Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

El protocolo descrito aquí se deriva de una publicación de Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Este trabajo está respaldado por las subvenciones R01GM10092 (a S.M.) y AI081077 (R.V.S.) de los Institutos Nacionales de Salud, CTSI-106564 (a S.M.) del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de Indiana, y PI4D-209263 (a S.M.) del Instituto de La Universidad de Purdue para la Inmunoinflamación,

1. Cultivo celular y transfección
<ol><li>Células HEK-293T de semilla en un plato de cultivo de tejido de 60 mm de diámetro o más grande y crecen a entre el 60% y el 90% de confluencia en una incubadora de cultivo celular a 37 oC y 5% de CO2.</li>
	<li>Células transfect con plásmidos de expresión de mamíferos etiquetados con APEX2 utilizando reactivo de transfección (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>A 12–15 h después de la transfe...

El protocolo crioAPEX presentado aquí proporciona un método robusto para caracterizar la localización de proteínas de membrana dentro del entorno celular. El uso de una etiqueta APEX2 codificada genéticamente no sólo proporciona una localización precisa de una proteína de interés, sino que el uso de criofixación y deshidratación a baja temperatura proporciona una excelente preservación y tinción de la ultraestructura celular circundante. Combinados, estos enfoques son una poderosa herramienta para localizar ...

