Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

Protokollen beskrevet her stammer fra en publikasjon av Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dette arbeidet støttes av tilskudd R01GM10092 (til S.M.) og AI081077 (R.V.S.) fra National Institutes of Health, CTSI-106564 (til S.M.) fra Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, og PI4D-209263 (til S.M.) fra Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.

1. Cellekultur og transfeksjon
<ol><li>Seed HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller større vev kultur parabolen og vokse til 60% -90% samløpet i en cellekultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.</li>
	<li>Transfect celler med APEX2-merket pattedyr uttrykk plasmids ved hjelp av transfection reagens (se Tabell av materialer) i henhold til produsentens retninger.</li>
	<li>Ved 12–15 timer etter transfeksjon vasker du celler én gang med fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern celler fra parabo...

CryoAPEX-protokollen som presenteres her gir en robust metode for å karakterisere lokaliseringen av membranproteiner i cellulært miljø. Ikke bare gir bruk av en genetisk kodet APEX2-tag presis lokalisering av et protein av interesse, men bruk av kryofiksering og lavtemperatur dehydrering gir utmerket bevaring og farging av den omkringliggende cellulære ultrastrukturen. Kombinert er disse tilnærmingene et kraftig verktøy for å lokalisere et protein med høy presisjon i sin subcellulære kontekst.
<p class="jove...

