Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
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Il protocollo qui descritto deriva da una pubblicazione di Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni R01GM10092 (a S.M.) e AI081077 (R.V.S.) dei National Institutes of Health, CTSI-106564 (a S.M.) dell'Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, e PI4D-209263 (a S.M.) dall'Istituto Universitario Purprovvisorio per l'Infiammazione.

1. Cultura cellulare e trasfezione
<ol><li>Seme HEK-293T cellule su un 60 mm di diametro o più grande piatto di coltura tissutale e crescere al 60%-90% di confluenza in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi centigradi e 5% CO2.</li>
	<li>Cellule transfettrali con plasmidi di espressione dei mammiferi marcati APEX2 che utilizzano il reagente di trasfezione (vedi Tabella dei materiali)secondo le indicazioni del produttore.</li>
	<li>A 12-15 h dopo la trasfezione, lavare le cellule una...

Il protocollo cryoAPEX qui presentato fornisce un metodo robusto per caratterizzare la localizzazione delle proteine della membrana all'interno dell'ambiente cellulare. Non solo l'uso di un tag APEX2 geneticamente codificato fornisce una localizzazione precisa di una proteina di interesse, ma l'uso della criofissia e della disidratazione a bassa temperatura fornisce un'eccellente conservazione e colorazione dell'ultrastruttura cellulare circostante. Combinati, questi approcci sono un potente strumento per localizzare una...

Gli studi biologici spesso includono questioni di risoluzione della localizzazione delle proteine subcellulari all'interno di cellule e organelli. La microscopia a immunofluorescenza fornisce un'utile visione a bassa risoluzione della localizzazione delle proteine, e recenti progressi nell'imaging a super-risoluzione stanno spingendo i limiti di risoluzione per le proteine fluorescentimarcate 1,2,3. Tuttavia, la microscopia elettronica (EM) rimane lo standard d'oro per l'imaging dell'ultrastruttura cellulare ad alta risoluzione, anche se l'etichettatura delle proteine è una sfida.
Storicamente, diversi metodi EM sono stati utilizzati per affrontare questioni di localizzazione delle proteine ultrastrutturali. Uno dei metodi più comunemente utilizzati è la microscopia immunoelettronica (IEM), in cui gli anticorpi primari specifici dell'antigene vengono utilizzati per rilevare la proteina di interesse. Il segnale EM è generato dall'applicazione di anticorpi secondari coniugati con particelle ad alta densità di elettroni, più comunemente oro colloidale4,5. In alternativa, gli anticorpi coniugati con enzimi come la perossidasi di ravanello (HRP) possono essere utilizzati per produrre un precipitato ad alta densità di elettroni6,7,8. Esistono due approcci principali per IEM, denominati pre-incorporamento e post-incorporazione. Nel pre-incorporamento IEM, gli anticorpi vengono introdotti direttamente nelle cellule, il che richiede la fissazione della luce e la permeabilizzazione delle cellule9,10,11. Entrambi i passaggi possono danneggiarel'ultrastruttura 12,13. Lo sviluppo di anticorpi significativamente più piccoli costituiti da un frammento di Fab di corpo coniugato con 1,4 nm nanogold consente di utilizzare condizioni di permeabilizzazione molto delicate; tuttavia, il nanooro è troppo piccolo per la visualizzazione diretta in TEM e richiede ulteriori passaggi di miglioramento per diventare visibile14,15,16. Nell'IEM post-incorporamento, gli anticorpi vengono applicati su sottili sezioni di cellule che sono state completamente elaborate per fissazione, disidratazione e incorporamento in resina17. Mentre questo approccio evita la fase di permeabilizzazione, preservare l'epitopo di interesse durante la preparazione del campione è impegnativo18,19,20. Il metodo Tokuyasu di fissazione della luce seguito da congelamento, crio-sezione, e il rilevamento degli anticorpi fornisce una migliore conservazione dell'epitopo21,22. Tuttavia, i requisiti tecnici della crio-ultramicrotomia, così come il contrasto non ottimale ottenuto nella cellula, sono svantaggi23.
