Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

הפרוטוקול המתואר כאן נובע מפרסום על ידי Sengupta ואח ', היומן של מדע התא, 132 (6), jcs222315 (2019)48. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים R01GM10092 (כדי ס) ו AI081077 (R.V.S.) מן המכון הלאומי לבריאות, CTSI-106564 (ל ס) מתוך אינדיאנה מכון למדעי המחקר, ו PI4D-209263 (כדי ס) מהמכון האוניברסיטאי Purdue לדלקת, אימונולוגיה, ומחלות זיהומיות.

1. תרבית תאים והעברה
<ol><li>זרעי HEK-293T תאים בקוטר 60 מ"מ או גדול יותר התרבות רקמות ולגדול ל 60% – 90% המפגש בחממה תרבות התא ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	<li>תאי העברה עם הבעה מAPEX2-מתויגים באמצעות מגיב (ראו טבלת חומרים) בהתאם להנחיות היצרן.</li>
	<li>ב 12-15 h לאחר ההעברה, לשטוף את התאים פעם אחת עם מלוחים מא?...

פרוטוקול קריואיפקס המוצג כאן מספק שיטה איתנה לאפיון הלוקליזציה של חלבונים ממברנות בתוך הסביבה התאית. לא רק שימוש של תג APEX2 מקודד גנטית לספק לוקליזציה מדויק של חלבון של עניין, אבל השימוש קריוקיבעון בטמפרטורות נמוכות מספק שימור מעולה וכתמים של מבנה האולטרה הסלולרי המקיף. בשילוב, גישות אלה ה...

מחקרים ביולוגיים כוללים לעתים קרובות שאלות לפתרון לוקליזציה של חלבון תת-תאי בתוך תאים ואורגלים. מיקרוסקופ immunofluorescence מספק תצוגה שימושית ברזולוציה נמוכה של לוקליזציה חלבון, וההתקדמות האחרונה בהדמיה סופר ברזולוציה דוחפים את גבולות הרזולוציה עבור מתויג פלואורוסקופים חלבונים1,2,3. עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרוני (EM) נשאר תקן זהב עבור דימות ברזולוציה גבוהה הסלולר מבנה הנייד, למרות תיוג של חלבונים הוא אתגר.
מבחינה היסטורית, מספר שיטות EM שימשו לגישה לשאלות של לוקליזציה של חלבון ultraקונסטרוקטיבי. אחת השיטות הנפוצות ביותר היא מיקרוסקופ חיסוני (IEM), כאשר נוגדנים ספציפיים אנטיגן משמשים כדי לזהות את חלבון הריבית. האות EM מופק על ידי יישום של נוגדנים משני מצועם חלקיקי אלקטרון-צפוף, בדרך כלל הזהב4,5. לחילופין, יש להשתמש בנוגדנים עם אנזימים כגון הסוס צנון peroxidase (hrp) יכול לשמש כדי לייצר מזרז אלקטרון צפוף6,7,8. שתי גישות עיקריות קיימות עבור IEM, כינה הטבעה מראש ושלאחר הטבעה של תוויות. ב-הטבעה מראש של IEM, נוגדנים מוצגים ישירות לתוך תאים, אשר מחייבת קיבוע אור וחדירות של התאים9,10,11. שני השלבים עלולים לגרוםנזק. למבנההאולטרסאונד 12,13 פיתוח של נוגדנים קטנים באופן משמעותי המורכב של נוגדן קטע Fab מצועעם 1.4 ננומטר ננוגולד מאפשר התנאים החדירות עדין מאוד לשמש; עם זאת, ננוגולד קטן מדי להדמיה ישירה תחת TEM ומחייב שלבי שיפור נוספים להפוך לגלויים14,15,16. ב-IEM שלאחר ההטבעה, נוגדנים מוחלים על חלקים דקים של תאים אשר עובדו באופן מלא על ידי קיבוע, התייבשות, והטבעה שרף17. בעוד שגישה זו נמנעת משלב החדירות, שמירה על אפירופה של ריבית לאורך ההכנה לדוגמא היא אתגר של18,19,20. שיטת טויאסו של קיבוע האור ולאחריה הקפאה, הקפאת ההקפאה וזיהוי הנוגדן מספקים שימור אפיפי משופר של21,22. עם זאת, הדרישות הטכניות של כריתת המיקרו-בדיקת ההקפאה, כמו גם הניגודיות התת-אופטימלית שהושגה בתא, הן חסרונות23.
