Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

Le protocole décrit ici découle d’une publication de Sengupta et coll., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Ce travail est soutenu par des subventions R01GM10092 (à S.M.) et AI081077 (R.V.S.) des National Institutes of Health, CTSI-106564 (à S.M.) de l’Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, et PI4D-209263 (à S.M.) du National Institute for Inflammation, Immunology et Infectious Disease.

1. Culture cellulaire et transfection
<ol><li>Seed HEK-293T cellules sur un 60 mm de diamètre ou plus grand plat de culture tissulaire et de croître à 60%-90% confluence dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5% CO2.</li>
	<li>Cellules transfect avec plasmides d’expression de mammifères APEX2-marqués utilisant le réactif de transfection (voir tableau des matériaux) selon les directives du fabricant.</li>
	<li>À 12 à 15 heures après la transfection, laver les cellule...

Le protocole cryoAPEX présenté ici fournit une méthode robuste pour caractériser la localisation des protéines membranaires dans l’environnement cellulaire. Non seulement l’utilisation d’une étiquette APEX2 codée génétiquement permet-elle une localisation précise d’une protéine d’intérêt, mais l’utilisation de la cryofixation et de la déshydratation à basse température offre une excellente conservation et la coloration de l’ultrastructure cellulaire environnante. Combinées, ces approches so...