L'uso di tag geneticamente codificati elimina molte delle difficoltà dell'IEM legate alla rilevazione della proteina di interesse. Sono disponibili diversi tag, tra cui HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Ognuno di questi ha vantaggi rispetto ai metodi precedenti, ma ognuno ha anche svantaggi che impediscono l'uso diffuso. Questi inconvenienti vanno dall'inattività di HRP nel citosol alle grandi dimensioni del tag di ferritina, sensibilità alla luce di ReAsH, e piccole dimensioni e mancanza di compatibilità con la colorazione cellulare di metallothionein. Recentemente, una proteina derivata da ascorbate peroxidase è stata progettata come tag EM, chiamato APEX233,34. Come perossidasi, APEX2 può catalizzare l'ossidazione di 3,3' didiaminobenzidina (DAB), producendo un precipitato che reagisce con teossido di osmio per fornire contrasto EM locale con una diffusione minima dalla proteina di interesse (meno di 25 nm)33,35. A differenza dei metodi tradizionali basati su HRP, APEX2 è estremamente stabile e rimane attivo in tutti i compartimenti cellulari33. I campioni possono essere elaborati per TEM utilizzando la colorazione tradizionale dei campioni EM e metodi che consentono una buona visualizzazione delle strutture circostanti33,34,36. Grazie alle sue piccole dimensioni, stabilità e versatilità, APEX2 è emerso come un tag EM con un grande potenziale.
Molti degli approcci discussi in precedenza non possono essere o non sono ancora stati combinati con lo stato attuale dell'arte nella conservazione ultrastrutturale, nella criofissia e nella sostituzione del congelamento a bassa temperatura. Così, soffrono di una mancanza di conservazione della membrana e/o colorazione cellulare per determinare la localizzazione accurata delle proteine. Ciò limita necessariamente la risoluzione e l'interpretazione dei dati che possono essere ottenuti. La criofixazione mediante il congelamento ad alta pressione (HPF) comporta il congelamento rapido di campioni in azoto liquido ad alta pressione (2.100 bar), che causa la vetrificazione piuttosto che la cristallizzazione dei campioni acquosi, preservando così le cellule in uno stato quasi nativo37,38,39. L'HPF è seguita da una sostituzione di congelamento (FS), una disidratazione a bassa temperatura (-90 gradi centigradi) in acetone combinata con incubazione con le tipiche macchie EM come il tetrossido di osmio e l'acetato uranico. HPF e FS insieme offrono un netto vantaggio rispetto alla fissazione chimica tradizionale (un processo più lungo che può portare a manufatti) e alla disidratazione dell'alcol a temperatura ambiente o sul ghiaccio (che può portare all'estrazione di lipidi e zuccheri), e quindi possono combinarsi con i migliori tag EM per il rilevamento delle proteine.
Uno dei motivi per cui HPF/FS non è stato combinato con l'etichettatura APEX2 è che la fissazione chimica della luce è un prerequisito per la reazione alla perossia, limitando la diffusione del prodotto di reazione DAB. Negli studi APEX2 finora, fissazione e reazione alla perossida sono seguiti dai metodi Tradizionali EM per la colorazione e la disidratazione dell'alcol33,36. Tuttavia, è stato dimostrato che dopo la fissazione chimica con HPF/FS fornisce un netto vantaggio nella conservazione rispetto alla fissazione chimica tradizionale e alla disidratazione dell'alcool da solo40. La perdita di integrità ultrastrutturale osservata nei campioni TEM tradizionali appare meno connessa alla fissazione che alla disidratazione, che in genere avviene usando alcol a temperatura ambiente o sul ghiaccio, e può portare all'estrazione di lipidi e zuccheri40,41. Per sviluppare il metodo cryoAPEX, abbiamo ipotizzato che la fissazione chimica e la reazione perossidasi, seguite da HPF e FS, produrrebbero un risultato ottimale in termini di conservazione ultrastrutturale.
