Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

Описанный здесь протокол вытекает из публикации Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Эта работа поддерживается грантами R01GM10092 (для S.M.) и AI081077 (R.V.S.) от Национальных институтов здравоохранения, CTSI-106564 (до S.M.) от Института клинических и трансляционных наук Индианы, и PI4D-209263 (до S.M.) от Института клинического и клинического заболевания.

1. Культура клеток и трансфекция
<ol><li>Семена HEK-293T клетки на 60 мм в диаметре или больше ткани культуры блюдо и расти до 60%-90% слияния в инкубаторе клеточной культуры на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.</li>
	<li>Трансфектные клетки с apEX2-тегами плазмиды выражения млекопитающих с использовани?...

Представленный здесь протокол криоаПЕКС обеспечивает надежный метод для характеристики локализации мембранных белков в клеточной среде. Мало того, что использование генетически закодированного тега APEX2 обеспечивает точную локализацию интересующего белка, но и использование криофи?...

Биологические исследования часто включают в себя вопросы решения субклеточной локализации белка в клетках и органеллах. Иммунофлуоресцентная микроскопия обеспечивает полезное представление с низким разрешением локализации белка, и последние достижения в области визуализации супер-разрешения толкают границы разрешения для флуоресцентно помеченных белков1,2,3. Тем не менее, электронная микроскопия (EM) остается золотым стандартом для визуализации с высоким разрешением клеточной ультраструктуры, хотя маркировка белков является сложной задачей.
Исторически сложилось так, что некоторые методы EM были использованы для того чтобы причалить вопросам ультраструктурной локализации протеина. Одним из наиболее часто используемых методов является иммуноэлектронная микроскопия (IEM), где антиген-специфические первичные антитела используются для обнаружения белка, представляющих интерес. Сигнал EM генерируется применением вторичных антител, спряженных с электрон-плотными частицами, чаще всего коллоидным золотом4,5. Кроме того, антитела, спряженные с ферментами, такими как переоксидаза редиса (HRP), могут быть использованы для производства электронного плотного осадка6,7,8. Существуют два основных подхода к маркировке IEM, называемые предварительновнедентиями и поствстранительной маркировкой. В предварительном встраивании IEM, антитела вводятся непосредственно в клетки, что требует световой фиксации и промежности клеток9,10,11. Оба шага могут повредить ультраструктуру12,13. Разработка значительно меньших антител, состоящих из фрагмента антитела Fab, спряженого с 1,4 нм наноголдом, позволяет использовать очень нежные условия промеаблизации; однако, nanogold слишком мал для сразу визуализации под TEM и требует дополнительных шагов повышения, чтобы стать видимым14,15,16. В пост-встраиваемом IEM, антитела применяются на тонких участках клеток, которые были полностью обработаны фиксации, обезвоживания и встраивания в мише17. Хотя этот подход позволяет избежать шага permeabilization, сохранение эпитопа интереса на протяжении всего отбора образцов являетсясложной задачей 18,19,20. Метод Токуясу световой фиксации с последующим замораживанием, криосекцией и обнаружением антител обеспечивает улучшенное сохранение эпитопа21,22. Однако технические требования крио-ультрамикротомии, а также неоптимальный контраст, достигнутый в клетке, являются недостатками23.
Использование генетически закодированных тегов устраняет многие трудности IEM, связанные с обнаружением интересуемого белка. Различные теги доступны, в том числе HRP, ферритин, ReAsH, miniSOG, и metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Каждый из них имеет преимущества по сравнению с предыдущими методами, но каждый из них также имеет недостатки предотвращения широкого использования. Эти недостатки варьируются от бездействия HRP в цитозоле до большого размера тега ферритина, светочувствительности ReAsH, а также небольшого размера и отсутствия совместимости с клеточным окрашиванием металлотионеина. Недавно, белок, полученный из аскорбата переоксидаза была разработана как EM тег, названный APEX233,34. Как пероксидаза, APEX2 может катализировать окисление 3,3' диаминобензидин (DAB), производя осадок, который реагирует с тетродов осмия, чтобы обеспечить локальный контраст EM с минимальным диффузии из белка интерес (менее 25 нм)33,35. В отличие от традиционных методов на основе HRP, APEX2 чрезвычайно стабилен и остается активным во всех сотовых отсеках33. Образцы могут быть обработаны для TEM с использованием традиционных EM образца окрашивания и методы, которые позволяют хорошую визуализацию окружающих структур33,34,36. Из-за своего небольшого размера, стабильности и универсальности, APEX2 стал EM-тегс с большим потенциалом.
