Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

여기서 설명된 프로토콜은 세포 과학 저널, 132 (6), jcs222315 (2019)48에의한 간행물에서 유래한다. 이 작품은 인디애나 임상 및 번역 과학 연구소에서 건강의 국립 연구소에서 R01GM10092 (S.M.에) 및 AI081077 (R.V.S.) 보조금에 의해 지원됩니다, CTSI-106564 (S.M.에), 그리고 PI4D-209263 (S.M.에) 감염성 질환 연구소에서 감염성 연구소, 감염성 연구소.

1. 세포 배양 및 형질감염
<ol><li>종자 HEK-293T 세포는 직경 60 mm 또는 더 큰 조직 배양 접시에 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 60%-90% 합류로 성장한다.</li>
	<li>형질감염 시약을 사용하여 APEX2 태그가 달린 포유류 발현 플라스미드를 사용한 트랜스펙트 세포(재료 표참조)는 제조사의 지시에 따른다.</li>
	<li>12-15 시간 후 형질 감염에서, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세포를 ...

여기에 제시된 cryoAPEX 프로토콜은 세포 환경 내에서 막 단백질의 국소화를 특성화하는 강력한 방법을 제공한다. 유전적으로 인코딩된 APEX2 태그를 사용하면 관심 있는 단백질의 정확한 국소화를 제공할 뿐만 아니라, 저온 탈수및 저온 탈수의 사용은 주변 세포 초구조체의 우수한 보존 및 염색을 제공합니다. 결합된, 이 접근은 그것의 세포내 문맥 내의 높은 정밀도로 단백질을 현지화하기 위한 강?...

