Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

O protocolo aqui descrito decorre de uma publicação de Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs22315 (2019)48. Este trabalho é apoiado por subsídios R01GM10092 (para S.M.) e AI081077 (R.V.S.) dos Institutos Nacionais de Saúde, CTSI-106564 (para S.M.) do Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, e PI4D-209263 (to S.M.) do Instituto purdue university de inflamação, imunologia, imunologia e doença infecciosa.

1. Cultura Celular e Transfecção
<ol><li>As células HEK-293T de sementes em um prato de 60 mm de diâmetro ou cultura tecidual maior e crescem para 60% a 90% de confluência em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Células transfect com plasmídeos de expressão mamífero com apex2 com marca ção de forma ativa da transfecção usando reagente transfection (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Às 12 h e 15 h após a...

O protocolo crioAPEX aqui apresentado fornece um método robusto para caracterizar a localização das proteínas da membrana dentro do ambiente celular. Não só o uso de uma tag APEX2 geneticamente codificada fornece localização precisa de uma proteína de interesse, mas o uso de criofixação e desidratação de baixa temperatura proporciona excelente preservação e coloração da ultraestrutura celular circundante. Combinados, essas abordagens são uma poderosa ferramenta para localizar uma proteína com alta prec...

Estudos biológicos muitas vezes incluem questões de resolução de localização de proteínasubcelular dentro de células e organelas. A microscopia de imunofluorescência fornece uma visão útil de baixa resolução da localização de proteínas, e os recentes avanços na imagem de superresolução estão empurrando os limites de resolução para proteínas fluorescentesmarcadas 1,2,3. No entanto, a microscopia eletrônica (EM) continua sendo o padrão-ouro para a ultraestrutura celular de alta resolução por imagem, embora a rotulagem de proteínas seja um desafio.
Historicamente, vários métodos EM têm sido usados para abordar questões de localização de proteínas ultraestruturais. Um dos métodos mais utilizados é a microscopia imunoeletrônica (IEM), onde anticorpos primários específicos de antígeno são usados para detectar a proteína de interesse. O sinal EM é gerado pela aplicação de anticorpos secundários conjugados com partículas densas eletrônicas, mais comumente ouro coloidal4,5. Alternadamente, anticorpos conjugados com enzimas como peroxidase de rabanete de cavalo (HRP) podem ser usados para produzir um precipitado elétron-denso6,7,8. Existem duas abordagens principais para o IEM, denominada rotulagem pré-incorporação e post-incorporação. Na pré-incorporação do IEM, os anticorpos são introduzidos diretamente nas células, o que requer fixação de luz e permeabilização das células9,10,11. Ambas as etapas podem danificar a ultraestrutura12,13. O desenvolvimento de anticorpos significativamente menores que consistem em um fragmento fab anticorpo conjugado com nanogold de 1,4 nm permite que condições muito suaves de permeabilização sejam usadas; no entanto, o nanogold é muito pequeno para visualização direta TEM e requer passos adicionais de aprimoramento para se tornar visível14,15,16. No IEM pós-incorporação, os anticorpos são aplicados em finas seções de células que foram totalmente processadas por fixação, desidratação e incorporação em resina17. Embora essa abordagem evite a etapa de permeabilização, preservar o epítopo de interesse ao longo da preparação da amostra é desafiador18,19,20. O método tokuyasu de fixação de luz seguido de congelamento, seção crio-seccional e detecção de anticorpos fornece melhor preservação de epitope21,22. No entanto, os requisitos técnicos da crio-ultramicrotomia, bem como o contraste abaixo do ideal alcançado na célula, são desvantagens23.