Qui presentiamo il protocollo cryoAPEX, che combina l'etichettatura APEX2 con i metodi di criofixation e di sostituzione del congelamento (Figura 1). Questo protocollo semplice consiste nella trasfezione di una proteina marcata APEX2 di interesse, fissazione chimica delle cellule e reazione alla perossida. HPF e FS vengono quindi eseguite seguite dall'incorporamento tipico della resina e dal sezionamento sottile. L'imaging TEM rivela un'eccellente conservazione dell'ultrastruttura utilizzando questo metodo. Inoltre, sono state osservate la localizzazione subcellulare ad alta risoluzione e la distribuzione spaziale di una proteina lumena endolasmica (ER). Questo metodo è ampiamente utile per rilevare la localizzazione della proteina membrana all'interno delle cellule per l'analisi della microscopia elettronica. Nelle nostre mani, il metodo ha funzionato con successo per una varietà di linee cellulari coltivate nella coltura dei tessuti, tra cui HEK-293T (rene embrionale umano), HeLa (cancro cervicale umano), Cos7 (fibroblasto renale della scimmia verde africana) e BHK (rene di criceto del bambino). Le istruzioni dettagliate sono descritte di seguito utilizzando le cellule HEK-293T.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Gli eventi cellulari chiave come la trasduzione del segnale e il traffico di membrana si basano sulla corretta posizione delle proteine all'interno dei compartimenti cellulari. Comprendere con precisione la localizzazione subcellulare delle proteine è quindi importante per rispondere a molte domande biologiche. La ricerca di un'etichetta robusta per identificare la localizzazione delle proteine combinata con un'adeguata conservazione cellulare e colorazione è stata storicamente impegnativa. I recenti progressi nell'imaging della microscopia elettronica (EM) hanno portato allo sviluppo di molti metodi e strategie per aumentare la conservazione cellulare ed etichettare le proteine bersaglio. Un tag genetico relativamente nuovo basato sulla perossidasi, APEX2, è un leader promettente nei tag eM-active clonabili. La preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è avanzata anche negli ultimi anni con l'avvento della criofissia mediante congelamento ad alta pressione (HPF) e disidratazione e colorazione a bassa temperatura tramite sostituzione del congelamento (FS). HPF e FS forniscono un'eccellente conservazione dell'ultrastruttura cellulare per l'imaging TEM, secondo solo per la crio-imaging diretto di campioni vitrei. Qui presentiamo un protocollo per il metodo cryoAPEX, che combina l'uso del tag APEX2 con HPF e FS. In questo protocollo, una proteina di interesse è contrassegnata con APEX2, seguita da fissazione chimica e reazione alla perossida. Al posto della colorazione tradizionale e della disidratazione dell'alcool a temperatura ambiente, il campione viene criofatto e subisce disidratazione e colorazione a bassa temperatura tramite FS. Utilizzando cryoAPEX, non solo è possibile identificare una proteina di interesse all'interno dei compartimenti subcellulari, ma anche informazioni aggiuntive possono essere risolte rispetto alla sua topologia all'interno di una membrana strutturalmente conservata. Dimostriamo che questo metodo può fornire una risoluzione sufficientemente elevata da decifrare i modelli di distribuzione delle proteine all'interno di un lume di organello e distinguere la compartimentazione di una proteina all'interno di un organello in prossimità di altri organelli non etichettati. Inoltre, crioAPEX è proceduralmente semplice e suscettibile alle cellule coltivate nella coltura tissutale. Non è più impegnativo dal punto di vista tecnico rispetto ai tipici metodi di criofissazione e sostituzione del congelamento. CryoAPEX è ampiamente applicabile per l'analisi TEM di qualsiasi proteina di membrana che può essere etichettata geneticamente.

Al fine di confrontare la conservazione ultrastrutturale utilizzando il metodo crioAPEX con la fissazione tradizionale e la disidratazione, abbiamo preparato campioni in cui una membrana del reticolo endolasmico (ERM; il peptide ER membrana) è stato etichettato con APEX2 e trasvenuto nelle cellule HEK-293T. ERM-APEX2 localizza la faccia citoplasmica del ER e rimodella la struttura ER in strutture morfologicamente distinte conosciute come organizzato liscio ER (OSER)34,<sup class="xref"...

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The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Questo protocollo descrive il metodo cryoAPEX, in cui una proteina della membrana marcata APEX2 può essere localizzata mediante microscopia elettronica di trasmissione all'interno di ultrastruttura cellulare conservata in modo ottimale.