Многие из рассмотренных выше подходов либо не могут быть, либо еще не объединены с современным состоянием в ультраструктурной консервации, криофиксации и низкотемпературной заморозке-замещении. Таким образом, они страдают от отсутствия сохранения мембраны и/ или окрашивания клеток для определения точной локализации белка. Это обязательно ограничивает разрешение и интерпретацию данных, которые могут быть получены. Криофиксация путем замораживания высокого давления (HPF) включает в себя быструю заморозку образцов в жидком азоте при высоком давлении (2100 бар), что вызывает витрификации, а не кристаллизации водной образцов, тем самым сохраняя клетки в почти родном государстве37,38,39. HPF сопровождается замораживанием замены (FS), низкой температуры (-90 градусов по Цельсию) обезвоживание в ацетоне в сочетании с инкубации с типичными пятнами EM, таких как тетроксид осмия и уранила ацетат. HPF и FS вместе обеспечивают явное преимущество перед традиционной химической фиксацией (более длительный процесс, который может привести к артефактам) и обезвоживанию алкоголя при комнатной температуре или на льду (что может привести к извлечению липидов и сахаров), и, таким образом, желательно сочетать с лучшими МЕТками EM для обнаружения белка.
Одна из причин того, что HPF/FS не был объединен с маркировкой APEX2, заключается в том, что легкая химическая фиксация является необходимым условием реакции пероксидазы, ограничивающей диффузию продукта реакции DAB. В исследованиях APEX2 до сих пор, фиксация и реакция пероксидазы следуют традиционные методы EM для окрашивания и обезвоживания алкоголя33,36. Тем не менее, было показано, что после химической фиксации с HPF / FS обеспечивает явное преимущество в сохранении по сравнению с традиционной химической фиксации и обезвоживания алкоголя только40. Потеря ультраструктурной целостности, наблюдаемая в традиционных образцах TEM, оказывается менее связанной с фиксацией, чем с обезвоживанием, что обычно делается с использованием алкоголя при комнатной температуре или на льду, и может привести к извлечению липидов и сахаров40,41. Для разработки метода криоаПЕКС мы предположили, что химическая фиксация и реакция пероксидазы, за которыми следуют HPF и FS, дадут оптимальный результат с точки зрения ультраструктурной консервации.
Здесь мы представляем протокол криоаПЕКС, который сочетает в себе apEX2 пометки с криофиксированием и замораживание методов замены (Рисунок 1). Этот простой протокол состоит из трансфекции интересуемого белка APEX2, химической фиксации клеток и реакции пероксидазы. Затем HPF и FS выполняются с последующим типичным встраиванием в мелину и тонким сечением. TEM изображений показывает отличное сохранение ультраструктуры с помощью этого метода. Кроме того, наблюдалось субклеточная локализация с высоким разрешением и пространственное распределение эндоплазмического люменного белка (ER). Этот метод широко полезен для обнаружения локализации мембранного белка в клетках для анализа электронной микроскопии. В наших руках метод успешно работал для различных клеточных линий, выращенных в культуре тканей, в том числе HEK-293T (человеческий эмбриональный почки), HeLa (рак шейки матки человека), Cos7 (африканская зеленая обезьяна фибробласт), и BHK (ребенок хомяка почки). Подробные инструкции описаны ниже с помощью heK-293T клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Ключевые клеточные события, такие как трансдукция сигнала и мембранный оборот, зависят от правильного расположения белка в сотовых отсеках. Понимание точной субклеточной локализации белков, таким образом, имеет важное значение для ответа на многие биологические вопросы. Поискнадежной этикетки для определения локализации белка в сочетании с адекватной клеточной консервацией и окрашиванием исторически был сложным. Недавние достижения в области визуализации электронной микроскопии (EM) привели к разработке многих методов и стратегий для увеличения клеточной консервации и маркировки целевых белков. Относительно новый генетический тег на основе пероксидаза, APEX2, является перспективным лидером в области клонируемых ЭМ-активных тегов. Подготовка образцов для передачи электронной микроскопии (TEM) также продвинулась в последние годы с появлением криофиксации путем замораживания высокого давления (HPF) и низкотемпературного обезвоживания и окрашивания через замену замораживания (FS). HPF и FS обеспечивают превосходное сохранение клеточной ультраструктуры для tEM-изображений, уступая только прямой крио-изображению образцов стекловидного тела. Здесь мы представляем протокол для метода cryoAPEX, который сочетает в себе использование тега APEX2 с HPF и FS. В этом протоколе, белок интерес маркируется APEX2, а затем химической фиксации и реакции пероксидазы. Вместо традиционного окрашивания и обезвоживания алкоголя при комнатной температуре, образец крификируется и подвергается обезвоживанию и окрашиванию при низкой температуре через FS. Используя cryoAPEX, не только может быть идентифицирован интересуемый белок в субклеточных отсеках, но и дополнительная информация может быть решена в отношении его топологии в структурно сохранившейся мембране. Мы показываем, что этот метод может обеспечить достаточно высокое разрешение для расшифровки моделей распределения белка в просвете органеллы, а также различать разобщенность белка в пределах одной органеллы в непосредственной близости от других немаркированных органелл. Кроме того, cryoAPEX является процедурно простым и поддается клеткам, выращенным в культуре тканей. Это не более технически сложной задачей, чем типичные методы криофиксации и замораживания замены. CryoAPEX широко применим для TEM-анализа любого мембранного белка, который может быть генетически помечен.