O uso de tags geneticamente codificadas elimina muitas das dificuldades do IEM relacionadas à detecção da proteína de interesse. Estão disponíveis uma variedade de tags, incluindo HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Cada um deles tem vantagens em relação aos métodos anteriores, mas cada um também tem desvantagens impedindo o uso generalizado. Essas desvantagens vão desde a inatividade de HRP no citosol até o grande tamanho da tag de ferritina, sensibilidade à luz do ReAsH, e tamanho pequeno e falta de compatibilidade com a coloração celular de metallothioneina. Recentemente, uma proteína derivada da peroxidase ascorbate foi projetada como uma tag EM, chamada APEX233,34. Como peroxidase, o APEX2 pode catalisar a oxidação de 3,3' diaminobenzidina (DAB), produzindo um precipitado que reage com tetróxido de osmômio para fornecer contraste EM local com difusão mínima da proteína de interesse (menos de 25 nm)33,35. Ao contrário dos métodos tradicionais baseados em HRP, o APEX2 é extremamente estável e permanece ativo em todos os compartimentos celulares33. As amostras podem ser processadas para TEM usando a coloração tradicional da amostra EM e métodos que permitem uma boa visualização das estruturas circundantes33,34,36. Devido ao seu pequeno tamanho, estabilidade e versatilidade, a APEX2 emergiu como uma tag EM com grande potencial.
Muitas das abordagens discutidas acima não podem ser ou ainda não foram combinadas com o estado atual da arte em preservação ultraestrutural, criofixação e substituição de congelamento de baixa temperatura. Assim, sofrem com a falta de preservação da membrana e/ou coloração celular para determinar a localização precisa das proteínas. Isso limita necessariamente a resolução e interpretação dos dados que podem ser obtidos. A criofixação por congelamento de alta pressão (HPF) envolve o congelamento rápido de amostras em nitrogênio líquido a uma alta pressão (~2.100 bar), o que causa vitrificação em vez de cristalização de amostras aquosas, preservando assim células em um estado quase nativo37,38,39. O HPF é seguido por substituição de congelamento (FS), uma desidratação de baixa temperatura (-90 °C) em acetona combinada com incubação com manchas típicas em como tetróxido de osmó e acetato de uranyl. HPF e FS juntos fornecem uma vantagem distinta sobre a fixação química tradicional (um processo mais longo que pode levar a artefatos) e desidratação alcoólica à temperatura ambiente ou no gelo (o que pode levar à extração de lipídios e açúcares), e, portanto, são desejáveis para combinar com as melhores tags EM para detecção de proteínas.
Uma das razões pelas quais o HPF/FS não foi combinado com a rotulagem APEX2 é que a fixação química leve é um pré-requisito para a reação peroxidase, limitando a difusão do produto de reação DAB. Nos estudos da APEX2 até agora, a fixação e a reação peroxidase são seguidas pelos métodos tradicionais em para coloração e desidratação alcoólica33,36. No entanto, mostrou-se que após a fixação química com o HPF/FS fornece uma vantagem distinta na preservação sobre a fixação química tradicional e a desidratação do álcool sozinha40. A perda de integridade ultraestrutural vista em amostras tradicionais de TEM parece menos ligada à fixação do que à desidratação, que normalmente é feita usando álcool à temperatura ambiente ou no gelo, e pode levar à extração de lipídios e açúcares40,41. Para desenvolver o método crioAPEX, suporam que a fixação química e a reação peroxidase, seguida séfeio e FS, produziriam um resultado ideal em termos de preservação ultraestrutural.