השימוש בתגים מקודדים גנטית מבטל רבים של הקשיים של IEM הקשורים לזיהוי של חלבון הריבית. מגוון של תגים זמינים, כולל hrp, ferritin, reash, minisog, ו מטטידור24,25,26,27,28,29,30,31,32. לכל אחד מהם יש יתרונות על פני שיטות קודמות, אך לכל אחד מהם יש חסרונות המונעים שימוש נרחב. החסרונות הללו נע בין חוסר פעילות של HRP ב ציטוסול לגודל גדול של תג ferritin, רגישות קלה של ReAsH, וגודל קטן וחוסר תאימות עם כתמים סלולריים של מטטימיום. לאחרונה, חלבון נגזר ascorbate peroxidase כבר מהונדסים כמו תג EM, בשם APEX233,34. כמו peroxidase, APEX2 יכול לזרז את החמצון של 3, 3 ' diaminobenzidine (בתוך), הפקת מזרז כי מגיב עם אוסמיום tetroxide כדי לספק ניגודיות EM המקומי עם דיפוזיה מינימלית מן החלבון של עניין (פחות מ 25 ננומטר)33,35. שלא כמו שיטות מבוססות HRP מסורתיות, APEX2 הוא יציב מאוד ונשאר פעיל בכל התאים הסלולריים33. דגימות ניתן לעבד עבור TEM באמצעות כתמים מסורתיים לדוגמה EM ושיטות המאפשרות ויזואליזציה טובה של המבנים שמסביב33,34,36. בשל גודלו הקטן, יציבותו, ו רב-תכליתיות, APEX2 התפתחה כתגית EM עם פוטנציאל גדול.
רבים מהגישות שנדונו לעיל אינן יכולות להיות או עדיין לא בשילוב עם המצב הנוכחי של האמנות בשימור בדיקת אולטרה מבנית, קריוקטיביות והקפאה בטמפרטורות נמוכות. כך, הם סובלים מחוסר שימור ממברנה ו/או כתמים תא כדי לקבוע לוקליזציה חלבון מדויק. הדבר מגביל בהכרח את הרזולוציה והפרשנות של הנתונים שניתן להשיג. קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (hpf) כרוכה הקפאה מהירה של דגימות בחנקן נוזלי בלחץ גבוה (~ 2,100 bar), הגורם ויטריפיקציה ולא התגבשות של דגימות מימית, ובכך שמירה על תאים במצב קרוב-יליד37,38,39. Hpf אחריו הקפאת החלפת (FS), טמפרטורה נמוכה (-90 ° c) התייבשות אצטון בשילוב עם דגירה עם כתמי EM אופייני כגון אוסמיום tetroxide ו uranyl אצטט. HPF ו-FS יחד לספק יתרון ברור על גבי קיבעון כימי מסורתי (תהליך ארוך יותר אשר יכול להוביל חפצי אמנות) התייבשות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח (אשר יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים), ולכן רצוי לשלב עם תגי EM הטוב ביותר עבור זיהוי חלבון.
אחת הסיבות כי HPF/FS לא בשילוב עם תיוג APEX2 היא כי קיבעון כימי קל הוא תנאי מוקדם עבור התגובה peroxidase, הגבלת הדיפוזיה של המוצר התגובה מחיר. במחקרים APEX2 עד כה, קיבעון והתגובה peroxidase הם ואחריו שיטות EM מסורתיות לצביעת ואלכוהול התייבשות33,36. עם זאת, זה הוכח כי בעקבות קיבעון כימי עם HPF/FS מספק יתרון ברור בשימור על קיבעון כימי מסורתי התייבשות אלכוהול לבד40. הפסד של שלמות ultraקונסטרוקטיבית לראות בדוגמאות TEM מסורתיות נראה פחות מחובר קיבעון מאשר התייבשות, אשר נעשה בדרך כלל באמצעות אלכוהול בטמפרטורת החדר או על קרח, והוא יכול להוביל להפקת שומנים וסוכרים40,41. כדי לפתח את שיטת קריואיפקס, שיערו כי הקיבעון הכימי ואת התגובה peroxidase, ואחריו HPF ו-FS, היה לייצר תוצאה אופטימלית מבחינת שימור ultraקונסטרוקטיבי.