Для сравнения ультраструктурной консервации с помощью метода криоаПЕКС с традиционной фиксацией и обезвоживанием мы подготовили образцы, в которых эндоплазмическая мембрана ретикулума (ERM; ER мембраны) пептид был помечен APEX2 и трансфицируется в HEK-293T клеток. ERM-APEX2 локализуется к цитопла...

Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Этот протокол описывает метод криоаПЕКС, в котором apEX2-тегами мембранного белка могут быть локализованы путем передачи электронной микроскопии в оптимально сохранившейся ультраструктуре клеток.

Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Этот метод сочетает в себе способность окрашивать мембранный белок, сохраняя при этом целостность мембраны и субклеточную архитектуру. Так что это действительно мощный для точной локализации мембраны связанных белка. Основным преимуществом этой техники является то, что она сочетает в себе использование надежного генетически клонируемого тега APEX2 с самыми художественными методами в клеточном сохранении для электронной микроскопии, включая криофиксацию и замену замораживания.Вместе они позволяют точно локализации белка в хорошо сохранившихся клеток. Этот протокол может быть использован для вскрытия механизмов, с помощью которых вирусы размножаются внутри клетки-хозяина. Вирусы часто будет захватить принимающих белков во время их инфекции схеме.Вирусы являются небольшими геномами, которые они используют для репликации внутри этих клеток-хозяек. В последнее время мы смогли в неопубликованных данных, этикетки этих белков с помощью этой технологии, чтобы понять, как вирусы реплицируются. Этот метод оказался очень важным в недавнем совместном исследовании бактериального токсина, который вызывает golgi распада.Используя криоАПЕКС, мы смогли точно локализовать токсин с фрагментированными кусочками голги, то, что было действительно трудно увидеть иначе с помощью нормальных методов иммунофторесценции. Демонстрацией этой техники будет Элейн Михенц, аспирантка и научный сотрудник Стефани Ангел из наших лабораторий. После посева клеток HEK293 в блюде, трансфект клеток с APEX2 помечены млекопитающих выражение плазмидов с использованием трансфекции реагент в соответствии с указаниями производителя.В 12-15 часов после трансфекции, мыть клетки один раз с PBS. Затем смойте клетки с PBS из блюда в 15 миллилитров конической трубки. Центрифуга по 500 х г в течение пяти минут.Аккуратно удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в двух миллилитров 2%glutaraldehyde и 0,1 молярного буфера какодилата натрия при рН 7.4 при комнатной температуре. Поместите образец на лед, чтобы инкубировать в течение 30 минут. Затем, гранулы образца на 500 х г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.Вымойте гранулы три раза в течение пяти минут каждый с двумя миллилитров 0,1 молярного буфера какодилата натрия путем центрифугирования при четырех градусах по Цельсию. После центрифугации удалите супернатант. Для выполнения реакции пероксидазы, мыть гранулы путем повторного приостановления в трех миллилитров раствора DAB следуют гранулирования на 500 х г в течение пяти минут.Затем повторно приостанавливайте гранулы в трех миллилитров раствора DAB с 5,88 миллимолярной перекисью водорода. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Гранулы становятся заметно коричневого цвета, что указывает на наличие нерастворимого продукта реакции DAB.После мытья снова с буфером какодилата натрия в DMEM, согласно рукописи, re-suspend гранулы клетки в 500 microliters криопротекторного раствора DMEM содержа сыворотку быта плода и 15%bovine альбумин сыворотки. Перенесите подвеску клетки в 0,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку. Пеллет снова, немного увеличивая скорость центрифуги от 500 х г.