Los estudios biológicos a menudo incluyen preguntas sobre cómo resolver la localización de proteínas subcelulares dentro de las células y orgánulos. La microscopía de inmunofluorescencia proporciona una vista útil de baja resolución de la localización de proteínas, y los avances recientes en imágenes de superresolución están empujando los límites de la resolución de proteínas etiquetadas fluorescentes1,2,3. Sin embargo, la microscopía electrónica (EM) sigue siendo el estándar de oro para la imagen de la ultraestructura celular de alta resolución, aunque el etiquetado de proteínas es un desafío.
Históricamente, se han utilizado varios métodos EM para abordar cuestiones de localización de proteínas ultraestructurales. Uno de los métodos más utilizados es la microscopía inmunoelectrón (IEM), donde se utilizan anticuerpos primarios específicos de antígeno para detectar la proteína de interés. La señal EM se genera mediante la aplicación de anticuerpos secundarios conjugados con partículas de densidad de electrones, más comúnmente oro coloidal4,5. Alternativamente, los anticuerpos conjugados con enzimas como la peroxidasa de rábano de caballo (HRP) se pueden utilizar para producir un precipitado denso de electrones6,7,8. Existen dos enfoques principales para el IEM, denominados etiquetado de preincrustación y post-inserción. En iEM pre-incrustación, los anticuerpos se introducen directamente en las células, lo que requiere la fijación de la luz y la permeabilización de las células9,10,11. Ambos pasos pueden dañar la ultraestructura12,13. El desarrollo de anticuerpos significativamente más pequeños consistentes en un fragmento de Fab de anticuerpos conjugado con nanooro de 1,4 nm permite utilizar condiciones de permeabilización muy suaves; sin embargo, el nanooro es demasiado pequeño para la visualización directa bajo TEM y requiere pasos de mejora adicionales para ser visible14,15,16. En IEM posterior a la incrustación, los anticuerpos se aplican en secciones delgadas de células que han sido completamente procesadas por fijación, deshidratación e incrustación en resina17. Si bien este enfoque evita el paso de permeabilización, preservar el epítome de interés a lo largo de la preparación de la muestra es un reto18,19,20. El método Tokuyasu de fijación de la luz seguido de congelación, criosección y detección de anticuerpos proporciona una mejor conservación del epítopo21,22. Sin embargo, los requisitos técnicos de la crioultramicrotomía, así como el contraste subóptimo alcanzado en la célula, son desventajas23.
El uso de etiquetas codificadas genéticamente elimina muchas de las dificultades de IEM relacionadas con la detección de la proteína de interés. Una variedad de etiquetas están disponibles, incluyendo HRP, ferritina, ReAsH, miniSOG, y metallotionina24,25,26,27,28,29,30,31,32. Cada uno de ellos tiene ventajas sobre los métodos anteriores, pero cada uno también tiene inconvenientes que impiden el uso generalizado. Estos inconvenientes van desde la inactividad de HRP en el citosol hasta el gran tamaño de la etiqueta de ferritina, la sensibilidad a la luz de ReAsH, y el pequeño tamaño y la falta de compatibilidad con la tinción celular de metalotionina. Recientemente, una proteína derivada de ascorbato peroxidasa ha sido diseñada como una etiqueta EM, llamada APEX233,34. Como peroxidasa, APEX2 puede catalizar la oxidación de 3,3' diaminobenzidina (DAB), produciendo un precipitado que reacciona con tetróxido de osmio para proporcionar contraste LOCAL EM con una difusión mínima de la proteína de interés (menos de 25 nm)33,35. A diferencia de los métodos tradicionales basados en HRP, APEX2 es extremadamente estable y permanece activo en todos los compartimentos celulares33. Las muestras se pueden procesar para TEM utilizando la tinción de muestras EM tradicional y métodos que permiten una buena visualización de las estructuras circundantes33,34,36. Debido a su pequeño tamaño, estabilidad y versatilidad, APEX2 ha surgido como una etiqueta EM con gran potencial.
Muchos de los enfoques mencionados anteriormente no pueden ser o aún no se han combinado con el estado actual de la técnica en la preservación ultraestructural, la criofixación y la sustitución de congelación a baja temperatura. Por lo tanto, sufren de una falta de preservación de la membrana y / o tinción celular para determinar la localización precisa de proteínas. Esto limita necesariamente la resolución e interpretación de los datos que se pueden obtener. La criofixación por congelación a alta presión (HPF) implica la congelación rápida de muestras en nitrógeno líquido a alta presión (2.100 bar), lo que provoca vitrificación en lugar de cristalización de muestras acuosas, preservando así las células en un estado casi nativo37,38,39. HpF es seguido por la sustitución por congelación (FS), una deshidratación a baja temperatura (-90 oC) en acetona combinada con incubación con manchas EM típicas como tetróxido de osmio y acetato de ursionlo. HpF y FS juntos proporcionan una clara ventaja sobre la fijación química tradicional (un proceso más largo que puede conducir a artefactos) y la deshidratación del alcohol a temperatura ambiente o en hielo (que puede conducir a la extracción de lípidos y azúcares), y por lo tanto son deseables para combinar con las mejores etiquetas EM para la detección de proteínas.
Una razón por la que HPF/FS no se ha combinado con el etiquetado APEX2 es que la fijación química ligera es un requisito previo para la reacción de peroxidasa, limitando la difusión del producto de reacción DAB. En los estudios APEX2 realizados hasta ahora, la fijación y la reacción de peroxidasa son seguidas por los métodos tradicionales EM para la tinción y la deshidratación del alcohol33,36. Sin embargo, se ha demostrado que la siguiente fijación química con HPF/FS proporciona una clara ventaja en la preservación sobre la fijación química tradicional y la deshidratación de alcohol por sí sola40. La pérdida de integridad ultraestructural que se ve en las muestras tradicionales de TEM parece estar menos relacionada con la fijación que con la deshidratación, que normalmente se realiza con alcohol a temperatura ambiente o en hielo, y puede conducir a la extracción de lípidos y azúcares40,41. Para desarrollar el método crioAPEX, hipotetizaron que la fijación química y la reacción de peroxidasa, seguidas de HPF y FS, producirían un resultado óptimo en términos de preservación ultraestructural.
Aquí presentamos el protocolo cryoAPEX, que combina el etiquetado APEX2 con los métodos de sustitución criofixation y freeze(Figura 1). Este protocolo sencillo consiste en la transfección de una proteína de interés con la etiqueta APEX2, la fijación química de las células y la reacción de la peroxidasa. HpF y FS se realizan seguidos de la incrustación típica de resina y el corte fino. Las imágenes TEM revelan una excelente preservación de la ultraestructura utilizando este método. Además, se observó la localización subcelular de alta resolución y la distribución espacial de una proteína lumenal endoplasmática (ER). Este método es ampliamente útil para la detección de la localización de proteínas de membrana dentro de las células para el análisis de microscopía electrónica. En nuestras manos, el método ha trabajado con éxito para una variedad de líneas celulares cultivadas en el cultivo de tejidos, incluyendo HEK-293T (riñón embrionario humano), HeLa (cáncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de mono verde africano), y BHK (riñón de hámster bebé). Las instrucciones detalladas se describen a continuación utilizando células HEK-293T.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Los eventos celulares clave como la transducción de señales y el tráfico de membranas dependen de la ubicación adecuada de las proteínas dentro de los compartimentos celulares. Entender la localización subcelular precisa de las proteínas es por lo tanto importante para responder a muchas preguntas biológicas. La búsqueda de una etiqueta robusta para identificar la localización de proteínas combinada con la preservación celular adecuada y la tinción ha sido históricamente difícil. Los avances recientes en la microscopía electrónica (EM) han llevado al desarrollo de muchos métodos y estrategias para aumentar la preservación celular y etiquetar las proteínas diana. Una etiqueta genética relativamente nueva basada en peroxidasa, APEX2, es un líder prometedor en etiquetas EM-activas clonables. La preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión (TEM) también ha avanzado en los últimos años con la llegada de la crioexposición por congelación a alta presión (HPF) y deshidratación y tinción a baja temperatura mediante sustitución por congelación (FS). HPF y FS proporcionan una excelente preservación de la ultraestructura celular para imágenes TEM, solo por sitoma directa de muestras vítreas. Aquí presentamos un protocolo para el método crioAPEX, que combina el uso de la etiqueta APEX2 con HPF y FS. En este protocolo, una proteína de interés se etiqueta con APEX2, seguido de la fijación química y la reacción de peroxidasa. En lugar de la tradicional tinción y deshidratación del alcohol a temperatura ambiente, la muestra se criofija y se somete a deshidratación y tinción a baja temperatura a través de FS. Usando crioAPEX, no sólo se puede identificar una proteína de interés dentro de los compartimentos subcelulares, sino que también se puede resolver información adicional con respecto a su topología dentro de una membrana estructuralmente conservada. Mostramos que este método puede proporcionar una resolución lo suficientemente alta como para descifrar patrones de distribución de proteínas dentro de un lumen de organelo, y para distinguir la compartimentación de una proteína dentro de un orgelle cerca de otros orgánulos sin etiquetar. Además, el crioAPEX es procedimentalmente sencillo y susceptible de células cultivadas en el cultivo de tejidos. No es técnicamente más difícil que los métodos típicos de sustitución de criofixación y congelación. CryoAPEX es ampliamente aplicable para el análisis TEM de cualquier proteína de membrana que pueda ser etiquetada genéticamente.