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Questo metodo combina la capacità di macchiare una proteina di membrana preservando al contempo l'integrità della membrana e l'architettura subcellulare. Quindi è molto potente per localizzare con precisione una proteina associata alla membrana. Il principale vantaggio di questa tecnica è che combina l'uso di una robusta etichetta geneticamente clonabile, APEX2, con metodi all'avanguardia nella conservazione cellulare per la microscopia elettronica, inclusa la criofissazione e la sostituzione del congelamento.Insieme, questi consentono una localizzazione precisa delle proteine all'interno di una cellula ben conservata. Questo protocollo può essere utilizzato per sezionare meccanismi mediante i quali i virus si replicano all'interno della cella host. I virus spesso dirottano le proteine ospiti durante il loro schema di infezione.I virus sono i piccoli genomi, che usano per replicarsi all'interno di queste cellule ospiti. Recentemente, siamo stati in grado di etichettare queste proteine in dati inediti usando questa tecnologia per capire come i virus si replicano. Questa tecnica si è rivelata davvero critica in un recente studio collaborativo su una tossina batterica che causa la rottura del golgi.Utilizzando cryoAPEX, siamo stati in grado di localizzare con precisione la tossina con i pezzi di golgi frammentati, qualcosa che era davvero difficile da vedere altrimenti usando le normali tecniche di immunofluorescenza. A dimostrare questa tecnica sarà Elaine Mihelc, una studentessa laureata e ricercata, Stephanie Angel, dei nostri laboratori. Dopo aver seminato cellule HEK293 nel piatto, trasfezionare le cellule con plasmidi di espressione di mammiferi taggati APEX2 utilizzando il reagente di trasfezione secondo le indicazioni del produttore.A 12-15 ore dopo la trasfezione, lavare le cellule una volta con PBS. Quindi, lavare le cellule con PBS dal piatto in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifuga a 500 x g per cinque minuti.Rimuovere con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in due millilitri di glutaraldeide al 2% e tampone di cacodilato di sodio molare 0,1 a pH 7,4 a temperatura ambiente. Posizionare il campione sul ghiaccio per incubare per 30 minuti. Quindi, pellet il campione a 500 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Lavare il pellet tre volte per cinque minuti ciascuno con due millilitri di tampone di cacodilato di sodio molare di 0,1 centrifugando a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante. Per effettuare la reazione di perossidasi, lavare il pellet sospendendo in tre millilitri di soluzione DAB seguita da pellettizzazione a 500 x g per cinque minuti.Quindi, sospendere di nuovo il pellet in tre millilitri di soluzione DAB con perossido di idrogeno millimolare da 5,88 millimolare. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Il pellet diventa visibilmente di colore marrone, indicando la presenza del prodotto di reazione DAB insolubile.Dopo aver lavato nuovamente con tampone di cacodilato di sodio in DMEM, secondo il manoscritto, sospendere nuovamente il pellet cellulare in 500 microlitri di una soluzione crioprotettiva di DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale e il 15% di albumina di siero bovino. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 0,5 millilitri. Pellet di nuovo, aumentando leggermente la velocità di centrifuga da 500 x g.Scartare la maggior parte del supernatante, assicurando che sia lasciato abbastanza liquido in modo che il pellet non si asciughi. Allontanare il liquido rimanente dal pellet di cella utilizzando l'angolo di una salvietta da laboratorio o di un tovagliolo di carta. Lasciare che rimanga abbastanza liquido che il pellet forma una pasta, simile in consistenza al dentifricio.Aspirare da due a tre microlitri del pellet cellulare e depositarlo su un supporto a membrana. Riempire completamente il pozzo del supporto della membrana in modo che la tensione superficiale crei una leggera cupola sulla parte superiore. Far scorrere il supporto della membrana nella cartuccia e fissare.Posizionare la cartuccia nella macchina HPF che è stata predisposta e innescata e premere start to freeze. Mantenendo le cartucce immerse nell'azoto liquido, rimuovere il supporto della membrana dalla cartuccia. Mettere in una capsula di plastica e posizionare la capsula di plastica in un Cryovial pieno di azoto liquido.In una cappa chimica, preparare un millilitro per campione della soluzione dello 0,2% di peso in volume di acido tannico e del 5% di acqua DI in acetone in un Cryovial. Metterli in azoto liquido per congelarli. Posizionare la miscela di sostituzione del congelamento di una fiale e i cryoviali contenenti i pellet di cellule congelate nella camera di campionamento delle unità di sostituzione del congelamento.Trasferire la capsula interna contenente il portatore di membrana dalla fiala di azoto liquido nel flaconcino corrispondente contenente la miscela di sostituzione del congelamento. Avviare un protocollo di sostituzione del blocco a 90 gradi Celsius. Dopo 24 ore, mettere in pausa la sostituzione del congelamento e lavare i campioni tre volte per cinque minuti con acetone che è stato raffreddato a 90 gradi Celsius.Successivamente, in una cappa chimica, preparare un millilitro per campione di una soluzione di 1%di tetrossido di osmio, 0,2% di acetato di uro e 5%DI di acqua in acetone in