Откажитесь от большинства супернатантов, гарантируя, что достаточно жидкости остается так, чтобы гранулы не высохли. Wick от любой оставшейся жидкости из ячейки гранулы с помощью угла лабораторной салфетки или бумажное полотенце. Пусть остается достаточно жидкости, что гранулы образует пасту, похожую по консистенции на зубную пасту.Аспирировать от двух до трех микролитров клеточной гранулы и депонировать его на мембрану перевозчика. Заполните колодец мембранного носителя полностью так, чтобы поверхностное натяжение создало небольшой купол сверху. Сдвиньте мембрану носителя в картридж и безопасной.Поместите картридж в машину HPF, которая была подготовлена и загрунтовка и нажмите начать замерзать. Сохраняя картриджи погруженными в жидкий азот, удалите мембранный носитель из картриджа. Поместите в пластиковую капсулу и поместите пластиковую капсулу в Криовиал, полный жидкого азота.В химическом капюшоне, подготовить один миллилитр на образец раствора 0,2%вес по объему дубовой кислоты и 5%DI воды в ацетоне в Cryovial. Поместите их в жидкий азот, чтобы заморозить. Поместите заморозить замену смеси один флакон и Cryovials содержащие замороженные гранулы ячейки в заморозить единиц образца камеры.Перенесите внутреннюю капсулу, содержащую мембранный носитель, из жидкого азотного флакона в соответствующий флакон, содержащий смесь замораживания замены. Начало протокола замены замораживания при 90 градусах по Цельсию. Через 24 часа приохладьте замену замораживания и трижды промойте образцы в течение пяти минут ацетоном, который охлаждается до 90 градусов по Цельсию.Далее, в химическом капюшоне, подготовить один миллилитр на образец раствора 1%osmium тетроксида, 0,2% ацетата урана и 5%DI воды в ацетоне в Cryovial и поместить их в жидкий азот, чтобы заморозить. Поместите Cryovials с замораживанием замены смеси два в блок замораживания замены и передачи капсулы из третьего ацетона мыть в заморозить замены смеси два флакона. Инкубировать их и заморозить замену перемешать два в течение 72 часов при 90 градусах по Цельсию, а затем постепенное потепление до нуля градусов по Цельсию в течение 12-18 часов.Держите температуру при нулевом градусе по Цельсию и добавьте предварительно охлажденный ацетон во флаконы, чтобы мыть три раза в течение 10 минут каждый. Подготовка смолы смесь выбора в пластиковый стакан в соответствии с указаниями производителя и добавить 2%4% и 8% смолы во флаконы, чтобы погрузить капсулы. Инкубировать в течение двух часов каждый при нулевом градусе по Цельсию.Затем инкубировать в 15%30%60%90%и 100%смолы компонентов A, B и D только в течение четырех часов каждый при комнатной температуре. После 20 часов, подготовить смесь компонентов смолы A, B, C, и D и инкубировать в течение четырех часов. Поместите мембранные носители с клеточной гранулой вверх в плоские встраивающие формы и заполните смесью смолы A, B, C и D.Поместите их в духовку для полимеризации при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 24-36 часов.После полимеризации удалите блоки из формы и поместите образец в вертикальный патрон ультра микротомы, где его можно визуализировать с увеличением. Отделить мембрану перевозчика от блока путем сочетания dabbing жидкого азота на мембране перевозчика отделить металл от пластика, и с помощью лезвия бритвы чип от смолы вокруг мембраны перевозчика. При разделении аккуратно смахите мембранный носитель, оставив купол клеточных гранул на лице блока.Поместите блок с открытыми клеточными гранулами, обращенными вверх, в плоскую встраиваемую форму, которая немного глубже, чем первая плесень, и заполните компонентами смолы A, B, C и D.Polymerize при 60 градусах по Цельсию в течение 24-36 часов. Обрезать блок вокруг ячейки гранулы с помощью лезвия бритвы. Затем поместите блок в образец патрона на секционизивную руку ультра микротомы.Используя стеклянный или алмазный нож, обрежьте блок в трапециевидную форму, тесно окружающую клеточные гранулы. Получить 90 нанометров ультра тонкие секции ячейки гранулы с помощью стекла или алмазного ножа. Возьмите ленту секций на сетке TEM.