Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

ここで説明するプロトコルは、Senguptaら、細胞科学ジャーナル、132(6)、jcs222315(2019)48による出版物に由来する。 この研究は、国立衛生研究所のR01GM10092(S.M.へ)とAI081077(R.V.S.)、インディアナ州臨床翻訳科学研究所のCTSI-106564(S.M.へ)、PI4D-209263(S.M.)による感染症・感染症研究所の助成金によって支えられている。

1. 細胞培養とトランスフェクション
<ol><li>播種HEK-293T細胞は直径60mm以上の組織培養皿に、37°Cおよび5%CO2で細胞培養インキュベーターで60%~90%の合流点に成長する。</li>
	<li>トランスフェクション試薬を用いたAPEX2タグ付き哺乳動物発現プラスミドを有するトランスフェクション細胞(材料表を参照)。</li>
	<li>トランスフェクション後 12~15時間で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)?...

ここで提示されるcryoAPEXプロトコルは、細胞環境内の膜タンパク質の局在を特徴付ける堅牢な方法を提供します。遺伝的にコードされた APEX2 タグを使用すると、目的のタンパク質の正確な局在化が実現するだけでなく、クライオフィクセションと低温脱水を使用することで、周囲の細胞の超構造の優れた保存と染色が実現します。これらのアプローチを組み合わせることで、細胞内のコンテ?...