Les études biologiques incluent souvent des questions de résolution de la localisation subcellulaire des protéines dans les cellules et les organites. La microscopie d’immunofluorescence fournit une vue utile à basse résolution de la localisation des protéines, et les progrès récents dans l’imagerie de super-résolution repoussent les limites de la résolution pour les protéines fluorescentes étiquetées1,2,3. Cependant, la microscopie électronique (EM) demeure l’étalon-or de l’imagerie de l’ultrastructure cellulaire à haute résolution, bien que l’étiquetage des protéines soit un défi.
Historiquement, plusieurs méthodes EM ont été utilisées pour aborder les questions de localisation des protéines ultrastructurales. L’une des méthodes les plus couramment utilisées est la microscopie immunoélectronique (IEM), où des anticorps primaires spécifiques à l’antigène sont utilisés pour détecter la protéine d’intérêt. Le signal EM est généré par l’application d’anticorps secondaires conjugués à des particules denses en électrons, le plus souvent l’or colloïdal4,5. Alternativement, les anticorps conjugués avec des enzymes telles que le radis de cheval peroxidase (HRP) peuvent être utilisés pour produire un précipité dense en électrons6,7,8. Deux approches principales existent pour l’IEM, appelée étiquetage pré-embedding et post-encastrage. Dans la pré-intégration IEM, les anticorps sont introduits directement dans les cellules, ce qui nécessite la fixation de la lumière et la perméabilisation des cellules9,10,11. Les deux étapes peuvent endommager l’ultrastructure12,13. Le développement d’anticorps significativement plus petits constitués d’un fragment d’anticorps Fab conjugué à 1,4 nm de nanogold permet d’utiliser des conditions de perméabilisation très douces; cependant, le nanogold est trop petit pour la visualisation directe sous TEM et nécessite des étapes supplémentaires d’amélioration pour devenir visible14,15,16. Dans l’IEM post-incorporation, les anticorps sont appliqués sur les sections minces des cellules qui ont été entièrement traitées par fixation, déshydratation, et l’intégration dans la résine17. Bien que cette approche évite l’étape de perméabilisation, la préservation de l’épitope d’intérêt tout au long de la préparation de l’échantillon est difficile18,19,20. La méthode Tokuyasu de fixation de la lumière suivie de la congélation, cryo-sectionnement, et la détection d’anticorps fournit la conservation améliorée d’épitope21,22. Cependant, les exigences techniques de la cryo-ultramicrotomie, ainsi que le contraste sous-optimal atteint dans la cellule, sont des inconvénients23.
L’utilisation d’étiquettes génétiquement codées élimine bon nombre des difficultés de l’IEM liées à la détection de la protéine d’intérêt. Une variété d’étiquettes sont disponibles, y compris HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG, et metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Chacun e de ces avantages présente des avantages par rapport aux méthodes précédentes, mais chacune présente également des inconvénients empêchant une utilisation généralisée. Ces inconvénients vont de l’inactivité de HRP dans le cytosol à la grande taille de l’étiquette de ferritine, sensibilité à la lumière de ReAsH, et petite taille et le manque de compatibilité avec la coloration cellulaire de la métallothionein. Récemment, une protéine dérivée de l’ascorbate peroxidase a été conçue comme une étiquette EM, nommée APEX233,34. En peroxidase, APEX2 peut catalyser l’oxydation de 3,3' diaminobenzidine (DAB), produisant un précipité qui réagit avec du tétroxide d’osmium pour fournir un contraste local EM avec une diffusion minimale de la protéine d’intérêt (moins de 25 nm)33,35. Contrairement aux méthodes traditionnelles basées sur HRP, APEX2 est extrêmement stable et reste actif dans tous les compartiments cellulaires33. Les échantillons peuvent être traités pour TEM à l’aide de la coloration traditionnelle de l’échantillon EM et des méthodes qui permettent une bonne visualisation des structures environnantes33,34,36. En raison de sa petite taille, sa stabilité et sa polyvalence, APEX2 est devenu une étiquette EM à fort potentiel.
Bon nombre des approches mentionnées ci-dessus ne peuvent pas ou n’ont pas encore été combinées à l’état actuel de l’art en matière de préservation ultrastructurale, de cryofixation et de substitution par le gel à basse température. Ainsi, ils souffrent d’un manque de conservation de la membrane et / ou de coloration cellulaire pour déterminer la localisation précise des protéines. Cela limite nécessairement la résolution et l’interprétation des données qui peuvent être obtenues. La cryofixation par congélation à haute pression (HPF) implique une congélation rapide d’échantillons dans l’azote liquide à haute pression (2 100 barres), ce qui provoque la vitrification plutôt que la cristallisation des échantillons aqueux, préservant ainsi les cellules dans un état quasi-indigène37,38,39. Le HPF est suivi d’une substitution par gel (FS), d’une déshydratation à basse température (-90 oC) en acétone combinée à l’incubation avec des taches EM typiques telles que le tétroxide d’osmium et l’acétate uranyl. HPF et FS fournissent ensemble un avantage distinct sur la fixation chimique traditionnelle (un processus plus long qui peut conduire à des artefacts) et la déshydratation de l’alcool à température ambiante ou sur la glace (qui peut conduire à l’extraction des lipides et des sucres), et sont donc souhaitables de combiner avec les meilleures étiquettes EM pour la détection des protéines.