Высушите сетку, помяв край на листе фильтровальной бумаги и храните ее в ящике для хранения сетки TEM. Намонтировать сетку на держателе TEM и поместить держатель в микроскоп. Используйте Tecnai T12 на 80 киловольт для скрининга образцов криоАПЕКС.Приобретайте изображения клеток и субклеточных структур, представляющих интерес, с помощью маркировки APEX2. В этом исследовании подготовка образца традиционными методами APEX привела к четкой маркировке организованных, гладких эндоплазмических структур стикулума. При высоком увеличении сложенные мембраны казались взъерошенными, а не однородные зазоры присутствовали между концентрической плотностью мембран, что указывает на плохое сохранение мембран и извлечение липидов.Образец, подготовленный cryoAPEX, также имел четко определенную маркировку организованных, гладких эндоплазмических структур стикулума, однако мембраны были гладкими и параллельными, и практически не было замечено извлечения липидов. Анализ ТЕМ тонких секций 90 нанометров показал, что хантингтонские дрожжи, взаимодействующие с белком Е, присутствовали на периферической эндоплазмической цитикулуме, а также в ядерной оболочке. Кроме того, Хантингтон дрожжей взаимодействующих белка E плотность была решена в регулярно-пространственные очаги вдоль светимой эндоплазмической мембраны стикулум.Хантингтон дрожжей взаимодействующих белка E распределения и очаги были также видны в образце, подготовленном с традиционной фиксации и обезвоживания. Тем не менее, обширные нарушения мембраны и экстракции присутствовали, что делает образец неоптимальным. Маркировка APEX2 проводилась с использованием трех клеточных маркеров, из которых мито-V5-APEX2 обеспечивала специфическое окрашивание только митохондрий, а CAAX-APEX2 производила отдельное окрашивание только плазменной мембраны.В внутриклеточных органеллах маркировки не наблюдалось. Окрашивание волчанки голги также оценивалось с помощью маркера Alpha MAN2-APEX2, описанного в нашей оригинальной рукописи Sengupta et al. После этой процедуры, трехмерные методы, такие как электронная томография или сфокусированная ионная лучевая сканирующая электронная микроскопия могут быть выполнены для того, чтобы исследовать 3D распределение белка, представляющий интерес.Многие химические вещества, используемые в этом протоколе, являются токсичными, поэтому перед использованием следует проконсультироваться с листами данных о безопасности для обеспечения того, чтобы химические вещества обрабатывались с использованием надлежащего средства индивидуальной защиты и утилизируются в соответствии с институциональными руководящими принципами.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Зеленый флуоресцентный белок на основе Expression Скрининг мембранных белков в<em&gt; Кишечная палочка</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Стандартизованный метод для анализа печени Синусоидальная эндотелиальных клеток и их фенестраций по сканирующей электронной микроскопии

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Изучение надмолекулярной организации фотосинтетических мембранах внутри Фриз-трещиноватых тканях листа с помощью крио-сканирующей электронной микроскопии

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Многоцветные локализации микроскопия одного мембранных белков в органеллами живой Mammalian клеток

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Подготовка криоэлектроновой микроскопической сетки для исследований с временным разрешением с использованием новой роботизированной системы Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Стратегии оптимизации сбора данных криогенной электронной томографии

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Визуализация репликативных доменов в ультраструктурно сохраненном хроматине с помощью электронной томографии

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...