Biologiske studier inkluderer ofte spørsmål om å løse subcellulær protein lokalisering i celler og organeller. Immunofluorescence mikroskopi gir en nyttig lav oppløsning visning av protein lokalisering, og nylige fremskritt i super-oppløsning imaging presser grensene for oppløsning for fluorescerende merkede proteiner1,2,3. Elektronmikroskopi (EM) er imidlertid fortsatt gullstandarden for bildebehandling av høyoppløsnings cellulær ultrastruktur, selv om merking av proteiner er en utfordring.
Historisk har flere EM-metoder blitt brukt til å nærme seg spørsmål om ultrastrukturell proteinlokalisering. En av de mest brukte metodene er immunoelektronmikroskopi (IEM), hvor antigenspesifikke primære antistoffer brukes til å oppdage proteinet av interesse. EM-signal genereres ved påføring av sekundære antistoffer konjugert med elektrontette partikler, oftest kolloidalt gull4,5. Alternativt kan antistoffer konjugert med enzymer som hestereddik peroksidase (HRP) brukes til å produsere en elektrontett bunnfall6,7,8. To hovedtilnærminger finnes for IEM, kalt pre-embedding og post-embedding merking. I pre-embedding IEM, antistoffer innføres direkte i celler, noe som nødvendiggjør lys fiksering og permeabilisering av cellene9,10,11. Begge trinnene kan skade ultrastruktur12,13. Utvikling av betydelig mindre antistoffer bestående av et antistoff Fab fragment konjugert med 1,4 nm nanogold tillater svært milde permeabilization forhold som skal brukes; Nanogold er imidlertid for liten for direkte visualisering under TEM og krever ytterligere forbedringstrinn for å bli synlige14,15,16. I post-em- og etterem-innbygging brukes antistoffer på tynne deler av celler som er fullstendig behandlet ved fiksering, dehydrering og innebygging iharpiks 17. Selv om denne tilnærmingen unngår permeabiliseringstrinnet, er det utfordrende18,19,20. Tokuyasu-metoden for lysfiksering etterfulgt av frysing, kryosnitting og antistoffdeteksjon gir forbedret epitop bevaring21,22. Imidlertid er de tekniske kravene til kryo-ultramikrotomi, samt sub-optimal kontrast oppnådd i cellen, ulemper23.
Bruken av genetisk kodede koder eliminerer mange av vanskelighetene med IEM knyttet til påvisning av proteinet av interesse. En rekke koder er tilgjengelige, inkludert HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG og metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Hver av disse har fordeler fremfor tidligere metoder, men hver har også ulemper som hindrer utbredt bruk. Disse ulempene spenner fra inaktivitet av HRP i cytosol til den store størrelsen på ferritintagen, lysfølsomhet for ReAsH, og liten størrelse og mangel på kompatibilitet med cellulær farging av metallothionein. Nylig har et protein avledet fra ascorbate peroxidase blitt konstruert som en EM-tag, kalt APEX233,34. Som peroksidase kan APEX2 katalysere oksidasjonen av 3,3' diaminobenzidin (DAB), noe som produserer et stup som reagerer med osmiumtetroksid for å gi lokal EM-kontrast med minimal diffusjon fra proteinet av interesse (mindre enn 25 nm)33,35. I motsetning til tradisjonelle HRP-baserte metoder er APEX2 ekstremt stabil og forblir aktiv i alle cellulære rom33. Prøver kan behandles for TEM ved hjelp av tradisjonell EM-prøvefarging og metoder som tillater god visualisering av de omkringliggende strukturene33,34,36. På grunn av sin lille størrelse, stabilitet og allsidighet har APEX2 dukket opp som en EM-tag med stort potensial.
Mange av tilnærmingene som diskuteres ovenfor, kan heller ikke være eller ennå ikke har blitt kombinert med den nåværende toppmoderne i ultrastrukturell bevaring, kryofixation og lavtemperatur frysesubstitusjon. Dermed lider de av mangel på membranbevaring og / eller cellefarging for å bestemme nøyaktig proteinlokalisering. Dette begrenser nødvendigvis oppløsningen og tolkningen av dataene som kan oppnås. Cryofixation ved høytrykksfrysing (HPF) innebærer rask frysing av prøver i flytende nitrogen ved høyt trykk (~ 2100 bar), noe som forårsaker vitrifisering i stedet for krystallisering av vandige prøver, og dermed bevare celler i en nesten innfødt tilstand37,38,39. HPF etterfølges av frysesubstitusjon (FS), en lav temperatur (-90 °C) dehydrering i aceton kombinert med inkubasjon med typiske EM-flekker som osmiumtroksid og uranylacetat. HPF og FS sammen gir en klar fordel over tradisjonell kjemisk fiksering (en lengre prosess som kan føre til gjenstander) og alkoholdehydrering ved romtemperatur eller på is (noe som kan føre til ekstraksjon av lipider og sukker), og dermed er ønskelig å kombinere med de beste EM-kodene for proteindeteksjon.
