtil videre efterfølges fiksering og peroxidasereaktion af traditionelle EM-metoder til farvning og alkoholdehydrering33,36. Det er imidlertid blevet påvist, at efter kemisk fiksering med HPF/FS giver en klar fordel i konserveringen i forhold til traditionel kemisk fiksering og alkoholdehydrering alene40. Tabet af ultrastrukturel integritet, der ses i traditionelle TEM-prøver, synes mindre forbundet med fiksering end til dehydrering, hvilket typisk sker ved hjælp af alkohol ved stuetemperatur eller is, og kan føre til ekstraktion af lipider og sukker40,41. For at udvikle cryoAPEX-metoden antager vi, at kemisk fiksering og peroxidasereaktion efterfulgt af HPF og FS ville give et optimalt resultat med hensyn til ultrastrukturel konservering.
Her præsenterer vi cryoAPEX-protokollen, som kombinerer APEX2-mærkning med kryopræks- og frysesubstitutionsmetoder (figur 1). Denne enkle protokol består af omladning af et APEX2-mærket protein af interesse, kemisk fiksering af celler og peroxidasereaktionen. HPF og FS udføres derefter efterfulgt af typisk harpiksintegrering og tynd skæring. TEM imaging afslører fremragende bevarelse af ultrastruktur ved hjælp af denne metode. Derudover blev der observeret højopløsningssubcellulær lokalisering og rumlig fordeling af et endoplasmisk retikulum (ER) lumenalprotein. Denne metode er meget nyttig til påvisning af membranproteinlokalisering i celler til elektronmikroskopianalyse. I vores hænder har metoden fungeret med succes for en række cellelinjer dyrket i vævkultur, herunder HEK-293T (human embryonal nyre), HeLa (human livmoderhalskræft), Cos7 (afrikansk grøn abe nyre fibroblast), og BHK (baby hamster nyre). Detaljerede instruktioner er beskrevet nedenfor ved hjælp af HEK-293T celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Vigtige cellulære begivenheder som signaltransduktion og membranhandel er afhængige af korrekt proteinplacering i cellulære rum. Forståelse af præcis subcellulær lokalisering af proteiner er derfor vigtigt for at besvare mange biologiske spørgsmål. Jagten på en robust etiket til at identificere protein lokalisering kombineret med tilstrækkelig cellulær bevarelse og farvning har været historisk udfordrende. Nylige fremskridt inden for elektronmikroskopi (EM) billeddannelse har ført til udvikling af mange metoder og strategier til at øge cellulære bevarelse og etiket mål proteiner. En forholdsvis ny peroxidase-baserede genetiske tag, APEX2, er en lovende leder i klonelige EM-aktive tags. Prøveforberedelse til mikromikroskopi af transmissionselektron (TEM) er også udviklet i de senere år med fremkomsten af kryofixation ved højtryksfrysning (HPF) og lavtemperaturdehydrering og farvning via frysesubstitution (FS). HPF og FS giver fremragende bevarelse af cellulære ultrastruktur til TEM-billeddannelse, kun overgået af direkte kryo-billeddannelse af glasagtige prøver. Her præsenterer vi en protokol for cryoAPEX-metoden, som kombinerer brugen af APEX2-mærket med HPF og FS. I denne protokol mærkes et protein af interesse med APEX2, efterfulgt af kemisk fiksering og peroxidasereaktionen. I stedet for traditionel farvning og alkoholdehydrering ved stuetemperatur kryofikser prøven og gennemgår dehydrering og farvning ved lav temperatur via FS. Ved hjælp af cryoAPEX kan et protein af interesse ikke identificeres i subcellulære rum, men også yderligere oplysninger kan løses med hensyn til dets topologi i en strukturelt bevaret membran. Vi viser, at denne metode kan give høj nok opløsning til at dechifrere proteinfordelingsmønstre i et organellelumen og til at skelne mellem opdelingen af et protein i en organelle i nærheden af andre umærkede organeller. Desuden er cryoAPEX proceduremæssigt ligetil og modtagelig for celler dyrket i vævskultur. Det er ikke mere teknisk udfordrende end typiskkrofixation og frysesubstitutionsmetoder. CryoAPEX er almindeligt anvendelig for TEM analyse af enhver membran protein, der kan genetisk mærkes.