כאן אנו מציגים את פרוטוקול קריואיפקס, המשלב APEX2 תיוג עם קריוקיבוע והקפאת שיטות החלפת (איור 1). פרוטוקול פשוט זה מורכב מגלגול של חלבון APEX2 מתויג של עניין, קיבעון כימי של תאים, ואת התגובה peroxidase. HPF ו-FS מבוצעים לאחר מכן על ידי שתילת שרף אופייני והדקים. הדמיה TEM מגלה שימור מעולה של ultrastructure בנה באמצעות שיטה זו. בנוסף, לוקליזציה ברזולוציה גבוהה subcellular והפצה מרחבית של רשתית העין (ER) לומפלמיק חלבון נצפו. שיטה זו שימושית רבות לאיתור לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני. בידינו, השיטה עבדה בהצלחה עבור מגוון של קווי תאים שגדלו בתרבית רקמות, כולל HEK-293T (כליה עובריים האדם), הלה (סרטן צוואר הרחם האנושי), Cos7 (אפריקה ירוק כליות הקוף פיברוהפיצוץ), ו BHK (כליה אוגר התינוק). הוראות מפורטות מתוארות להלן באמצעות התאים HEK-293T.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

מפתח אירועים סלולריים כמו התמרה אותות וסחר בקרום להסתמך על מיקום החלבון הנכון בתוך תאים סלולריים. ובכך חשוב לענות על שאלות ביולוגיות רבות באופן מדויק. החיפוש אחר תווית איתנה לזיהוי לוקליזציה של חלבון בשילוב עם שימור הסלולר נאותה וכתמים כבר מאתגרת היסטורית. ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) הובילו לפיתוח שיטות ואסטרטגיות רבות כדי להגביר את שימור הסלולר והתווית היעד חלבונים. Peroxidase חדש יחסית מבוסס על תג גנטי, APEX2, הוא מנהיג מבטיח בתגים EM-אקטיב cloneable. הכנה לדוגמה עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) יש גם מתקדם בשנים האחרונות עם הופעתו של קריוקיבעון על ידי הקפאת לחץ גבוה (HPF) ו בטמפרטורות נמוכות התייבשות וכתמים באמצעות הקפאת החלפת (FS). Hpf ו-FS לספק שימור מעולה של מבנה האולטרסאונד הסלולרי עבור הדמיה TEM, השני רק ישיר-הדמיה ההקפאה של דגימות אינדקטור. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור שיטת ה-קריואיפקס, המשלבת את השימוש בתג APEX2 עם HPF ו-FS. בפרוטוקול זה, חלבון של עניין מתויג עם APEX2, ואחריו קיבעון כימי ואת התגובה peroxidase. במקום התייבשות כתמים ואלכוהול בטמפרטורת החדר, המדגם הוא קריוקבוע ועובר התייבשות וכתמים בטמפרטורה נמוכה באמצעות FS. באמצעות קריואיפקס, לא רק יכול להיות חלבון של עניין להיות מזוהה בתוך תאים subcellular, אבל גם מידע נוסף ניתן לפתור ביחס לטופולוגיה שלה בתוך קרום שנשמר מבחינה מבנית. אנו מראים כי שיטה זו יכולה לספק החלטה גבוהה מספיק כדי לפענח דפוסי הפצת חלבונים בתוך אורגל לומן, וכדי להבחין את מידור החלבון בתוך מאורגא אחד בסמיכות לאורגלים אחרים בלתי מסומנים. עוד, קריופיסגה היא תהליכים פשוטה וקלה לתאים גדל בתרבות הרקמה. היא אינה מאתגרת יותר מבחינה טכנית מאשר קריופיציה טיפוסית והקפאת שיטות החלפה. קריואיפקס היא ישימה באופן נרחב ניתוח TEM של כל חלבון ממברנה שניתן לתייג גנטית.