En grunn til at HPF/FS ikke er kombinert med APEX2-merking, er at lett kjemisk fiksering er en forutsetning for peroksidasereaksjonen, noe som begrenser spredningen av DAB-reaksjonsproduktet. I APEX2-studier så langt etterfølges fiksering og peroksidasereaksjon av tradisjonelle EM-metoder for farging og alkoholdehydrering33,36. Det har imidlertid vist seg at etter kjemisk fiksering med HPF/FS gir en klar fordel i bevaring over tradisjonell kjemisk fiksering og alkoholdehydrering alene40. Tapet av ultrastrukturell integritet sett i tradisjonelle TEM-prøver ser mindre forbundet med fiksering enn til dehydrering, som vanligvis gjøres ved hjelp av alkohol ved romtemperatur eller på is, og kan føre til ekstraksjon av lipider og sukker40,41. For å utvikle cryoAPEX-metoden hypotetiserte vi at kjemisk fiksering og peroksidasereaksjon, etterfulgt av HPF og FS, ville gi et optimalt resultat når det gjelder ultrastrukturell bevaring.
Her presenterer vi cryoAPEX-protokollen, som kombinerer APEX2-merking med kryofixation og frysesubstitusjonsmetoder (Figur 1). Denne enkle protokollen består av transfection av et APEX2-merket protein av interesse, kjemisk fiksering av celler og peroksidasereaksjonen. HPF og FS utføres deretter etterfulgt av typisk resin innebygging og tynn snitting. TEM imaging avslører utmerket bevaring av ultrastruktur ved hjelp av denne metoden. I tillegg ble høyoppløsnings subcellulær lokalisering og romlig fordeling av et endoplasmatisk reticulum (ER) lumenalprotein observert. Denne metoden er allment nyttig for påvisning av membranproteinlokalisering i celler for elektronmikroskopianalyse. I våre hender har metoden fungert vellykket for en rekke cellelinjer dyrket i vevskultur, inkludert HEK-293T (human embryonal nyre), HeLa (menneskelig livmorhalskreft), Cos7 (afrikansk grønn ape nyre fibroblast), og BHK (baby hamster nyre). Detaljerte instruksjoner er beskrevet nedenfor ved hjelp av HEK-293T celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Viktige cellulære hendelser som signaltransduksjon og membranhandel er avhengig av riktig proteinplassering i cellulære rom. Å forstå presis subcellulær lokalisering av proteiner er derfor viktig for å svare på mange biologiske spørsmål. Jakten på en robust etikett for å identifisere proteinlokalisering kombinert med tilstrekkelig cellulær bevaring og farging har vært historisk utfordrende. Nylige fremskritt innen elektronmikroskopi (EM) bildebehandling har ført til utvikling av mange metoder og strategier for å øke cellulær bevaring og merke målproteiner. En relativt ny peroxidase-basert genetisk tag, APEX2, er en lovende leder i kloneable EM-aktive koder. Prøveforberedelse for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) har også avansert de siste årene med bruk av gråtofixasjon ved høytrykksfrysing (HPF) og lavtemperaturdehydrering og farging via frysesubstitusjon (FS). HPF og FS gir utmerket bevaring av cellulær ultrastruktur for TEM-avbildning, andre bare for å direkte kryo-avbildning av glassholdige prøver. Her presenterer vi en protokoll for cryoAPEX-metoden, som kombinerer bruken av APEX2-koden med HPF og FS. I denne protokollen er et protein av interesse merket med APEX2, etterfulgt av kjemisk fiksering og peroksidasereaksjon. I stedet for tradisjonell farging og alkoholdehydrering ved romtemperatur, er prøven kryofikset og gjennomgår dehydrering og flekker ved lav temperatur via FS. Ved hjelp av cryoAPEX kan ikke bare et protein av interesse identifiseres i subcellulære rom, men også ytterligere informasjon kan løses med hensyn til topologien i en strukturelt bevart membran. Vi viser at denne metoden kan gi høy nok oppløsning til å tyde proteinfordelingsmønstre i en organellelumen, og for å skille sammenkupéiseringen av et protein i en organelle i nærheten av andre umerkede organeller. Videre er cryoAPEX prosedyremessig grei og mottagelig for celler dyrket i vevskultur. Det er ikke mer teknisk utfordrende enn typisk kryofixation og fryse substitusjonsmetoder. CryoAPEX er allment anvendelig for TEM-analyse av membranprotein som kan være genetisk merket.