Aqui apresentamos o protocolo crioAPEX, que combina marcação APEX2 com métodos de criofixação e congelamento de métodos de substituição(Figura 1). Este protocolo simples consiste na transfecção de uma proteína de interesse apex2 marcada, fixação química das células e reação peroxidase. HPF e FS são então realizados seguidos de incorporação típica de resina e secção fina. A imagem TEM revela excelente preservação da ultraestrutura usando esse método. Além disso, observou-se localização subcelular de alta resolução e distribuição espacial de uma proteína lumenal de retículo endoplasmático (ER). Este método é amplamente útil para detecção da localização da proteína da membrana dentro das células para análise de microscopia eletrônica. Em nossas mãos, o método tem trabalhado com sucesso para uma variedade de linhas celulares cultivadas na cultura tecidual, incluindo HEK-293T (rim embrionário humano), HeLa (câncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de macaco verde africano) e BHK (rim de hamster bebê). Instruções detalhadas são descritas abaixo usando células HEK-293T.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Eventos celulares-chave como transdução de sinal e tráfico de membrana dependem da localização adequada da proteína dentro dos compartimentos celulares. Compreender a localização subcelular precisa das proteínas é, portanto, importante para responder a muitas questões biológicas. A busca por um rótulo robusto para identificar a localização de proteínas combinada com a preservação e a coloração adequadas do celular tem sido historicamente desafiadora. Os recentes avanços nas imagens de microscopia eletrônica (EM) levaram ao desenvolvimento de muitos métodos e estratégias para aumentar a preservação celular e rotular proteínas alvo. Uma tag genética relativamente nova baseada em peroxidase, APEX2, é um líder promissor em etiquetas em ativas em clones. A preparação amostral para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) também avançou nos últimos anos com o advento da criofixação por congelamento de alta pressão (FpE) e desidratação e coloração de baixa temperatura via substituição de congelamento (FS). O HPF e o FS proporcionam excelente preservação da ultraestrutura celular para imagens TEM, perdendo apenas para direcionar a crio-imagem de amostras vívidas. Aqui apresentamos um protocolo para o método crioAPEX, que combina o uso da tag APEX2 com HPF e FS. Neste protocolo, uma proteína de interesse é marcada com APEX2, seguida de fixação química e reação peroxidase. No lugar da tradicional coloração e desidratação alcoólica à temperatura ambiente, a amostra é criofixada e sofre desidratação e coloração em baixa temperatura via FS. Usando crioAPEX, não só uma proteína de interesse pode ser identificada dentro de compartimentos subcelulares, mas também informações adicionais podem ser resolvidas em relação à sua topologia dentro de uma membrana estruturalmente preservada. Mostramos que este método pode fornecer alta resolução suficiente para decifrar padrões de distribuição de proteínas dentro de um lumen organela, e distinguir a compartimentação de uma proteína dentro de uma organela próxima a outras organelas não rotuladas. Além disso, o crioAPEX é processualmente simples e incapacitado para células cultivadas na cultura tecidual. Não é mais tecnicamente desafiador do que métodos típicos de criofixação e congelamento de substituição. O CrioAPEX é amplamente aplicável para análise de TEM de qualquer proteína de membrana que possa ser geneticamente etiquetada.