生物学的研究には、細胞内およびオルガネラ内の細胞内タンパク質局在化を解決する問題が含まれることがよくあります。免疫蛍光顕微鏡はタンパク質局在化の有用な低分解能のビューを提供し、超解像イメージングにおける最近の進歩は、蛍光タグ付きタンパク質1、2、3の解像度の限界を押し上げている。しかし、電子顕微鏡(EM)は、タンパク質の標識は課題であるが、高解像度の細胞超構造をイメージングするためのゴールドスタンダードのままです。
歴史的に、超構造タンパク質局在化の問題にアプローチするためにいくつかのEM法が使用されてきた。最も一般的に利用されている方法の1つは、抗原特異的一次抗体を使用して目的のタンパク質を検出する免疫電子顕微鏡(IEM)です。EMシグナルは、電子密度の高い粒子と共役する二次抗体の適用により生成され、最も一般的には金金4、5がコロイド状である。あるいは、大根ペルオキシダーゼ(HRP)などの酵素と結合した抗体は、6,7,8の電子密度の高い沈殿物を製造するために使用することができる。IEM には、事前埋め込みと埋め込み後のラベリングという 2 つの主要なアプローチがあります。事前埋め込みIEMにおいて、抗体は細胞に直接導入され、細胞9、10、11の光固定および透過性化が必要となる。両方のステップは、超構造12、13を損傷する可能性があります。1.4 nmナノゴールドと結合した抗体Fab断片からなるかなり小さい抗体の開発は、非常に穏やかな透過性条件を使用することができます。しかし、ナノゴールドはTEMの下で直接可視化するには小さすぎて、14、15、16を見えるようにするために追加の強化ステップが必要です。埋め込み後IEMでは、固定、脱水、および樹脂17への埋め込みによって完全に処理された細胞の薄い切片に抗体が適用される。このアプローチは浸透化ステップを回避しますが、サンプル調製を通して目的のエピトープを維持することは困難である18,19,20.光固定法に続いて凍結、凍結分断、抗体検出により、エピトープ保存21,22が改善されました。しかしながら、クライオ超ミクロトミーの技術的要件は、細胞内で達成される最適でないコントラストと同様に、23の欠点である。
遺伝的にコードされたタグを使用すると、目的のタンパク質の検出に関連するIEMの多くの困難が排除されます。HRP、フェリチン、リース、ミニソグ、メタロチオーネイン24、25、26、27、28、29、30、31、32を含む様々なタグが利用可能です。これらの各方法には、以前の方法よりも利点がありますが、それぞれが広く使用されるのを妨げる欠点もあります。これらの欠点は、サイトゾル中のHRPの不活性からフェリチンタグの大きなサイズ、ReAsHの光感受性、およびメタロチオネインの細胞染色との相溶性の小さいサイズおよび適合性の欠如まで及ぶ。近年、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ由来のタンパク質が、APEX233,34というEMタグとして設計されている。ペルオキシダーゼとして、APEX2は3,3'ジアミノベンジジン(DAB)の酸化を触媒し、目的タンパク質(25nm未満)33、35から最小の拡散で局所EMコントラストを提供するために四酸化オスミウムと反応する沈殿物を生成することができる。従来のHRPベースの方法とは異なり、APEX2は非常に安定しており、すべてのセルラーコンパートメント33でアクティブなままです。サンプルは、従来のEMサンプル染色法と、周囲の構造33、34、36の良好な可視化を可能にする方法を使用してTEM用に処理することができる。サイズが小さく、安定性と汎用性が高いため、APEX2は大きな可能性を秘めたEMタグとして登場しました。
上で論議したアプローチの多くは、超構造保存、クライオフィクセションおよび低温凍結置換における現在の最新技術と組み合わせることができないか、まだ組み合わせられていない。したがって、正確なタンパク質局在性を決定するために、膜保存や細胞染色の欠如に苦しんでいます。これは、取得できるデータの解決と解釈を必ずしも制限します。高圧凍結(HPF)によるクライオフィケーションは、液体窒素中の試料を高圧(約2,100bar)で急速に凍結し、水性試料の結晶化ではなくガラス化を引き起こし、したがってほぼ天然状態の細胞を37、38、39に保存する。HPFは、凍結置換(FS)、低温(-90°C)のアセトンでの脱水を、四酸化オスミウムや酢酸ウラニルなどの典型的なEM染色剤とインキュベーションと組み合わせた。HPFとFSは、従来の化学固定(アーティファクトにつながる可能性のあるより長いプロセス)や室温または氷上でのアルコール脱水(脂質および糖の抽出につながる可能性がある)に対して明確な利点を提供し、したがって、タンパク質検出のための最良のEMタグと組み合わせることが望ましい。
HPF/FSがAPEX2標識と組み合わされていない理由の1つは、光化学固定がペルオキシダーゼ反応の前提条件であり、DAB反応生成物の拡散を制限していることである。これまでのAPEX2研究では、固定およびペルオキシダーゼ反応は、染色およびアルコール脱水33、36のための伝統的なEM法が続いている。しかし、HPF/FSによる化学的固定に続いて、従来の化学固定とアルコール脱水単独で40を保存する上で明確な利点を提供することが示されている。従来のTEMサンプルに見られる超構造的完全性の喪失は、脱水よりも固定に関連していないように見え、これは通常、室温または氷上でアルコールを使用して行われ、脂質および糖40、41の抽出につながる可能性がある。クライオAPEX法を開発するために、化学固定とペルオキシダーゼ反応、続いてHPFおよびFSが超構造保存の面で最適な結果を生み出すと仮定した。
ここでは、APEX2 タグと cryofixation とフリーズ置換メソッドを組み合わせた cryoAPEX プロトコルを紹介します (図 1)。この簡単なプロトコルは、対象となる APEX2 タグ付けされたタンパク質のトランスフェクション、細胞の化学固定、およびペルオキシダーゼ反応から成ります。HPFとFSは、次いで典型的な樹脂埋め込みと薄い断面化を行います。TEMイメージングは、この方法を用いた超構造の優れた保存を明らかにする。さらに、高分解能細胞内局在化および小胞体(ER)内腔タンパク質の空間分布が観察された。この方法は、電子顕微鏡分析のために細胞内の膜タンパク質局在化の検出に広く有用である。私たちの手では、この方法は、HEK-293T(ヒト胚性腎臓)、HeLa(ヒト子宮頸癌)、Cos7(アフリカの緑のサル腎臓線維芽細胞)、BHK(ベビーハムスター腎臓)など、組織培養で成長した様々な細胞株に成功しています。詳細な指示は、HEK-293T細胞を使用して以下に説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