생물학 연구는 수시로 세포와 세포기관 내의 세포내 단백질 현지화를 해결의 질문을 포함합니다. 면역형광 현미경 검사법은 단백질 국소화의 유용한 저해상도 뷰를 제공하며, 최근 초고해상도 이미징의 발전은 형광태그단백질1,2,3에대한 해상도의 한계를 밀어내고 있다. 그러나, 전자 현미경 검사법 (EM)는 단백질의 표지가 도전이더라도, 고해상도 세포 초음파를 화상 진찰을 위한 금 본위제남아 있습니다.
역사적으로, 몇몇 EM 방법은 초구조 단백질 현지화의 질문에 접근하기 위하여 이용되었습니다. 가장 일반적으로 이용되는 방법 중 하나는 항원 특이적 1 차 항체가 관심있는 단백질을 검출하기 위하여 이용되는 면역전자 현미경 검사법 (IEM)입니다. EM 신호는 전자 조밀 한 입자와 공액 이차 항체의 응용프로그램에 의해 생성되며, 가장 일반적으로 콜로이드 금4,5. 대안적으로, 말무과후옥시다아제(HRP)와 같은 효소와 접합된항체는6, 7,8을전자조밀성 침전물생성에 사용될 수 있다. IEM에는 사전 포함 및 사후 포함 레이블이라고 하는 두 가지 주요 방법이 있습니다. 사전 포함 IEM에서 항체는 세포에 직접 도입되어 세포의 빛 고정 및 투과화가 필요합니다9,10,11. 두 단계 모두초구조12,13을손상시킬 수 있다. 1.4 nm 나노 골드와 공액 된 항체 Fab 단편으로 구성된 상당히 작은 항체의 개발은 매우 부드러운 투과 조건사용 이 가능합니다; 그러나 나노 골드는 TEM에서 직접 시각화하기에는 너무 작으며14,15,16이표시되기 위해 추가 향상 단계가 필요합니다. 임베딩 후 IEM에서 항체는 수지17에고정, 탈수 및 삽입에 의해 완전히 처리 된 세포의 얇은 섹션에 적용됩니다. 이러한 접근법은 투과 단계를 피하지만, 샘플 전처리 전반에 걸쳐 관심의 에피토프를 보존하는 것은18,19,20에도전적이다. 도쿠야스 광 고정 방법 다음에 동결, 저온 절편 및 항체 검출은 향상된 에피토프보존(21,22)을제공한다. 그러나, 극저온 초미세 절제술의 기술적 요구 사항뿐만 아니라 세포에서 달성된 최적대비 이하의 불이익은 23가지단점이다.
유전적으로 인코딩된 태그를 사용하면 관심 있는 단백질의 검출과 관련된 IEM의 많은 어려움을 제거할 수 있습니다. 태그의 다양한 사용할 수 있습니다, HRP를 포함, 페리틴, ReAsH, miniSOG, 및 메탈로티오닌24,25,26,27,28,29,30,31, 32. 이들 각각은 이전 방법에 비해 장점이 있지만, 각각은 또한 광범위한 사용을 방지 단점이 있다. 이러한 단점은 시토솔에서 HRP의 비활성에서 페리틴 태그의 큰 크기, ReAsH의 빛 감도, 작은 크기와 금속 로티오닌의 세포 염색과의 호환성 부족에 이르기까지 다양합니다. 최근에는 아스코르브베이트 과산화아코시다아제로부터 유래된 단백질이 EM 태그로 설계되고 있으며, APEX233,34. 과산화제로서, APEX2는 3,3' 디아미노벤지딘(DAB)의 산화를 촉매할 수 있으며, 관심 있는 단백질(25 nm 미만)으로부터의 최소한의 확산과 국소 EM 대비를 제공하기 위해 오스뮴 테트록사이드와 반응하는 침전물을 생성한다(33,35. 기존의 HRP 기반 방법과 달리 APEX2는 매우 안정적이며 모든 셀룰러 구획33에서활성 상태로 유지됩니다. 샘플은 기존의 EM 샘플 염색 및 주변구조물(33,34,36)의좋은 시각화를 허용하는 방법을 사용하여 TEM용으로 처리될 수 있다. APEX2는 작은 크기, 안정성 및 다기능성으로 인해 잠재력이 큰 EM 태그로 부상했습니다.