על מנת להשוות את שימור האולטרה-מבנית בשיטת הקריואיפקס עם קיבעון והתייבשות מסורתיים, הכנו דגימות שבהן קרום הרשתית האנדופלזמית (ה-אמ. סי; ממברנה ER) מתויג עם APEX2 ו העביר לתוך התאים HEK-293T. אה-APEX2 לאתר את הפנים cytoplasmic של er ו remodels מבנה er לתוך מבנים ברורים מורפולוגית המכונה מאורגנת חלקה ER (oser)<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

שיטה זו משלבת את היכולת להכתים לחלבון קרום תוך שמירה על שלמות הממברנה וארכיטקטורה תת-תאית. אז זה באמת חזק עבור לוקליזציה מדויקת חלבון הקשורים קרום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת את השימוש בתג חזק לשיבוט גנטי, APEX2, עם שיטות מתקדמות בשימור תאי למיקרוסקופ אלקטרונים, כולל קריופיקציה והחלפת הקפאה.יחד, אלה מאפשרים לוקליזציה מדויקת של חלבונים בתוך תא שמור היטב. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לנתח מנגנונים שבהם וירוסים משכפלים בתוך התא המארח. וירוסים לעיתים קרובות יחטפו חלבונים מארחים במהלך ערכת הזיהום שלהם.וירוסים הם הגנומים הקטנים, אשר הם משתמשים כדי לשכפל בתוך תאים מארחים אלה. לאחרונה, הצלחנו בנתונים שלא פורסמו, לתייג חלבונים אלה באמצעות טכנולוגיה זו כדי להבין כיצד וירוסים לשכפל. טכניקה זו הוכיחה באמת קריטי במחקר שיתופי שנערך לאחרונה על רעלן חיידקי שגורם התמוטטות golgi.באמצעות cryoAPEX, הצלחנו לאתר במדויק את הרעלן עם חתיכות גולגי מקוטע, משהו שהיה ממש קשה לראות אחרת באמצעות טכניקות immunofluorescence נורמלי. הדגמת טכניקה זו תהיה איליין Mihelc, סטודנט לתואר שני, ושותף מחקר, סטפני אנג'ל, מהמעבדות שלנו. לאחר זריעת תאי HEK293 בצלחת, להדביק את התאים עם APEX2 מתויג פלסמידים ביטוי יונקים באמצעות רגנט transfection על פי הוראות היצרן.ב 12-15 שעות לאחר transfection, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם PBS מהצלחת לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 x g במשך חמש דקות.הסירו בזהירות את העל-טבעי והשעו מחדש את גלולת הכדור בשני מיליליטר של 2%glutaraldehyde ו-0.1 מאגר נתרן קסודילאט טוחן בטמפרטורת החדר של 7.4 pH. מניחים את הדגימה על קרח כדי דגירה במשך 30 דקות. לאחר מכן, גלולה המדגם ב 500 x גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לשטוף את גלולה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם שני מיליליטר של 0.1 מאגר נתרן קאודילאט טוחנת על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר את העל-טבעי. כדי לבצע את התגובה peroxidase, לשטוף את גלולה על ידי השעיה מחדש בשלושה מיליליטר של פתרון DAB ואחריו גלולה ב 500 x g במשך חמש דקות.לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה בשלושה מיליליטר של פתרון DAB עם 5.88 מי חמצן מילימולרית. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. גלולה הופך בצבע חום בעליל, המציין את נוכחותו של מוצר תגובת DAB מסיס.