Une des raisons pour lesquelles HPF/FS n’a pas été combiné avec l’étiquetage APEX2 est que la fixation chimique légère est une condition préalable à la réaction de peroxidase, limitant la diffusion du produit de réaction de DAB. Dans les études APEX2 jusqu’à présent, la fixation et la réaction peroxidase sont suivies par les méthodes traditionnelles EM pour la coloration et la déshydratation de l’alcool33,36. Cependant, il a été démontré que la suite de fixation chimique avec HPF / FS fournit un avantage distinct dans la préservation par rapport à la fixation chimique traditionnelle et la déshydratation de l’alcool seul40. La perte d’intégrité ultrastructurale observée dans les échantillons traditionnels de TEM semble moins liée à la fixation qu’à la déshydratation, qui se fait généralement en utilisant de l’alcool à température ambiante ou sur la glace, et peut conduire à l’extraction des lipides et des sucres40,41. Pour développer la méthode cryoAPEX, nous avons émis l’hypothèse que la fixation chimique et la réaction de peroxidase, suivies par HPF et FS, produiraient un résultat optimal en termes de préservation ultrastructurale.
Ici, nous présentons le protocole cryoAPEX, qui combine apEX2 marquage avec des méthodes de cryofixation et de substitution de gel (Figure 1). Ce protocole simple se compose de la transfection d’une protéine APEX2-étiquetée d’intérêt, de fixation chimique des cellules, et de la réaction de peroxidase. HPF et FS sont ensuite effectués suivis de l’encastrage typique de résine et de la section mince. L’imagerie TEM révèle une excellente préservation de l’ultrastructure à l’aide de cette méthode. En outre, la localisation subcellulaire à haute résolution et la distribution spatiale d’une protéine lumenal de réticulum endoplasmique (ER) ont été observées. Cette méthode est largement utile pour la détection de la localisation des protéines membranaires dans les cellules pour l’analyse de la microscopie électronique. Dans nos mains, la méthode a fonctionné avec succès pour une variété de lignées cellulaires cultivées dans la culture tissulaire, y compris HEK-293T (rein embryonnaire humain), HeLa (cancer du col de l’utérus humain), Cos7 (fibroblaste de rein de singe vert africain), et BHK (rein de hamster bébé). Des instructions détaillées sont décrites ci-dessous à l’aide de cellules HEK-293T.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Les événements cellulaires clés comme la transduction du signal et le trafic de membranes dépendent d’un emplacement approprié des protéines dans les compartiments cellulaires. Comprendre la localisation sous-cellulaire précise des protéines est donc important pour répondre à de nombreuses questions biologiques. La recherche d’un label robuste pour identifier la localisation des protéines combinée à une conservation cellulaire adéquate et la coloration a été historiquement difficile. Les progrès récents de la microscopie électronique (EM) ont mené au développement de nombreuses méthodes et stratégies visant à accroître la préservation cellulaire et les protéines cibles d’étiquettes. ApEX2, une étiquette génétique relativement nouvelle à base de peroxidase, est un chef de file prometteur dans le domaine des étiquettes actives em.- cloables. La préparation de l’échantillon pour la microscopie électronique de transmission (TEM) a également progressé ces dernières années avec l’avènement de la cryofixation par congélation à haute pression (HPF) et la déshydratation à basse température et la coloration par substitution par congélation (FS). HPF et FS fournissent une excellente conservation de l’ultrastructure cellulaire pour l’imagerie TEM, en second lieu seulement à la cryo-imagerie directe des échantillons vitreux. Ici, nous présentons un protocole pour la méthode cryoAPEX, qui combine l’utilisation de l’étiquette APEX2 avec HPF et FS. Dans ce protocole, une protéine d’intérêt est étiquetée avec APEX2, suivie de la fixation chimique et de la réaction de peroxidase. Au lieu de la coloration traditionnelle et de la déshydratation de l’alcool à température ambiante, l’échantillon est cryofixe et subit une déshydratation et une coloration à basse température via FS. À l’aide de cryoAPEX, non seulement une protéine d’intérêt peut être identifiée dans les compartiments subcellulaires, mais aussi des informations supplémentaires peuvent être résolues en ce qui concerne sa topologie au sein d’une membrane structurellement préservée. Nous montrons que cette méthode peut fournir une résolution assez élevée pour déchiffrer les modèles de distribution de protéines dans un lumen organelle, et pour distinguer la compartimentation d’une protéine dans un organite à proximité d’autres organelles non étiquetées. En outre, cryoAPEX est procéduralement simple et favorable aux cellules cultivées dans la culture de tissu. Il n’est pas plus difficile techniquement que les méthodes typiques de cryofixation et de substitution de gel. CryoAPEX est largement applicable pour l’analyse TEM de toute protéine membranaire qui peut être génétiquement étiquetée.