위에서 논의된 많은 접근법은 초구조보존, 저온 동결치환착및저온동결치환착에서 현재의 당과 결합될 수 없거나 아직 결합되지 않았다. 따라서, 그들은 정확한 단백질 국소화를 결정 하기 위해 막 보존 및 세포 염색의 부족에서 고통. 이것은 반드시 얻을 수있는 데이터의 해상도와 해석을 제한합니다. 고압 동결 (HPF)에 의한 Cryofixation은 수성 샘플의 결정화보다는 유리화를 일으키는 고압 (~ 2,100 bar)에서 액체 질소에서 샘플을 신속하게 동결시켜37,38,39에가까운 상태로 세포를 보존합니다. HPF는 동결 치환(FS), 저온(-90°C) 탈수액과 인큐베이션, 오스뮴 테트옥사이드 및 우라닐 아세테이트와 같은 전형적인 EM 얼룩을 결합한다. HPF와 FS는 함께 전통적인 화학 적 고정 (유물로 이어질 수있는 더 이상 과정) 및 실온 또는 얼음 (지질과 설탕의 추출로 이어질 수있는) 알코올 탈수에 비해 뚜렷한 이점을 제공하므로 단백질 검출을위한 최고의 EM 태그와 결합하는 것이 바람직합니다.
HPF/FS가 APEX2 라벨링과 결합되지 않은 한 가지 이유는 빛 화학적 고정이 과산화아역 반응의 전제 조건이며 DAB 반응 생성물의 확산을 제한하기 때문입니다. 지금까지 APEX2 연구에서, 고정 및 과산화아제 반응은 염색 및 알코올 탈수에 대한 전통적인 EM 방법에 이어33,36. 그러나, HPF/FS를 이용한 화학적 고정을 따르는 것은 전통적인 화학적 고정 및 알코올 탈수 단독40에비해 보존에 뚜렷한 이점을 제공한다는 것을 보여주었다. 전통적인 TEM 샘플에서 볼 수 있는 초구조적 무결성의 손실은 탈수에 보다 고정에 덜 연결된 것으로 보이며, 이는 전형적으로 실온 또는 얼음에서 알코올을 사용하여 행해지며, 지질 및 당류의 추출로 이어질 수 있다40,41. cryoAPEX 방법을 개발하기 위해, 우리는 화학 적 고정 및 과산화 아제 반응, HPF 및 FS 에 이어, 초구조 보존의 관점에서 최적의 결과를 생성 할 것이라고 가설.
여기서 우리는 APEX2 태그를 동결 및 동결 대체 방법과 결합한 cryoAPEX프로토콜을제시합니다(그림 1). 이 간단한 프로토콜은 관심 있는 APEX2 태그가 달린 단백질의 형질감염, 세포의 화학적 고정 및 과산화아제 반응으로 구성됩니다. HPF 및 FS는 전형적인 수지 임베딩 및 얇은 단면에 의해 수행됩니다. TEM 이미징은 이 방법을 사용하여 초구조체의 우수한 보존을 보여줍니다. 추가적으로, 고분해능 세포성 면역화 및 벤도아성 망막(ER) 루멘성 단백질의 공간 분포가 관찰되었다. 이 방법은 전자 현미경 분석을 위한 세포 내막 단백질 국소화의 검출을 위해 널리 유용합니다. 우리의 손에, 방법은 HEK-293T (인간 배아 신장), HeLa (인간 자궁 경부암), Cos7 (아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포), 및 BHK (아기 햄스터 신장)를 포함하여 조직 배양에서 성장한 다양한 세포주를 위해 성공적으로 일했습니다. HEK-293T 세포를 사용하여 상세한 지침이 아래에 설명되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