Para comparar a preservação ultraestrutural utilizando o método crioAPEX com fixação e desidratação tradicionais, preparamos amostras em que uma membrana retícula endoplasmática (ERM; O peptídeo da membrana ER foi marcado com APEX2 e transfecdo em células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza a face citoplasmática do PS e remodela a estrutura ER em estruturas morfologicamente distintas conhecidas como ER (OSER)34,42,43. A mor...

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The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Este protocolo descreve o método crioAPEX, no qual uma proteína de membrana com etiqueta APEX2 pode ser localizada por microscopia eletrônica de transmissão dentro da ultraestrutura celular idealmente preservada.

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Este método combina a capacidade de coloração para uma proteína de membrana, preservando também a integridade da membrana e a arquitetura subcelular. Então é realmente poderoso para localização precisamente de uma proteína associada à membrana. A principal vantagem desta técnica é que combina o uso de uma marca geneticamente clonável robusta, APEX2, com métodos de última geração na preservação celular para microscopia eletrônica, incluindo criofixação e substituição de congelamento.Juntos, estes permitem uma localização precisa de proteínas dentro de uma célula bem preservada. Este protocolo pode ser usado para dissecar mecanismos pelos quais os vírus se replicam dentro da célula hospedeira. Vírus muitas vezes sequestram proteínas hospedeiras durante seu esquema de infecção.Vírus são os pequenos genomas, que eles utilizam para se replicar dentro dessas células hospedeiras. Recentemente, conseguimos, em dados inéditos, rotular essas proteínas usando essa tecnologia para entender como os vírus se replicam. Essa técnica mostrou-se realmente crítica em um estudo colaborativo recente sobre uma toxina bacteriana que causa a quebra do golgi.Usando crioAPEX, conseguimos localizar precisamente a toxina com as peças de golgi fragmentadas, algo que era realmente difícil de ver usando técnicas normais de imunofluorescência. Demonstrando essa técnica estará Elaine Mihelc, estudante de pós-graduação, e a pesquisadora Stephanie Angel, de nossos laboratórios. Depois de semear células HEK293 no prato, transfeme as células com plasmídeos de expressão de mamíferos marcados APEX2 usando reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.Às 12-15 horas após a transfecção, lave as células uma vez com PBS. Em seguida, lave as células com PBS do prato em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar a 500 x g por cinco minutos.Remova cuidadosamente o tampão de cacodilato de sódio supernante e suspenda a pelota em dois mililitros de 2%glutaraldeído e 0,1 tampão de cacodilato de sódio molar a pH 7,4 à temperatura ambiente. Coloque a amostra no gelo para incubar por 30 minutos. Em seguida, pelota a amostra a 500 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius.Lave a pelota três vezes por cinco minutos cada com dois mililitros de 0,1 amortecedor de cacodilato de sódio molar por centrifugação a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o supernante. Para realizar a reação peroxidase, lave a pelota suspendendo-a em três mililitros de solução DAB seguida de pelotização a 500 x g por cinco minutos.Em seguida, suspenda novamente a pelota em três mililitros de solução DAB com peróxido de hidrogênio de 5,88 mililitros. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. A pelota torna-se visivelmente de cor marrom, indicando a presença do produto de reação DAB insolúvel.Depois de lavar novamente com tampão de cacodilato de sódio no DMEM, de acordo com o manuscrito, suspenda novamente a pelota celular em 500 microliters de uma solução crioprotetora de DMEM contendo soro bovino 10% fetal e 15% de albumina de soro bovino bovino. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Pelota novamente, aumentando ligeiramente a velocidade da centrífuga de 500 x g.Descarte a maioria do supernante, garantindo que restasse líquido suficiente para que a pelota não seque. Retire qualquer líquido restante da pelota da célula usando o canto de uma toalha de laboratório ou papel toalha. Deixe que o líquido suficiente permaneça que a pelota forme uma pasta, semelhante em consistência à pasta de dente.Aspire de dois a três microliters da pelota celular e deposite-a em um portador de membrana. Encha completamente o poço do portador da membrana para que a tensão superficial crie uma pequena cúpula em cima. Deslize o porta-membrana para dentro do cartucho e fixe.Coloque o cartucho na máquina HPF que foi preparada e preparada e pressione comece a congelar. Mantendo os cartuchos imersos em nitrogênio líquido, remova o porta-membranas de seu cartucho. Coloque em uma cápsula de plástico e coloque a cápsula de plástico em um Criovial cheio de nitrogênio líquido.Em uma capa química, prepare um mililitro por amostra da solução de 0,2% de peso por volume de ácido tânnico e 5% dI em acetona em um Cryovial. Coloque-os em nitrogênio líquido para congelar. Coloque a mistura de substituição de congelamento um frasco e os Criovias contendo as pelotas de célula congelada na câmara de amostra das unidades de substituição de congelamento.Transfira a cápsula interna contendo o portador da membrana do frasco de nitrogênio líquido para o frasco correspondente contendo mistura de substituição de congelamento. Inicie um protocolo de substituição de congelamento a 90 graus