シグナル伝達や膜の密転のような主要な細胞イベントは、細胞コンパートメント内の適切なタンパク質位置に依存します。タンパク質の正確な細胞内局在化を理解することは、多くの生物学的な質問に答えるために重要です。タンパク質の局在化と適切な細胞保存と染色を組み合わせた堅牢なラベルの探求は、歴史的に困難でした。電子顕微鏡(EM)イメージングの最近の進歩は、細胞の保存と標識標的タンパク質を増加させる多くの方法と戦略の開発につながっています。比較的新しいペルオキシダーゼベースの遺伝的タグであるAPEX2は、クローン可能なEM活性タグの有望なリーダーです。透過型電子顕微鏡(TEM)の試料調製も近年、高圧凍結(HPF)によるクライオフィク沈作の出現と、凍結置換(FS)による低温脱水および染色の出現とともに進んでいる。HPFおよびFSは、TEMイメージングのための細胞超構造の優れた保存を提供し、第2は、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的な光子試料のイメージングを行う。ここでは、Apex2 タグを HPF と FS と組み合わせた cryoAPEX メソッドのプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、目的のタンパク質にAPEX2がタグ付けされ、続いて化学固定とペルオキシダーゼ反応が行われます。従来の染色や室温でのアルコール脱水の代わりに、試料を凍結固定し、FS経由で低温で脱水と染色を行います。CryoAPEXを使用すると、目的のタンパク質を細胞内のコンパートメント内で識別できるだけでなく、構造的に保存された膜内のそのトポロジーに関して追加情報を解決することができます。この方法は、オルガネラ内のタンパク質分布パターンを解読し、1つのオルガネラ内のタンパク質の区画化を他の未標識オルガネラに近接して区別するのに十分な高い解像度を提供できることを示す。また、CryoAPEXは、組織培養で増殖した細胞に対して手続き的に簡単かつ受け入れやすい。これは、典型的なクライオフィクセションと凍結置換方法と同じ技術的に困難ではありません。CryoAPEXは、遺伝的にタグ付けできる膜タンパク質のTEM分析に広く適用可能です。

従来の固定と脱水を用いたcryoAPEX法を用いた超構造保存を比較するために、小胞体膜(ERM;ER膜)ペプチドをAPEX2でタグ付けし、HEK-293T細胞にトランスフェクトした。ERM-APEX2は、ERの細胞質面に局限し、組織化平滑ER(OSER)34、42、43として知られている形態学的に異なる構造にER構造を改造する。OSERの形態は、超構造保存を比較する...

Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

この方法は、膜の完全性と細胞内アーキテクチャを維持しながら、膜タンパク質の染色能力を兼ね備えています。したがって、膜関連タンパク質を正確に局所化するのに本当に強力です。この技術の主な利点は、信頼性の高い遺伝的に複製可能なタグであるAPEX2を、低温置換および凍結置換を含む電子顕微鏡の細胞保存における最先端の方法と組み合わせることである。これらを組み合わせることで、保存状態の良い細胞内での正確なタンパク質の局在化が可能になります。このプロトコルは、ウイルスがホストセル内で複製するメカニズムを解剖するために使用できます。ウイルスは、多くの場合、感染スキーム中にホストタンパク質をハイジャックします.ウイルスは小さなゲノムであり、これらの宿主細胞の中で複製するために利用する。最近では、未公開のデータで、この技術を使用してこれらのタンパク質にラベルを付け、ウイルスがどのように複製するかを理解することができました。この技術は、ゴルジの崩壊を引き起こす細菌毒素に関する最近の共同研究で本当に重要であることが判明しました。cryoAPEXを用いて、通常の免疫蛍光技術を使用して見るのが本当に難しい断片化したゴルジ片で毒素を正確に局地化することができました。この技術を実証することは、大学院生のエレイン・ミヘルクと、私たちの研究室の研究員ステファニー・エンジェルです。HEK293細胞を皿に播種した後、製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いて、APEX2タグ付き哺乳動物発現プラスミドで細胞をトランスフェクトする。トランスフェクション後12~15時間で、PBSで細胞を1回洗います。その後、PBSで細胞を皿から15ミリリットルの円錐管に洗い流します。500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を慎重に取り除き、ペレットを2%グルタルアルデヒド2ミリリットル、0.1モルのカコチル酸ナトリウムを室温でpH 7.4で再懸濁します。サンプルを氷の上に置き、30分間インキュベートします。次いで、試料を摂氏4度で5分間5分間500xgでペレット化する。ペレットを摂氏4度で遠心分離して0.1モルカコチル酸ナトリウムバッファーの2ミリリットルでそれぞれ5分間3回洗浄します。遠心分離後、上清を取り除く。ペルオキシダーゼ反応を行うために、ペレットを3ミリリットルのDAB溶液で再懸濁し、その後500xgで5分間ペレット化して洗浄する。その後、ペレットを5.88ミリモル過酸化水素で3ミリリットルのDAB溶液で再懸濁する。室温で30分間インキュベートします。ペレットは目に見えて茶色色になり、不溶性DAB反応生成物の存在を示す。DMEMでカコチル酸ナトリウムバッファーで再び洗浄した後、原稿によると、10%のウシ胎児血清および15%ウシ血清アルブミンを含むDMEMの凍結保護剤溶液の500マイクロリットルの細胞ペレットを再中断する。細胞懸濁液を0.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。ペレットを再度、500xgから遠心分離速度をわずかに増加させる。上清の大部分を捨て、ペレットが乾燥しないように十分な液体が残っていることを確認します。実験室のワイプまたはペーパータオルの角を使用して、細胞ペレットから残りの液体を離します。ペレットがペーストを形成するのに十分な液体を残し、歯磨き粉と同様の一貫性を保つ。細胞ペレットの2〜3マイクロリットルを吸引し、膜キャリアに堆積させる。表面張力が上にわずかなドームを作成するように、膜キャリアのウェルを完全に充填します。膜キャリアをカートリッジにスライドさせて固定します。カートリッジを準備済みでプライミングした HPF マシンに入れ、押してフリーズします。カートリッジを液体窒素に浸したまま、膜キャリアをカートリッジから取り出します。プラスチック製のカプセルに入れ、プラスチックカプセルを液体窒素でいっぱいのCryovialに入れ。化学フードで、溶液のサンプルあたり1ミリリットルを、体積タンニン酸で0.2%重量、そして5%DI水をクリオビアルでアセトンで調製します。液体窒素に入れて凍結します。凍結置換ミックス1バイアルと凍結細胞ペレットを含むCryovialsを凍結置換ユニットサンプルチャンバーに入れます。膜担体を含むインナーカプセルを液体窒素バイアルから、凍結置換を含む対応するバイアルに移入します。90°Cで凍結置換プロトコルを開始します。24時間後、凍結置換を一時停止し、90°Cに冷却されたアセトンでサンプルを5分間3回洗浄します。次に、化学フードで、1%オスミウム四酸化物質、0.2%酢酸ウラニル、および5%DI水の溶液のサンプルあたり1ミリリットルをクリボビアルで調製し、液体窒素に入れて凍結します。