신호 전이 및 막 인신 매매 와 같은 주요 세포 이벤트는 세포 구획 내의 적절한 단백질 위치에 의존합니다. 단백질의 정확한 세포 내 외 현지화를 이해하는 것은 많은 생물학적 질문에 대답하기 위해 이렇게 중요합니다. 적절한 세포 보존 및 염색과 결합된 단백질 국소화를 식별하기 위한 견고한 라벨에 대한 탐구는 역사적으로 어려운 일이었습니다. 전자 현미경 검사법 (EM) 화상 진찰에 있는 최근 어드밴스는 세포 보존을 증가하고 표적 단백질을 표시하기 위하여 많은 방법 그리고 전략의 발달로 이끌어 냈습니다. 비교적 새로운 퍼옥시다아제 기반 유전자 태그인 APEX2는 복제 가능한 EM 활성 태그의 유망한 리더입니다. 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)을 위한 견본 준비는 또한 고압 동결 (HPF) 및 저온 탈수 및 동결 치환 (FS)를 통해 염색에 의한 저온화의 출현과 더불어 최근에 진보했습니다. HPF 및 FS는 유리체 샘플의 저온 이미징에 이어 두 번째로 TEM 이미징을 위한 셀룰러 울트라구조의 우수한 보존을 제공합니다. 여기서 우리는 HPF 및 FS와 APEX2 태그의 사용을 결합하는 cryoAPEX 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에서 관심 있는 단백질은 APEX2로 태그가 지정되고 화학적 고정 및 과산화아제 반응이 뒤따릅니다. 실온에서 전통적인 염색 및 알코올 탈수 대신, 샘플은 저온이며 FS를 통해 저온에서 탈수 및 염색을 겪습니다. cryoAPEX를 사용하면 관심 있는 단백질을 세포외 구획 내에서 식별할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로 보존된 멤브레인 내에서의 토폴로지와 관련하여 추가 정보를 해결할 수 있습니다. 우리는 이 방법이 세포기관 루멘 내의 단백질 분포 패턴을 해독하고, 다른 표지되지 않은 소기관과 가까운 한 소기관 내에서 단백질의 구획화를 구별할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 추가, cryoAPEX는 절차적으로 간단 하 고 조직 배양에서 성장 하는 세포에 순종. 일반적인 동결 및 동결 대체 방법보다 기술적으로 더 어렵지 않습니다. CryoAPEX는 유전적으로 태그가 지정될 수 있는 막 단백질의 TEM 분석에 널리 적용됩니다.