לאחר שטיפה שוב עם חיץ קקודילאט נתרן ב- DMEM, על פי כתב היד, להשעות מחדש את גלולת התא ב 500 microliters של פתרון cryoprotectant של DMEM המכיל 10% סרום חזיר עוברי ו 15% אלבומין סרום bovine. העבר את ההשעיה התא לצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מיליליטר. גלולה שוב, מעט להגדיל את מהירות הצנטריפוגה מ 500 x גרם.להשליך את רוב supernatant, להבטיח כי מספיק נוזל נשאר כך גלולה לא להתייבש. פתיל משם כל נוזל שנותר מכדור התא באמצעות הפינה של לנגב מעבדה או מגבת נייר. תן לנוזל מספיק להישאר כי גלולה יוצרת הדבק, דומה בעקביות משחת שיניים.שאף שניים עד שלושה מיקרוליטרים של גלולת התא והפקיד אותו על מנשא קרום. ממלאים את באר נושאת הממברנה לחלוטין, כך שמתח פני השטח יוצר כיפה קלה מלמעלה. החלק את מנשא הממברנה לתוך המחסנית ומאובטח.מקם את המחסנית במחשב HPF שהוכנה והוכנה ולחץ על התחל להקפיא. שמירה על המחסניות שקועות בחנקן נוזלי, הסר את מנשא הממברנה מהמחסנית שלו. מניחים לתוך קפסולת פלסטיק ומ מניחים את קפסולת הפלסטיק לתוך Cryovial מלא חנקן נוזלי.במכסה המנוע הכימי, להכין מיליליטר אחד לכל מדגם של הפתרון של 0.2% משקל לפי נפח חומצה טאנית ו 5% DI מים אצטון ב Cryovial. מניחים אותם לתוך חנקן נוזלי להקפיא. מניחים את תערובת החלפת ההקפאה בקבוקון אחד ואת Cryovials המכיל את כדורי התא הקפוא לתוך תא המדגם יחידות החלפת ההקפאה.מעבירים את הקפסולה הפנימית המכילה את נושא הממברנה מבקבוקון החנקן הנוזלי לתוך הבקבוקון המתאים המכיל תערובת החלפת הקפאה אחת. התחל פרוטוקול החלפת הקפאה ב 90 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, להשהות את החלפת ההקפאה ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם אצטון כי כבר מקורר ל 90 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, במכסה המנוע הכימי, הכינו מיליליטר אחד לדגימה של פתרון של 1%osmium tetroxide, 0.2% אורניל אצטט, ו 5% DI מים אצטון ב Cryovial וממקמים אותם בחנקן נוזלי להקפיא. מניחים את Cryovials עם תערובת החלפת ההקפאה שתיים לתוך יחידת החלפת ההקפאה ולהעביר את הכמוסות מן לשטוף אצטון השלישי לתוך תערובת החלפת ההקפאה שני בקבוקונים. דגירה אותם להקפיא תחליפים לערבב שתיים במשך 72 שעות ב 90 מעלות צלזיוס, ואחריו התחממות הדרגתית לאפס מעלות צלזיוס מעל 12-18 שעות.שמור על הטמפרטורה באפס מעלות צלזיוס ולהוסיף אצטון מקורר מראש לתוך הבקבוקונים לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד. הכינו תערובת של שף לבחירתכם בסקילר פלסטיק בהתאם להוראות היצרן והוסיפו 2%4% ו-8% מהסרף לבקבוקונים כדי לטבול את הקפסולות. דגירה במשך שעתיים כל אחד באפס מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הדגירה ב-15%30%60%90% ו-100% שף רכיבים של A, B ו-D רק למשך ארבע שעות כל אחת בטמפרטורת החדר. לאחר 20 שעות, להכין תערובת של רכיבי שף A, B, C, ו- D דגירה במשך ארבע שעות. מניחים את נושאות הממברנה עם צד גלולת תא למעלה לתוך תבניות הטבעה שטוחות וממלאים בתערובת שרף A, B, C ו- D.Place אותם בתנור כדי להפוך לפולימריה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24-36 שעות.