凍結置換を用いたCryovialsを2個を凍結置換ユニットに入れ、3回目のアセトン洗浄から2つのバイアルを混合して凍結置換にカプセルを移します。それらをインキュベートし、90°Cで72時間置換ミックス2を凍結し、続いて12〜18時間にわたって摂氏0度に徐々に温暖化します。温度を摂氏ゼロ度に保ち、バイアルにあらかじめ冷却したアセトンを加え、それぞれ10分間3回洗浄します。メーカーの指示に従ってプラスチックビーカーに選択した樹脂混合物を調製し、カプセルを浸すためにバイアルに2%4%と8%の樹脂を加えます。摂氏ゼロ度で2時間インキュベートします。次いで、15%30%60%90%及び100%樹脂成分のA、B、及びDの室温で4時間だけインキュベートする。20時間後、樹脂成分A、B、C、及びDを混合して調製し、4時間インキュベートする。細胞ペレット側の膜キャリアを平らな埋め込み型に入れ、樹脂混合物A、B、C、D.で満たし、オーブンに入れて24〜36時間摂氏60度で重合します。重合後、モールドからブロックを取り出し、サンプルを超ミクロトームの垂直チャックに入れ、倍率で視覚化することができます。膜キャリアをブロックから分離するには、膜キャリア上の液体窒素をバビングしてプラスチックから金属を分離し、カミソリブレードを使用して膜キャリアの周りの樹脂を切り離します。分離したら、細胞ペレットドームをブロックの面に残して、膜キャリアを静かに持ち上げます。露出したセルペレットを上方に向けて、最初の金型よりもわずかに深い平らな埋め込み金型に配置し、樹脂成分A、B、C、D.Polymerizeを60°Cで24~36時間充填します。カミソリの刃を使用して、セルペレットの周りのブロックをトリミングします。次に、サンプルチャックのブロックを超ミクロトームの切り離しアームに置きます。ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、細胞ペレットを取り囲む台形にブロックをトリミングします。ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、細胞ペレットの90ナノメートル超薄い部分を得る。TEM グリッド上のセクションのリボンを選択します。フィルターペーパーの端を消してグリッドを乾燥させ、TEM グリッドの保管ボックスに保管します。TEMホルダーにグリッドを取り付け、ホルダーを顕微鏡に入れる。80キロボルトのTecnai T12を使用して、クライオAPEXサンプルをスクリーニングします。APEX2標識を用いて、対象となる細胞や細胞下構造の画像を取得します。本研究では、従来のAPEX法によるサンプルの調製により、組織化された滑らかな小胞体構造の明確な標識が得られた。高倍率では、積層膜がフリルに見え、同心円膜密度の間に不均一なギャップが存在し、膜の保存と脂質抽出が不十分であることを示した。cryoAPEXによって調製されたサンプルはまた、組織化された滑らかな小胞体構造の明確に定義された標識を有していたが、膜は滑らかで平行であり、脂質抽出はほとんど見られなかった。90ナノメートル薄い切片のTEM分析は、ハンチントン酵母相互作用タンパク質Eが核エンベロープと同様に末梢小胞体全体に存在することを明らかにした。さらに、タンパク質E密度を相互作用するハンチントン酵母は、ルミナル小胞体膜に沿って定期的に間隔をあけた病巣に分解した。タンパク質E分布と病巣を相互作用するハンチントン酵母も、従来の固定と脱水で調製されたサンプルに見えました。しかし、広範な膜破壊および抽出が存在し、サンプルを最適ではないものにした。APEX2標識は3つの細胞マーカーを用いて行い、その中でミトコンドリアの特異的染色のみを行い、CAAX-APEX2は、形質膜の特異的染色のみを行った。細胞内小器官では標識は認められなかった。ゴルジルーメンの染色は、当社のオリジナルのセングプタら原稿に記載されているように、アルファMAN2-APEX2マーカーを使用して評価された。この手順に従って、電子断層撮影や集光イオンビーム走査電子顕微鏡などの三次元法を、目的とするタンパク質の3D分布を調べるため行われてもよい。このプロトコルで使用される化学物質の多くは有毒であるため、使用前に安全データシートを参照して、化学物質が適切な個人用保護具を使用して処理され、制度上のガイドラインに従って処分されるようにする必要があります。

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

走査型電子顕微鏡による肝類洞内皮細胞およびそれらの開窓の分析のための標準化された方法

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

極低温電子断層撮影の最適化戦略

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...