저온아펙스 방법을 이용한 초구조보존을 기존의 고정 및 탈수와 비교하기 위해, 우리는 안구 망막(ERM)이 있는 샘플을 제조하였다. ER 멤브레인) 펩티드를 APEX2로 태그하고 HEK-293T 세포로 형질전환하였다. ERM-APEX2는 ER의 세포질 면을 현지화하고 ER 구조를 조직된 부드러운 ER(OSER)34,42,43으로알려진 형태학적으로 구별되는 구조로 리...

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The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

이 방법은 막 단백질에 얼룩을 두는 동시에 막 무결성 및 세포 전 세이체 아키텍처를 보존하는 기능을 결합합니다. 따라서 멤브레인 관련 단백질을 정확하게 국소화하는 데 매우 강력합니다. 이 기술의 주요 장점은 견고한 유전 적 복제 태그, APEX2의 사용과 극저온 및 동결 대체를 포함한 전자 현미경 검사법을 위한 세포 보존에 있는 기술 방법의 상태를 결합한다는 것입니다.이들은 함께 잘 보존된 세포 내에서 정확한 단백질 국소화를 허용합니다. 이 프로토콜은 바이러스가 호스트 셀 내부에서 복제되는 메커니즘을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 바이러스는 수시로 그들의 감염 계획 도중 호스트 단백질을 납치할 것입니다.바이러스는 작은 게놈, 그들은 이러한 호스트 세포 내부 복제 활용. 최근, 우리는 게시되지 않은 데이터에서 바이러스가 복제하는 방법을 이해하기 위해이 기술을 사용하여 이러한 단백질을 라벨 수 있었습니다. 이 기술은 골기 고장을 일으키는 원인이 되는 세균성 독소에 최근 협력 연구에서 정말 중요한 입증했습니다.cryoAPEX를 사용하여, 우리는 단편화된 골기 조각으로 독소를 정확하게 현지화할 수 있었습니다, 일반적인 면역 형광 기술을 사용하여 그렇지 않으면 보기 가 정말 어려웠던 무언가. 이 기술을 시연하는 것은 대학원생인 일레인 미헬크(Elaine Mihelc)와 연구 동료인 스테파니 엔젤(Stephanie Angel)이 우리의 실험실에서 볼 수 있습니다. 접시에 HEK293 세포를 파종 한 후, APEX2 태그 포유류 발 플라스미드 제조업체의 지시에 따라 트랜스 페시언 시약을 사용하여 세포를 트랜스펙트.12-15 시간 후에 경질 후에, PBS로 한 번 세포를 씻는다. 그런 다음 접시에서 PBS로 세포를 15 밀리리터 원내 튜브로 씻어냅니다. 500 x g의 원심분리기는 5분간.상체를 조심스럽게 제거하고 실온에서 pH 7.4에서 2%의 글루타랄데히드 및 0.1 어금니 나트륨 카코딜레이트 버퍼의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 샘플을 얼음 위에 놓고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 5분간 500 x g로 펠릿합니다.펠릿을 각각 5분간 3회 세척하여 0.1 의 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼 2밀리리터를 섭씨 4도에서 원심분리하여 씻습니다. 원심 분리 후 상체를 제거합니다. peroxidase 반응을 수행하기 위해, 5 분 동안 500 x g에서 펠릿팅 다음 DAB 용액의 3 밀리리터에서 다시 중단하여 펠릿을 세척합니다.그런 다음 과산화수소 5.88 밀리머를 가진 DAB 용액 의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요. 펠릿은 눈에 띄게 갈색으로 되어 불용성 DAB 반응 생성물의 존재를 나타냅니다.DMEM에서 나트륨 cacodylate 버퍼로 다시 세척 한 후 원고에 따르면 10 %의 태아 소 혈청과 15 %의 소 세럼 알부민을 포함하는 DMEM의 냉동 보호 용액 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 현탁액을 0.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송한다. 펠릿은 다시 원심분리기 속도를 500 x g에서 약간 증가시킵니다.펠릿이 건조하지 않도록 충분한 액체가 남아 있는지 확인, 상체의 대부분을 폐기. 실험실 닦아 또는 종이 타월의 모서리를 사용하여 세포 펠릿에서 남은 액체를 멀리 심지. 펠릿이 치약과 일관성이 유사하여 페이스트를 형성하는 충분한 액체를 유지하게 하십시오.세포 펠릿의 2~3개의 마이크로리터를 흡인시키고 멤브레인 캐리어에 증착한다. 표면 장력이 상단에 약간의 돔을 만들 수 있도록 멤브레인 캐리어의 우물을 완전히 채웁니다. 멤브레인 캐리어를 카트리지에 밀어 넣고 고정합니다.카트리지를 준비 및 준비된 HPF 기계에 넣고 누기 시작하십시오. 카트리지를 액체 질소에 담그고 카트리지에서 멤브레인 캐리어를 제거합니다. 플라스틱 캡슐에 넣고 플라스틱 캡슐을 액체 질소로 가득 찬 극한의 극찬에 넣습니다.화학 후드에서, 부피 탄닌산에 의해 0.2 %의 무게와 극저온아의 아세톤에 5 %의 DI 물용액의 샘플 당 1 밀리리터를 준비합니다. 동결액체 질소에 넣습니다. 동결 대체 믹스 1개의 바이알과 냉동 셀 펠릿을 함유한 Cryovials를 동결 대체 단위 샘플 챔버에 놓습니다.액체 질소 유리병으로부터 멤브레인 캐리어를 함유한 내부 캡슐을 동결 대체 믹스 를 함유한 해당 바이알로 옮춥시킵니다. 섭씨 90도에서 동결 대체 프로토콜을 시작합니다. 