un cryovial e metterli in azoto liquido per congelarli. Posizionare i Cryovials con la miscela di sostituzione del congelamento due nell'unità di sostituzione del congelamento e trasferire le capsule dal terzo lavaggio di acetone nella miscela di sostituzione del congelamento due fiale. Incubarli e congelare la combinazione di sostituzione due per 72 ore a 90 gradi Celsius, seguita da un riscaldamento graduale a zero gradi Celsius per 12-18 ore.Mantenere la temperatura a zero gradi Celsius e aggiungere acetone pre-raffreddato nelle fiale per lavare tre volte per 10 minuti ciascuno. Preparare una miscela di resina preferita in un bicchiere di plastica secondo le indicazioni del produttore e aggiungere il 2%4% e l'8% di resina nelle fiale per immergere le capsule. Incubare per due ore ciascuno a zero gradi Celsius.Quindi, incubare in 15%30%60%90% e 100% componenti in resina di A, B e D solo per quattro ore ciascuno a temperatura ambiente. Dopo le 20 ore, preparare una miscela di componenti in resina A, B, C e D e incubare per quattro ore. Posizionare i portatori di membrana con il lato del pellet cellulare in stampi di incorporamento piatti e riempire con la miscela di resina A, B, C e D.Metterli in un forno per polimerizzare a 60 gradi Celsius per 24-36 ore.Dopo la polimerizzazione, rimuovere i blocchi dallo stampo e posizionare il campione nel mandrino verticale dell'ultra microtomo dove può essere visualizzato con ingrandimento. Separare il supporto della membrana dal blocco da una combinazione di azoto liquido tamponato sul supporto della membrana per separare il metallo dalla plastica e utilizzare una lama di rasoio per scheggiare la resina intorno al supporto della membrana. Una volta separato, sollevare delicatamente il supporto della membrana, lasciando la cupola del pellet cellulare sulla faccia del blocco.Posizionare il blocco con il pellet di cellule esposte rivolto verso l'alto in uno stampo di incorporamento piatto leggermente più profondo del primo stampo e riempire con componenti in resina A, B, C e D.Polimerizzare a 60 gradi Celsius per 24-36 ore. Tagliare il blocco intorno al pellet di cella utilizzando una lama di rasoio. Quindi posizionare il blocco nel mandrino del campione sul braccio di sessatura di un ultra microtomo.Utilizzando un coltello di vetro o diamanto, tagliare il blocco in una forma trapezoidale che circonda strettamente il pellet cellulare. Ottenere sezioni ultra sottili di 90 nanometri del pellet cellulare utilizzando un coltello di vetro o diamante. Raccogliere una barra multifunzione di sezioni su una griglia TEM.Asciugare la griglia gonfiando il bordo su un pezzo di carta da filtro e conservarlo in una scatola di stoccaggio della griglia TEM. Montare la griglia sul supporto TEM e posizionare il supporto al microscopio. Utilizzare un Tecnai T12 a 80 kilovolt per lo screening di campioni crioAPEX.Acquisire immagini di cellule e strutture subcellulari di interesse con l'etichettatura APEX2. In questo studio, la preparazione del campione con i metodi tradizionali APEX ha portato a una chiara etichettatura di strutture endoplasmatiche organizzate e lisce del reticolo. Ad alto ingrandimento, le membrane impilate apparivano arruffate e erano presenti spazi non uniformi tra densità concentriche della membrana, indicando una scarsa conservazione della membrana e l'estrazione lipidica.Il campione preparato dal crioAPEX aveva anche un'etichettatura chiaramente definita di strutture del reticolo endoplasmatiche organizzate e lisce, tuttavia, le membrane erano lisce e parallele e si vedeva poca o nessuna estrazione lipidica. L'analisi TEM di sezioni sottili di 90 nanometri ha rivelato che la proteina interagente del lievito Huntington E era presente in tutto il reticolo endoplasmatico periferico e nell'involucro nucleare. Inoltre, la proteina E interagente del lievito Huntington è stata risolta in focolai regolarmente distanziati lungo la membrana del reticolo endoplasmatico luminale.La distribuzione e i fuochi della proteina E interagente del lievito Huntington erano visibili anche in un campione preparato con fissazione e disidratazione tradizionali. Tuttavia, erano presenti estese interruzioni ed estrazioni della membrana, rendendo il campione non ottimale. L'etichettatura APEX2 è stata eseguita utilizzando tre marcatori cellulari, di cui mito-V5-APEX2 ha fornito una colorazione specifica solo dei mitocondri e CAAX-APEX2 ha prodotto una colorazione distinta solo della membrana plasmatica.Non è stata osservata alcuna etichettatura negli organelli intracellulari. La colorazione per il golgi lume è stata valutata anche utilizzando un marcatore Alpha MAN2-APEX2 come descritto nel nostro manoscritto originale Sengupta et al. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti metodi tridimensionali come la tomografia elettronica o la microscopia elettronica a scansione di fascio ionico focalizzato al fine di indagare la distribuzione 3D di una proteina di interesse.Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche, quindi prima dell'uso, le schede di dati di sicurezza dovrebbero essere consultate per garantire che le sostanze chimiche siano maneggiate utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale e smaltite secondo le linee guida istituzionali.

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Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

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