For at sammenligne den ultrastrukturelle konservering ved hjælp af cryoAPEX-metoden med traditionel fiksering og dehydrering udarbejdede vi prøver, hvor en endoplasmisk reticulummembran (ERM; ER membran) peptid blev mærket med APEX2 og transfected i HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserer til erens cytoplasmatiske ansigt og ommodellerer ER-strukturen til morfologisk adskilte strukturer kendt som organiseret smooth ER (OSER)34,42,43<...

Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Denne protokol beskriver cryoAPEX-metoden, hvor et APEX2-mærket membranprotein kan lokaliseres ved transmissionselektronmikroskopi i optimalt bevaret celleultrastruktur.

CryoAPEX-metoden til elektronmikroskopianalyse af membranproteinlokalisering i ultrastrukturelt bevarede celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Denne metode kombinerer evnen til at plette for en membran protein og samtidig bevare membran integritet og subcellulær arkitektur. Så det er virkelig kraftfuld til præcist at lokalisere en membran associeret protein. Den største fordel ved denne teknik er, at det kombinerer brugen af en robust genetisk klonbare tag, APEX2, med state of the art metoder i cellulære bevarelse for elektronmikroskopi, herunder kryofiksering og fryse substitution.Tilsammen tillader disse præcis protein lokalisering i en velbevaret celle. Denne protokol kan bruges til at dissekere mekanismer, hvorefter virus replikerer inde i værtscellen. Vira ofte vil kapre vært proteiner under deres infektion ordning.Vira er de små genomer, som de udnytter til at replikere inde i disse værtsceller. For nylig har vi været i stand til i ikke-offentliggjorte data, mærke disse proteiner ved hjælp af denne teknologi til at forstå, hvordan virus replikere. Denne teknik viste sig virkelig kritisk i en nylig kollaborativ undersøgelse af en bakteriel toksin, der forårsager golgi opdeling.Ved hjælp af cryoAPEX, vi var i stand til præcist lokalisere toksinet med de fragmenterede golgi stykker, noget, der var virkelig svært at se ellers ved hjælp af normale immunfluorescens teknikker. Demonstrere denne teknik vil være Elaine Mihelc, en kandidat studerende, og forskning associeret, Stephanie Angel, fra vores laboratorier. Efter såning HEK293 celler i fadet, transfect cellerne med APEX2 mærkede pattedyr udtryk plasmider ved hjælp af transfektion reagens i henhold til producentens anvisninger.Ved 12-15 timer efter transfektion vaskes cellerne én gang med PBS. Derefter vaskes cellerne med PBS fra skålen i et 15 milliliter konisk rør. Centrifuge ved 500 x g i fem minutter.Fjern forsigtigt supernatanten, og pellets skal igen suspenderes i to milliliter 2%glutaraldehyd og 0,1 molarnatrium cacodylate buffer ved pH 7.4 ved stuetemperatur. Prøven anbringes på is for at inkubere i 30 minutter. Derefter pellet prøven ved 500 x g i fem minutter ved fire grader Celsius.Pellet tre gange i fem minutter hver med to milliliter 0,1 molar natrium cacodylate buffer ved centrifugering ved fire grader Celsius. Efter centrifugering fjernes supernatanten. Peroxidasereaktionen vaskes ved at udsætte pelletet igen i tre milliliter DAB-opløsning efterfulgt af pelletering ved 500 x g i fem minutter.Derefter re-suspendere pellet i tre milliliter DAB opløsning med 5,88 millimolar hydrogenperoxid. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. Pellet bliver synligt brun-farvet, hvilket indikerer tilstedeværelsen af det uopløselige DAB reaktionsprodukt.Efter vask igen med natrium cacodylate buffer i DMEM, ifølge manuskriptet, re-suspendere celle pellet i 500 mikroliter af en kryobeskyttende opløsning af DMEM indeholder 10% føtal kvæg serum og 15% kvæg serum albumin. Cellesuspension overføres til et mikrocentrifugerør på 0,5 milliliter. Pellet igen, lidt øge centrifuge hastighed fra 500 x g.Kassér størstedelen af supernatanten, så der er tilstrækkelig væske tilbage, så pellet ikke tørres ud. Væge væk resterende væske fra cellen pellet ved hjælp af hjørnet af et laboratorium tørre eller køkkenrulle. Lad nok væske forblive, at pellet danner en pasta, svarende i konsistens til tandpasta.Aspirere to til tre mikroliter af cellepellet og aflejr det på en membranholder. Fyld membranebærerens brønd helt, så overfladespændingen skaber en lille kuppel på toppen. Skub membranholderen ind i patronen og fastgør den.Placer patronen i den HPF-maskine, der er blevet klargjort og klargjort, og tryk på startstoppet. Hold patronerne nedsænket i flydende nitrogen, fjern membranholderen fra patronen. Placer i en plastik kapsel og læg plast kapsel i en Cryovial fuld af flydende nitrogen.I en kemisk hætte tilberedes en milliliter pr. prøve af opløsningen på 0,2 % vægt i volumen tannsyre og 5% DI vand i acetone i et kryovialt. Læg dem i flydende nitrogen til at fryse. Fastfrysningssubstitutionsblandingen anbringes i et hætteglas og cryovials, der indeholder de frosne cellepiller, i prøvekammeret for indefrysningssubstitueringsenheder.Overfør den indvendige kapsel, der indeholder membranbæreren, fra det flydende nitrogenhætteglas i det tilsvarende hætteglas, der indeholder frysesubstitutionsblanding. Start en fryse substitution protokol ved 90 grader Celsius. Efter 24 timer, pause fryse substitution og vask prøverne tre gange i fem minutter med acetone, der er blevet afkølet til 90 grader Celsius.Dernæst i en kemisk hætte, forberede en milliliter pr prøve af en opløsning på 1%osmium tetroxid, 0,2% uranylacetat, og 5% DI vand i acetone i en Cryovial og læg dem i flydende nitrogen til at fryse. Cryovials med frysesubstitutionsblandingen to i frysesubstitutionsenheden og overfør kapslerne fra den tredje acetonevask til frysesubstitutionsblandingen to hætteglas. Inkuber dem og fryse substitution mix to i 72 timer ved 90 grader Celsius, efterfulgt af gradvis opvarmning til nul grader Celsius over 12-18 timer.Hold temperaturen på nul grader Celsius og tilsæt forkølet acetone i hætteglassene for at vaske tre gange i 10 minutter hver. Forbered en harpiks blanding af valg i en plastbæger i henhold til producentens anvisninger og tilsæt 2%4% og 8% af harpiks i hætteglassene for at nedsænke kapslerne. Inkubere i to timer hver ved nul grader Celsius.Derefter inkuberes i 15%30%60%90% og 100% harpiks komponenter af A, B og D kun i fire timer hver ved stuetemperatur. Efter de 20 timer, forberede en blanding af harpiks komponenter A, B, C og D og inkubere i fire timer. Placer membran luftfartsselskaber med celle pellet side op i flade indlejring forme og fyld med harpiks blanding A, B, C, og D.Placer dem i en ovn til polymerisere ved 60 grader Celsius i 24-36 timer.Efter polymerisering, fjerne blokke fra formen og placere prøven i den lodrette chuck af ultra mikrotom, hvor det kan visualiseres med forstørrelse. Adskil membranholderen fra blokken ved hjælp af en kombination af duppende flydende nitrogen på membranbæreren for at adskille metallet fra plasten og bruge et barberblad til at spåne harpiksen omkring membranbæreren. Når adskilt, forsigtigt løfte væk membranen luftfartsselskab, forlader celle pellet kuppel på forsiden af blokken.Placer blokken med den eksponerede celle pellet vender opad i en flad indlejring skimmel, der er lidt dybere end den første form og fyld med harpiks komponenter A, B, C, og D.Polymerize ved 60 grader Celsius i 24-36 timer. Trim blokken omkring cellen pellet ved hjælp af et barberblad. Anbring derefter blokken i prøvepatronen på den nde arm af en ultramikrotom.Ved hjælp af et glas eller diamant kniv, trimme blokken i en trapezformet form tæt omkring celle