For å sammenligne den ultrastrukturelle bevaringen ved hjelp av kryoAPEX-metoden med tradisjonell fiksering og dehydrering, forberedte vi prøver der en endoplasmatisk reticulummembran (ERM; ER membran) peptid ble merket med APEX2 og transfected til HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserer til det cytoplasmatiske ansiktet til ER og ommodellerer ER-strukturen til morfologisk distinkte strukturer kjent som organisert glatt ER (OSER)34,42,<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Denne protokollen beskriver cryoAPEX-metoden, der et APEX2-merket membranprotein kan lokaliseres ved overføring elektronmikroskopi innenfor optimalt bevart celleultrastruktur.

CryoAPEX-metoden for elektronmikroskopianalyse av membranproteinlokalisering innenfor ultrastrukturelt bevarte celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Denne metoden kombinerer evnen til å flekke for et membranprotein samtidig som membranintegriteten og subcellulær arkitektur bevares. Så det er veldig kraftig for nettopp å lokalisere en membran assosiert protein. Den største fordelen med denne teknikken er at den kombinerer bruken av en robust genetisk klonebar tag, APEX2, med toppmoderne metoder i cellulær bevaring for elektronmikroskopi, inkludert kryofixation og fryseerstatning.Sammen tillater disse presis protein lokalisering i en godt bevart celle. Denne protokollen kan brukes til å dissekere mekanismer som virus replikerer inne i vertscellen. Virus vil ofte kapre vertsproteiner under infeksjonsordningen.Virus er de små genomene, som de bruker til å replikere inne i disse vertscellene. Nylig har vi vært i stand til å i upubliserte data, merke disse proteinene ved hjelp av denne teknologien for å forstå hvordan virus replikerer. Denne teknikken viste seg å være svært kritisk i en nylig samarbeidsstudie om et bakteriell toksin som forårsaker golgisammenbrudd.Ved hjelp av cryoAPEX kunne vi nøyaktig lokalisere toksinet med de fragmenterte golgibitene, noe som var veldig vanskelig å se ellers ved hjelp av normale immunofluorescence teknikker. Viser denne teknikken vil være Elaine Mihelc, en utdannet student, og forskningsmedarbeider, Stephanie Angel, fra våre laboratorier. Etter såing HEK293 celler i parabolen, transfect cellene med APEX2 tagget pattedyr uttrykk plasmids ved hjelp av transfection reagens i henhold til produsentens retninger.Ved 12-15 timer etter transinfeksjon, vask cellene en gang med PBS. Deretter vasker du av cellene med PBS fra parabolen til et 15 milliliter konisk rør. Sentrifuge ved 500 x g i fem minutter.Fjern forsiktig supernatanten og re-suspendere pellet i to milliliter på 2% glutaraldehyd og 0,1 molar natriumkacodylatbuffer ved pH 7.4 ved romtemperatur. Plasser prøven på isen for å inkubere i 30 minutter. Deretter pellet prøven på 500 x g i fem minutter ved fire grader Celsius.Vask pelleten tre ganger i fem minutter hver med to milliliter på 0,1 molar natriumkacodylatbuffer ved å sentrifugere ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering, fjern supernatanten. For å utføre peroksidasereaksjonen, vask pelleten ved å re-suspendere i tre milliliter DAB-løsning etterfulgt av pelleting ved 500 x g i fem minutter.Deretter, re-suspendere pellet i tre milliliter dab løsning med 5,88 millimolar hydrogenperoksid. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Pelleten blir synlig brunfarget, noe som indikerer tilstedeværelsen av det uoppløselige DAB-reaksjonsproduktet.Etter vask igjen med natriumkacodylatbuffer i DMEM, ifølge manuskriptet, re-suspendere cellepellet i 500 mikroliter av en kryobeskyttende løsning av DMEM som inneholder 10% fosterbovin serum og 15% storfe serum albumin. Overfør cellefjæringen til et 0,5 milliliter mikrocentrifugerør. Pellet igjen, noe øke sentrifuge hastighet fra 500 x g.Kast mesteparten av det overnaturlige, og sørg for at nok væske er igjen slik at pelleten ikke tørker ut. Vek bort eventuell gjenværende væske fra cellepelleten ved hjelp av hjørnet av en laboratorieserviett eller papirhåndkle. La nok væske forbli at pellet danner en pasta, lignende i konsistens til tannkrem.Aspirer to til tre mikroliter av cellepelleten og deponer den på en membranbærer. Fyll brønnen til membranbæreren helt slik at overflatespenningen skaper en liten kuppel på toppen. Skyv membranholderen inn i sylinderampullen og fest den.Plasser kassetten i HPF-maskinen som er klargjort og primet, og trykk på start for å fryse. Hold patronene nedsenket i flytende nitrogen, fjern membranbæreren fra sylinderampullen. Legg den i en plastkapsel og legg plastkapselen i en Kryovial full av flytende nitrogen.I en kjemisk hette, lag en milliliter per prøve av løsningen på 0,2% vekt ved volum tanninsyre og 5% DI vann i aceton i en Cryovial. Legg dem i flytende nitrogen for å fryse. Plasser frysesubstitusjonsblandingen ett hetteglass og kryovialene som inneholder de frosne cellepelletsene i prøvekammeret for frysesubstitusjonsenheter.Overfør den indre kapselen som inneholder membranbæreren fra det flytende nitrogen hetteglasset til det tilsvarende hetteglasset som inneholder frysesubstitusjonsblanding en. Start en fryseerstatningsprotokoll ved 90 grader Celsius. Etter 24 timer, pause frysesubstitusjonen og vask prøvene tre ganger i fem minutter med aceton som er avkjølt til 90 grader Celsius.Deretter, i en kjemisk hette, forberede en milliliter per prøve av en løsning på 1% osmium tetroxide, 0,2% uranylacetat, og 5% DI vann i aceton i en Cryovial og plassere dem i flytende nitrogen for å fryse. Plasser Cryovials med frysesubstitusjonsblandingen to i frysesubstitusjonsenheten og