Afin de comparer la conservation ultrastructurale utilisant la méthode cryoAPEX avec la fixation et la déshydratation traditionnelles, nous avons préparé des échantillons dans lesquels une membrane de réticulum endoplasmique (ERM ; ER membrane) peptide a été marqué avec APEX2 et transfecté dans les cellules HEK-293T. ERM-APEX2 localise à la face cytoplasmique de l’ER et transforme la structure ER en structures morphologiquement distinctes connues sous le nom d’ER lisse organisée (OSER)34...

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The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Ce protocole décrit la méthode cryoAPEX, dans laquelle une protéine de membrane APEX2-étiquetée peut être localisée par microscopie électronique de transmission dans l’ultrastructure optimale-préservée de cellules.

Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Cette méthode combine la capacité de tacher pour une protéine membranaire tout en préservant l’intégrité de la membrane et l’architecture subcellulaire. Il est donc très puissant pour localiser avec précision une protéine associée à la membrane. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine l’utilisation d’une étiquette génétiquement clonable robuste, APEX2, avec des méthodes de pointe dans la préservation cellulaire de la microscopie électronique, y compris la cryofixation et la substitution par gel.Ensemble, ceux-ci permettent une localisation précise des protéines au sein d’une cellule bien conservée. Ce protocole peut être utilisé pour disséquer les mécanismes par lesquels les virus se répliquent à l’intérieur de la cellule hôte. Les virus détournent souvent les protéines hôtes pendant leur système d’infection.Les virus sont les petits génomes, qu’ils utilisent pour se répliquer à l’intérieur de ces cellules hôtes. Récemment, nous avons été en mesure de dans des données non publiées, étiqueter ces protéines en utilisant cette technologie pour comprendre comment les virus se répliquent. Cette technique s’est avérée vraiment critique dans une étude collaborative récente sur une toxine bactérienne qui cause la dégradation du golgi.En utilisant cryoAPEX, nous avons été en mesure de localisér précisément la toxine avec les morceaux fragmentés golgi, quelque chose qui était vraiment difficile à voir autrement en utilisant des techniques normales d’immunofluorescence. Elaine Mihelc, étudiante aux cycles supérieurs et associée de recherche stephanie Angel, de nos laboratoires, démontrera cette technique. Après l’ensemencement des cellules HEK293 dans le plat, transfecter les cellules avec apex2 marqués plasmides d’expression mammifère à l’aide d’un réaccélément transfection selon les directives du fabricant.À 12-15 heures après la transfection, laver les cellules une fois avec PBS. Ensuite, lavez les cellules avec PBS du plat dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugeuse à 500 x g pendant cinq minutes.Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille en deux millilitres de glutaraldehyde de 2 % et de tampon cacodylate de sodium molaire à 7,4 pH à température ambiante. Déposer l’échantillon sur la glace pour l’incuber pendant 30 minutes. Ensuite, pelleter l’échantillon à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Lavez la pastille trois fois pendant cinq minutes chacune avec deux millilitres de tampon de cacodylate de sodium molaire de 0,1 molaire en centrifugant à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer le supernatant. Pour effectuer la réaction de peroxyde, lavez la pastille en la suspendant en trois millilitres de solution DAB suivie d’un granulé à 500 x g pendant cinq minutes.Ensuite, suspendez la pastille en trois millilitres de solution DAB avec peroxyde d’hydrogène de 5,88 millimlaires. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. La pastille devient visiblement de couleur brune, ce qui indique la présence du produit de réaction insoluble DAB.Après lavage à nouveau avec tampon cacodylate de sodium dans le DMEM, selon le manuscrit, re-suspendre la pastille cellulaire dans 500 microlitres d’une solution cryoprotectrice de DMEM contenant 10% sérum bovin fœtal et 15% albumine de sérum bovin. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 millilitre. Pellet à nouveau, augmentant légèrement la vitesse de centrifugeuse de 500 x g.Jetez la majorité du supernatant, en veillant à ce qu’il reste suffisamment de liquide pour que la pastille ne se dessèche pas. Évacuez tout liquide restant de la pastille cellulaire à l’aide du coin d’un lingette de laboratoire ou d’une serviette en papier. Laissez suffisamment de liquide rester pour que la pastille forme une pâte, semblable en consistance au dentifrice.Aspirez deux à trois microlitres de la pastille cellulaire et déposez-la sur un porte-membrane. Remplissez complètement le puits du porteur de la membrane de sorte que la tension de surface crée un léger dôme sur le dessus. Faites glisser le porte-membrane dans la cartouche et fixez-le.Placez la cartouche dans la machine HPF qui a été préparé et amorcé et appuyez sur commencer à geler. En gardant les cartouches immergées dans de l’azote liquide, retirez le porte-membrane de sa cartouche. Placer dans une capsule en plastique et placer la capsule en plastique dans un Cryovial plein d’azote liquide.Dans une hotte chimique, préparer un millilitre par échantillon de la solution de 0,2% de poids par volume d’acide tannique et 5%DI d’eau dans l’acétone dans un Cryovial. Placez-les dans de l’azote liquide pour les congeler. Placez le mélange de substitution de gel d’un flacon et les Cryovials contenant les granules de cellules congelées dans la chambre d’échantillon des unités de substitution de gel.Transférer la capsule interne contenant le porteur de la membrane du flacon d’azote liquide dans le flacon correspondant contenant le mélange de substitution de gel un. Commencez un protocole de substitution de gel à 90 degrés Celsius. Après 24 heures, mettre en pause la substitution de gel et laver les échantillons trois fois pendant cinq minutes avec de l’acétone refroidie à 90 degrés Celsius.Ensuite, dans