24시간 후 동결 대체를 일시 중지하고 90°C까지 냉각된 아세톤으로 5분간 샘플을 세 번 세척합니다.다음으로, 화학 후드에서, 1 %의 오스뮴 테트산화물의 용액의 샘플 당 1 밀리리터를 준비하고, 0.2 % 우란 아세테이트, 및 냉동 액체 질소에 넣어 아세톤에 5 %의 DI 물을 배치합니다. 동결 대체 믹스2를 동결 대체 장치에 넣고 3차 아세톤 세척에서 캡슐을 동결 대체 믹스 2개 바이알로 옮춥시다. 이를 배양하고 교체 믹스를 섭씨 90도에서 72시간 동안 동결한 다음 12-18시간 동안 섭씨 0도까지 점진적으로 온난화됩니다.온도를 섭씨 0도에서 유지하고 미리 냉각된 아세톤을 바이알에 추가하여 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 제조업체의 지시에 따라 플라스틱 비커에 수지 혼합물을 준비하고 캡슐을 몰입시키기 위해 바이알에 2 %4 %와 8 %의 수지 (수지)를 추가하십시오. 섭씨 0도에서 각각 2시간 동안 배양하세요.그런 다음 A, B, D의 15%30%60%와 100% 수지 성분을 실온에서 각각 4시간 동안만 배양합니다. 20시간 후 수지 성분 A, B, C 및 D를 혼합하여 4시간 동안 배양합니다. 세포 펠릿 이면에 세포 펠릿을 얹고 수지 혼합물 A, B, C 및 D.를 오븐에 넣고 24-36 시간 동안 60도에서 중합합니다.중합 후, 금형에서 블록을 제거하고 배율로 시각화 할 수있는 초미세 토메의 수직 척에 샘플을 배치합니다. 멤브레인 캐리어에 액체 질소를 두드리는 조합으로 멤브레인 캐리어를 분리하여 금속을 플라스틱으로부터 분리하고, 면도날을 사용하여 멤브레인 캐리어 주변의 수지를 제거합니다. 분리하면 멤브레인 캐리어를 부드럽게 들어 올려 세포 펠릿 돔을 블록 의 얼굴에 남깁니다.노출된 셀 펠릿이 첫 번째 금형보다 약간 더 깊은 평평한 임베딩 몰드에 위쪽으로 향하는 블록을 놓고 수지 성분 A, B, C 및 D.폴리머를 섭씨 60도에서 24-36시간 동안 채웁니다. 면도날을 사용하여 셀 펠릿 주변의 블록을 다듬습니다. 그런 다음 초미세 토메의 단면 암에 샘플 척에 블록을 놓습니다.유리 나 다이아몬드 나이프를 사용하여, 밀접하게 세포 펠릿을 둘러싼 사다리꼴 모양으로 블록을 손질. 유리 또는 다이아몬드 나이프를 사용하여 세포 펠릿의 90 나노미터 초박면을 가져옵니다. TEM 그리드에서 섹션 리본을 선택합니다.필터 용지에 가장자리를 블로팅하여 그리드를 건조시키고 TEM 그리드 저장 상자에 보관합니다. TEM 홀더에 그리드를 마운트하고 현미경에 홀더를 배치합니다. 80킬로볼트에서 Tecnai T12를 사용하여 극저온APEX 샘플을 검사하십시오.APEX2 라벨링으로 관심 있는 세포 및 세포 극체 구조의 이미지를 획득합니다. 이 연구에서는, 전통적인 APEX 방법에 의한 견본의 준비는 조직되고 매끄러운 풍요로운 망상 구조물의 명확한 표시 귀착되었습니다. 높은 배율에서, 쌓인 막은 주름이 나타났고 동심 막 밀도 사이에 부균일한 간격이 존재하여 막 보존과 지질 추출이 불량했음을 나타냅니다.cryoAPEX에 의해 제조된 견본은 또한 조직되고 매끄러운 폐막 구조물의 명확하게 정의된 표시가 있었습니다, 그러나, 막은 매끄럽고 평행하고 거의 또는 전혀 지질 추출이 보였다. 90 나노미터 의 얇은 섹션의 TEM 분석은 헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E가 핵 봉투뿐만 아니라 말초 내피 성 망상 전체에 존재했다는 것을 밝혔다. 또한, 헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E 밀도는 발등 풍안성 망상 막을 따라 정기적으로 간격이 있는 초점으로 해결되었다.헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E 분포 및 포시는 또한 전통적인 고정 및 탈수로 제조된 견본에서 보였습니다. 그러나 광범위한 막 중단 및 추출이 존재하여 시료를 최적이 지않았다. APEX2 라벨링은 3개의 세포 마커를 사용하여 수행되었으며, 그 중 미토-V5-APEX2는 미토콘드리아만의 특정 염색을 제공했으며 CAAX-APEX2는 플라즈마 멤브레인의 뚜렷한 염색만을 생성하였다.세포 내 세포기관에서는 라벨이 관찰되지 않았습니다. 골지 루멘에 대한 염색은 또한 우리의 원래 Sengupta 외 원고에 설명된 바와 같이 알파 MAN2-APEX2 마커를 사용하여 평가되었다. 이 절차에 이어, 전자 단층 촬영 또는 집중 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사와 같은 3차원 방법은 관심 있는 단백질의 3D 분포를 조사하기 위해 수행될 수 있다.이 프로토콜에 사용되는 화학 물질의 대부분은 독성, 그래서 사용하기 전에, 안전 데이터 시트는 화학 물질이 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 처리되고 기관 지침에 따라 폐기되도록 협의되어야한다.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

연구

생물학

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

주사 전자 현미경으로 간 사인 내피 세포의 분석 및 그들의 Fenestrations위한 표준화 된 방법

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...