overfør kapslene fra den tredje acetonvasken inn i frysesubstitusjonsblandingen to hetteglass. Inkuber dem og fryse substitusjon bland to i 72 timer ved 90 grader Celsius, etterfulgt av gradvis oppvarming til null grader Celsius over 12-18 timer.Hold temperaturen ved null grader Celsius og legg til forhåndskjølt aceton i hetteglassene for å vaske tre ganger i 10 minutter hver. Forbered en harpiksblanding av valg i et plastbeger i henhold til produsentens retninger og tilsett 2%4% og 8% av harpiks i hetteglassene for å senke kapslene. Inkuber i to timer hver ved null grader Celsius.Deretter inkubere i 15%30%60%90%og 100% harpiks komponenter av A, B og D bare i fire timer hver ved romtemperatur. Etter 20 timer, forberede en blanding av harpiks komponenter A, B, C, og D og inkubere i fire timer. Plasser membranbærerne med cellepellet side opp i flate innebyggingsformer og fyll med harpiksblanding A, B, C og D.Plasser dem i en ovn for å polymerisere ved 60 grader Celsius i 24-36 timer.Etter polymerisering fjerner du blokkene fra formen og plasserer prøven i den vertikale chucken av ultramikrotomen der den kan visualiseres med forstørrelse. Skill membranbæreren fra blokken med en kombinasjon av dabbing flytende nitrogen på membranbæreren for å skille metallet fra plasten, og bruk et barberblad til å chippe bort harpiksen rundt membranbæreren. Når den er separert, løft forsiktig bort membranbæreren, og la cellepelletkuppelen stå på forsiden av blokken.Plasser blokken med den eksponerte cellepelleten vendt oppover i en flat innebyggingsform som er litt dypere enn den første formen og fyll med harpikskomponenter A, B, C og D.Polymerize ved 60 grader Celsius i 24-36 timer. Trim blokken rundt cellepellet ved hjelp av et barberblad. Plasser deretter blokken i prøves chucken på snittearmen til en ultramikrotom.Bruk et glass eller en diamantkniv til å trimme blokken i en trapesformet form tett rundt cellepelleten. Få 90 nanometer ultra tynne deler av cellepellet ved hjelp av et glass eller en diamantkniv. Plukk opp et bånd med inndelinger i et TEM-rutenett.Tørk gitteret ved å tørke kanten på et filterpapir og oppbevar det i en TEM-lagringsboks. Monter gitteret på TEM-holderen og plasser holderen i mikroskopet. Bruk en Tecnai T12 ved 80 kilovolt for screening av kryoAPEX-prøver.Hent bilder av celler og subcellulære strukturer av interesse med APEX2 merking. I denne studien resulterte utarbeidelse av prøven ved tradisjonelle APEX-metoder i klar merking av organiserte, glatte endoplasmatiske retikuulumstrukturer. Ved høy forstørrelse, stablet membraner dukket ruffled og ikke-ensartede hull var til stede mellom konsentriske membran tettheter, noe som indikerer dårlig membran bevaring og lipid utvinning.Prøven utarbeidet av cryoAPEX hadde også klart definert merking av organiserte, glatte endoplasmatiske reticulum strukturer, men membranene var glatte og parallelle og lite eller ingen lipid ekstraksjon ble sett. TEM-analyse av 90 nanometer tynne seksjoner viste at Huntington gjær interagerende protein E var til stede i hele perifere endoplasmaiske retikuulum samt kjernefysisk konvolutt. I tillegg ble Huntington gjær interagerende protein E tetthet løst til regelmessig fordelt foci langs luminal endoplasmic reticulum membran.Huntington gjær interagerende protein E distribusjon og foci var også synlig i en prøve utarbeidet med tradisjonell fiksering og dehydrering. Imidlertid var omfattende membranavbrudd og ekstraksjon til stede, noe som gjorde prøven suboptimal. APEX2-merking ble utført ved hjelp av tre cellulære markører, hvorav mito-V5-APEX2 kun ga spesifikk farging av mitokondrier og CAAX-APEX2 produserte tydelig farging av plasmamembranen.Ingen merking ble observert i intracellulære organeller. Farging for golgi lumen ble også vurdert ved hjelp av en Alpha MAN2-APEX2 markør som beskrevet i vår opprinnelige Sengupta et al manuskript. Etter denne prosedyren kan tredimensjonale metoder som elektrontomografi eller fokusert iionstråleskanning av elektronmikroskopi utføres for å undersøke 3D-fordelingen av et protein av interesse.Mange av kjemikaliene som brukes i denne protokollen er giftige, så før bruk bør sikkerhetsdatablad konsulteres for å sikre at kjemikaliene håndteres ved hjelp av riktig personlig verneutstyr og avhendes i henhold til institusjonelle retningslinjer.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Protein Lokalisering Bruke Photo-aktivert Lokalisering Mikroskopi og elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardisert metode for analyse av Liver Sinus endotelceller og deres Fenestrations ved scanning elektronmikroskopi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Studerer Supramolecular Organisering av foto Membraner innen Freeze frakturerte Leaf Vev av Cryo-scanning elektronmikroskopi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Multi-farge lokalisering mikroskopi enkelt membran proteiner i Organelles av Live pattedyrceller

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske utvalg forberedelse av høytrykks fryser, mikrobølgeovn-assistert kontrast ekstrautstyr og Minimal harpiks innebygging volum Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Cryo-Electron mikroskopisk nettforberedelse for tidsavklarte studier ved hjelp av et nytt robotsystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategier for optimalisering av kryogene elektrontomografidatainnhenting

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Bildereplikatoriske domener i ultrastrukturelt bevart kromatin av elektrontomografi

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...