Celsius. Após 24 horas, pausa a substituição do congelamento e lave as amostras três vezes por cinco minutos com acetona que foi resfriada a 90 graus Celsius.Em seguida, em uma capa química, prepare um mililitro por amostra de uma solução de 1%tetroxida de 1%osmium, acetato de 0,2%uranyl e 5% dI em acetona em um Cryovial e coloque-os em nitrogênio líquido para congelar. Coloque os Criovias com a mistura de substituição de congelamento dois na unidade de substituição de congelamento e transfira as cápsulas da terceira lavagem de acetona para a mistura de substituição de congelamento dois frascos. Incuba-os e congela a mistura de substituição dois por 72 horas a 90 graus Celsius, seguido de aquecimento gradual para zero graus Celsius ao longo de 12-18 horas.Mantenha a temperatura em zero graus Celsius e adicione acetona pré-resfriada nos frascos para lavar três vezes por 10 minutos cada. Prepare uma mistura de resina de escolha em um béquer plástico de acordo com as instruções do fabricante e adicione 2%4% e 8% de resina nos frascos para imergir as cápsulas. Incubar por duas horas cada um a zero graus Celsius.Em seguida, incubar em 15%30%60%90% e 100% componentes de resina de A, B e D apenas por quatro horas cada a temperatura ambiente. Após as 20 horas, prepare uma mistura de componentes de resina A, B, C e D e incubar por quatro horas. Coloque os portadores de membrana com pelotas celulares lado para cima em moldes planos de incorporação e encha com mistura de resina A, B, C e D.Coloque-os em um forno para polimerizar a 60 graus Celsius por 24-36 horas.Após a polimerização, remova os blocos do molde e coloque a amostra no mandril vertical do ultra microtoma onde pode ser visualizado com ampliação. Separe o portador da membrana do bloco por uma combinação de nitrogênio líquido na membrana para separar o metal do plástico, e usando uma lâmina de barbear para cortar a resina ao redor do portador da membrana. Quando separado, levante suavemente o portador da membrana, deixando a cúpula de pelotas de célula na face do bloco.Coloque o bloco com a pelota de célula exposta voltada para cima em um molde de incorporação plana que é ligeiramente mais profundo do que o primeiro molde e preencha com os componentes de resina A, B, C e D.Polymerize a 60 graus Celsius por 24-36 horas. Corte o bloco ao redor da pelota da célula usando uma lâmina de barbear. Em seguida, coloque o bloco no mandril de amostra no braço de secção de um ultra microtoma.Usando uma faca de vidro ou diamante, corte o bloco em uma forma trapezoidal perto da pelota celular. Obtenha 90 seções ultra finas de nanômetros da pelota celular usando uma faca de vidro ou diamante. Pegue uma fita de seções em uma grade TEM.Seque a grade manchando a borda em um pedaço de papel filtro e armazene-a em uma caixa de armazenamento de grade TEM. Monte a grade no suporte TEM e coloque o suporte no microscópio. Use um Tecnai T12 a 80 kilovolts para triagem de amostras crioAPEX.Adquira imagens de células e estruturas subcelulares de interesse com rotulagem APEX2. Neste estudo, a preparação da amostra pelos métodos tradicionais de APEX resultou em rotulagem clara de estruturas de órticulo endoplasmático organizados e suaves. Na alta ampliação, as membranas empilhadas pareciam babadas e lacunas não uniformes estavam presentes entre densidades de membrana concêntrica, indicando má preservação da membrana e extração lipídica.A amostra preparada pela crioAPEX também tinha rotulagem claramente definida de estruturas de rétilum organizado e suave, porém, as membranas eram lisas e paralelas e pouco ou nenhuma extração lipídica foi vista. A análise tem de 90 nanômetros de seções finas revelou que a proteína interativa de levedura huntington E estava presente em todo o tiquelum endoplasmático periférico, bem como o envelope nuclear. Além disso, a densidade de proteína interativa da levedura huntington E foi resolvida em focos regularmente espaçados ao longo da membrana endoplasmática luminal.A distribuição e os focos de proteína e proteína de Huntington também foram visíveis em uma amostra preparada com fixação e desidratação tradicionais. No entanto, foram presentes extensas interrupções e extrações de membrana, tornando a amostra subótima. A rotulagem APEX2 foi realizada utilizando-se três marcadores celulares, dos quais mito-V5-APEX2 forneceu uma coloração específica apenas de mitocôndrias e CAAX-APEX2 produziu uma coloração distinta apenas da membrana plasmática.Não foi observada rotulagem em organelas intracelulares. A coloração do lúmen golgi também foi avaliada usando um marcador Alpha MAN2-APEX2, conforme descrito em nosso manuscrito sengupta et al original. Após este procedimento, métodos tridimensionais como tomografia eletrônica ou microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focalizada podem ser realizados a fim de investigar a distribuição 3D de uma proteína de interesse.Muitos dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos, por isso, antes do uso, as folhas de dados de segurança devem ser consultadas para garantir que os produtos químicos sejam manuseados usando equipamentos de proteção individual adequados e descartados de acordo com as diretrizes institucionais.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: localização de proteínas usando a foto-ativada Microscopia Localização e Microscopia Eletrônica

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Biologia

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

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