pellet. Få 90 nanometer ultra tynde dele af cellen pellet ved hjælp af et glas eller diamant kniv. Afhente et bånd af sektioner på et TEM-gitter.Tør gitteret ved at blotting kanten på et stykke filterpapir og gemme det i en TEM gitter opbevaringsboks. Monter gitteret på TEM-holderen, og placer holderen i mikroskopet. Brug en Tecnai T12 ved 80 kilovolts til screening af kryoAPEX-prøver.Anskære billeder af celler og delcellulære strukturer af interesse med APEX2 mærkning. I denne undersøgelse resulterede præparatet af prøven efter traditionelle APEX-metoder i klar mærkning af organiserede, glatte endoplasmatiske reticulumstrukturer. Ved høj forstørrelse syntes de stablede membraner pjusket og ikke-ensartede huller var til stede mellem koncentriske membrantætheder, hvilket indikerer dårlig membrankonservering og lipidekstraktion.Prøven fremstillet af cryoAPEX havde også klart defineret mærkning af organiserede, glatte endoplasmatiske reticulum strukturer, men membranerne var glatte og parallelle og lidt at ingen lipid ekstraktion blev set. TEM-analyse af 90 nanometertynde sektioner viste, at Huntington gær interagerende protein E var til stede i hele den perifere endoplasiske reticulum samt den nukleare kuvert. Derudover blev Huntington gær interagerende protein E tæthed løst i regelmæssigt afstand foci langs den luminale endoplasmatiske reticulum membran.Huntington gær interagerende protein E distribution og foci var også synlige i en prøve tilberedt med traditionel fiksering og dehydrering. Der var imidlertid omfattende membranforstyrrelser og ekstraktion til stede, hvilket gjorde prøven suboptimale. APEX2 mærkning blev udført ved hjælp af tre cellulære markører, hvoraf mito-V5-APEX2 forudsat specifik farvning af mitokondrier alene og CAAX-APEX2 produceret særskilt farvning af plasmamembranen alene.Der blev ikke observeret mærkning hos intracellulære organeller. Farvning for golgi lumen blev også vurderet ved hjælp af en Alpha MAN2-APEX2 markør som beskrevet i vores oprindelige Sengupta et al manuskript. Efter denne procedure kan der udføres tredimensionale metoder såsom elektrontomografi eller fokuseret ionstrålescanning elektronmikroskopi for at undersøge 3D-fordelingen af et protein af interesse.Mange af de kemikalier, der anvendes i denne protokol, er giftige, så før brug bør sikkerhedsdatablade konsulteres for at sikre, at kemikalierne håndteres ved hjælp af korrekt personlige værnemidler og bortskaffes i henhold til institutionelle retningslinjer.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Localization brug af foto-aktiverede Localization mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønt fluorescerende protein-baserede Expression Screening membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardiseret metode til analyse af Liver Sinusformet endotelceller og deres fenestrationer af Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Undersøgelse af Supramolekylær Organisationen af ​​photosynthetic Membraner inden Freeze-brækkede Leaf Væv af Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig måling af Mitokondriel Calcium og mitokondriemembranen Potentiale i levende celler ved Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Multi-farve lokalisering mikroskopi af enkelt Membranproteiner i organeller af levende pattedyrceller

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Kryo-elektron mikroskopisk gitter forberedelse til tid-løste undersøgelser ved hjælp af en ny robot system, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategier for optimering af kryogene Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Billeddannelse af repliktive domæner i ultrastrukturralt bevaret kromatin ved elektrontomografi

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...