לאחר פולמריזציה, להסיר את אבני מן התבנית ולמקום את המדגם ב chuck האנכי של microtome אולטרה שבו ניתן לדמיין עם הגדלה. הפרד את נושא הממברנה מהבלוק על ידי שילוב של חנקן נוזלי על מנשא הממברנה כדי להפריד את המתכת מהפלסטיק, ושימוש בסכין גילוח כדי לסובב את שרף סביב נושאת הממברנה. כאשר מופרדים, בעדינות להרים את נושאת הממברנה, משאיר את כיפת גלולת התא על פני הבלוק.מניחים את הבלוק עם גלולת התא החשוף הפונה כלפי מעלה בתבנית הטבעה שטוחה כי הוא קצת יותר עמוק מאשר התבנית הראשונה ולמלא עם רכיבי שרף A, B, C, ו D.Polymerize ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24-36 שעות. חתוך את הבלוק סביב גלולת התא באמצעות סכין גילוח. ואז למקם את הבלוק בדגימה צ'אק על זרוע החיתוך של מיקרוטום אולטרה.בעזרת סכין זכוכית או יהלום, חותכים את הבלוק לצורה טרפז המקיפה מקרוב את גלולת התא. השג 90 ננומטר חלקים דקים במיוחד של גלולת התא באמצעות סכין זכוכית או יהלום. בחר רצועת כלים של מקטעים ברשת TEM.יבש את הרשת על-ידי ניקוי הקצה על פיסת נייר סינון ואחסן אותה בתיבת אחסון של רשת TEM. הר את הרשת על מחזיק TEM והצב את המחזיק במיקרוסקופ. השתמש Tecnai T12 ב 80 קילו-וולט להקרנת דגימות cryoAPEX.רכוש תמונות של תאים ומבנים תת-תאיים בעלי עניין באמצעות תיוג APEX2. במחקר זה, הכנת המדגם בשיטות APEX מסורתיות הביאה לתיוג ברור של מבנים מאורגנים וחלקים של רטיקולום אנדופלסמי. בהגדלה גבוהה, הממברנות המוערמות נראו פרוע ופערים לא אחידים היו קיימים בין צפיפות קרום קונצנטרית, המציין שימור קרום לקוי וחילוץ השומנים.המדגם שהוכן על ידי cryoAPEX היה גם תיוג מוגדר בבירור של מאורגן, חלקה מבנים רטיקולום אנדופלסמי, עם זאת, הממברנות היו חלקות ומקבילות מעט מאוד מיצוי השומנים נראה. ניתוח TEM של 90 ננומטר חלקים דקים גילה כי שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E היה נוכח ברחבי רקמולום אנדופלזמי היקפי, כמו גם את המעטפה הגרעינית. בנוסף, שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E צפיפות נפתרה לתוך מוקדים במים קבועים לאורך קרום הרטיקולום האנטופלסמי luminal.שמרי הנטינגטון אינטראקציה חלבון E הפצה ו foci נראו גם מדגם מוכן עם קיבעון מסורתי והתייבשות. עם זאת, שיבוש קרום נרחב וחילוץ היו נוכחים, מה שהופך את המדגם תת אופטימלי. תיוג APEX2 בוצע באמצעות שלושה סמנים תאיים, מהם Mito-V5-APEX2 סיפק כתמים ספציפיים של המיטוכונדריה בלבד ו- CAAX-APEX2 הפיק כתמים ברורים של קרום הפלזמה בלבד.שום תיוג לא נצפה באברונים תאיים. הכתמים עבור לומן golgi הוערך גם באמצעות סמן אלפא MAN2-APEX2 כמתואר בכתב היד המקורי שלנו Sengupta ואח '. בעקבות הליך זה, שיטות תלת מימדיות כגון טומוגרפיה אלקטרונים או מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת קרן יון ממוקדת עשויות להתבצע על מנת לחקור את התפלגות התלת מימד של חלבון מעניין.רבים מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה הם רעילים, ולכן לפני השימוש, יש להתייעץ עם גיליונות נתוני בטיחות כדי להבטיח כי הכימיקלים מטופלים באמצעות ציוד מגן אישי תקין ונפטרים בהתאם להנחיות המוסדיות.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...