une hotte chimique, préparer un millilitre par échantillon d’une solution de 1% de tétoxyde d’osmium, 0,2% d’acétate d’uranyle, et 5% d’eau DI dans l’acétone dans un Cryovial et les placer dans de l’azote liquide pour geler. Placez les Cryovials avec le mélange de substitution de gel deux dans l’unité de substitution de gel et transférez les capsules du troisième lavage d’acétone dans le mélange de substitution de gel deux flacons. Incubez-les et mélangez-les pendant 72 heures à 90 degrés Celsius, suivis d’un réchauffement graduel à zéro degré Celsius sur 12-18 heures.Maintenir la température à zéro degré Celsius et ajouter de l’acétone pré-refroidie dans les flacons pour les laver trois fois pendant 10 minutes chacune. Préparer un mélange de résine de choix dans un bécher en plastique selon les instructions du fabricant et ajouter 2%4% et 8% de résine dans les flacons pour immerger les capsules. Incuber pendant deux heures chacun à zéro degré Celsius.Ensuite, incuber en 15%30%60%90% et 100% résine composants de A, B, et D seulement pendant quatre heures chacun à température ambiante. Après les 20 heures, préparer un mélange de résine composants A, B, C et D et incuber pendant quatre heures. Placez les porteurs de membrane avec le côté de granule de cellules vers le haut dans les moules plats d’intégration et remplissez avec le mélange de résine A, B, C, et D.Placez-les dans un four pour polymériser à 60 degrés Celsius pendant 24-36 heures.Après la polymérisation, retirez les blocs du moule et placez l’échantillon dans le mandrin vertical de l’ultra microtome où il peut être visualisé avec grossissement. Séparez le porteur de membrane du bloc par une combinaison d’azote liquide de tamponnage sur le porteur de membrane pour séparer le métal du plastique, et utilisant une lame de rasoir pour ébrécher loin la résine autour du porteur de membrane. Une fois séparé, soulevez doucement le porteur de membrane, laissant le dôme de granule de cellule sur la face du bloc.Placez le bloc avec la pastille de cellules exposées orientée vers le haut dans un moule plat d’intégration qui est légèrement plus profond que le premier moule et remplissez avec des composants de résine A, B, C, et D.Polymériser à 60 degrés Celsius pendant 24-36 heures. Coupez le bloc autour de la pastille cellulaire à l’aide d’une lame de rasoir. Placez ensuite le bloc dans le mandrin de l’échantillon sur le bras sectionnant d’un ultra microtome.À l’aide d’un couteau en verre ou en diamant, taillez le bloc en forme trapézoïde qui entoure étroitement la pastille cellulaire. Obtenez des sections ultra minces de 90 nanomètres de la pastille cellulaire à l’aide d’un couteau en verre ou en diamant. Ramassez un ruban de sections sur une grille TEM.Séchez la grille en buvant le bord sur un morceau de papier filtre et rangez-le dans une boîte de stockage de grille TEM. Montez la grille sur le support TEM et placez le support dans le microscope. Utilisez un Tecnai T12 à 80 kilovolts pour le criblage d’échantillons cryoAPEX.Acquérir des images de cellules et de structures subcellulaires d’intérêt avec l’étiquetage APEX2. Dans cette étude, la préparation de l’échantillon par les méthodes traditionnelles apex a abouti à l’étiquetage clair des structures de réticulum endoplasmiques organisées et lisses. Au grossissement élevé, les membranes empilées sont apparues ébouriffées et des lacunes non uniformes étaient présentes entre les densités concentriques de membrane, indiquant la conservation pauvre de membrane et l’extraction de lipide.L’échantillon préparé par cryoAPEX a également eu l’étiquetage clairement défini des structures organisées et lisses de réticulum endoplasmique, cependant, les membranes étaient lisses et parallèles et peu ou pas d’extraction de lipide a été vue. L’analyse de TEM des sections minces de 90 nanomètres a indiqué que la protéine E interagissant de levure de Huntington était présente dans tout le réticulum endoplasmique périphérique aussi bien que l’enveloppe nucléaire. En outre, la protéine E interagissant avec la levure Huntington a été résolue dans des foyers régulièrement espacés le long de la membrane luminale du réticulum endoplasmique.La distribution et les foyers de protéine E interagissant avec la levure de Huntington étaient également visibles dans un échantillon préparé avec la fixation et la déshydratation traditionnelles. Cependant, la perturbation et l’extraction étendues de membrane étaient présentes, rendant l’échantillon sous-optimal. L’étiquetage APEX2 a été effectué à l’aide de trois marqueurs cellulaires, dont mito-V5-APEX2 a fourni la coloration spécifique des mitochondries seulement et CAAX-APEX2 a produit la coloration distincte de la membrane de plasma seulement.Aucun étiquetage n’a été observé dans les organites intracellulaires. La coloration du lumen golgi a également été évaluée à l’aide d’un marqueur Alpha MAN2-APEX2 tel que décrit dans notre manuscrit original de Sengupta et al. Après cette procédure, des méthodes tridimensionnelles telles que la tomographie électronique ou la microscopie électronique focalisée de balayage de faisceau d’ion peuvent être exécutées afin d’étudier la distribution 3D d’une protéine d’intérêt.Bon nombre des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques, de sorte qu’avant utilisation, les fiches de données sur la sécurité devraient être consultées pour s’assurer que les produits chimiques sont manipulés à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié et éliminés conformément aux lignes directrices institutionnelles.

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Préparation de grille cryo-microscopique électronique pour des études résolues dans le temps à l’aide d’un nouveau système robotique, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Stratégies d’optimisation de l’acquisition de données de tomographie électronique cryogénique

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Imagerie des domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée par tomographie électronique

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