Con el fin de comparar la preservación ultraestructural utilizando el método crioAPEX con la fijación y deshidratación tradicional, preparamos muestras en las que una membrana de retículo endoplasmático (ERM; ER membrane) fue etiquetado con APEX2 y transfectó en células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza la cara citoplasmática del ER y remodela la estructura de ER en estructuras morfológicamente distintas conocidas como ER suave organizado (OSER)34,42,</...

Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Este protocolo describe el método crioAPEX, en el que una proteína de membrana etiquetada con APEX2 puede ser localizada por microscopía electrónica de transmisión dentro de la ultraestructura celular óptimamente conservada.

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Este método combina la capacidad de manchar una proteína de membrana al mismo tiempo que preserva la integridad de la membrana y la arquitectura subcelular. Así que es realmente potente para localizar con precisión una proteína asociada a la membrana. La principal ventaja de esta técnica es que combina el uso de una etiqueta robusta clonable genéticamente, APEX2, con métodos de vanguardia en preservación celular para microscopía electrónica, incluyendo criofija y sustitución por congelación.Juntos, permiten una localización precisa de proteínas dentro de una célula bien conservada. Este protocolo se puede utilizar para diseccionar mecanismos mediante los cuales los virus se replican dentro de la célula host. Los virus a menudo secuestrarán las proteínas del huésped durante su esquema de infección.Los virus son los pequeños genomas, que utilizan para replicar dentro de estas células huésped. Recientemente, hemos sido capaces de en datos no publicados, etiquetar estas proteínas utilizando esta tecnología para entender cómo se replican los virus. Esta técnica resultó muy crítica en un estudio colaborativo reciente sobre una toxina bacteriana que causa la descomposición del golgi.Usando cryoAPEX, pudimos localizar con precisión la toxina con las piezas golgi fragmentadas, algo que era realmente difícil de ver de otra manera utilizando técnicas normales de inmunofluorescencia. Demostrando esta técnica estará Elaine Mihelc, una estudiante graduada y investigadora asociada, Stephanie Angel, de nuestros laboratorios. Después de sembrar células HEK293 en el plato, transfeque las células con plásmidos de expresión de mamíferos etiquetados con plasmidos de expresión de mamíferos utilizando reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.A las 12-15 horas después de la transfección, lave las células una vez con PBS. Luego, lave las células con PBS del plato en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar a 500 x g durante cinco minutos.Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de 2%glutaraldehído y 0,1 molar sódico de cacodilato a pH 7,4 a temperatura ambiente. Coloque la muestra sobre hielo para incubar durante 30 minutos. Luego, pele la muestra a 500 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Lave el pellet tres veces durante cinco minutos cada uno con dos mililitros de 0,1 molar sódico de cacodilato centrifugando a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Para llevar a cabo la reacción de peroxidasa, lavar el pellet mediante la re-suspensión en tres mililitros de solución DAB seguido de peletización a 500 x g durante cinco minutos.A continuación, vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de solución DAB con 5,88 peróxido de hidrógeno milimolar. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. El pellet se vuelve visiblemente de color marrón, lo que indica la presencia del producto de reacción DAB insoluble.Después de lavar de nuevo con tampón de cacodilato de sodio en DMEM, según el manuscrito, vuelva a suspender el pellet celular en 500 microlitros de una solución crioprotectora de DMEM que contenga un 10% de suero bovino fetal y un 15% de albúmina sérica bovina. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Pellet de nuevo, aumentando ligeramente la velocidad de la centrífuga de 500 x g.Deseche la mayoría del sobrenadante, asegurándose de que quede suficiente líquido para que el pellet no se seque. Wick lejos de cualquier líquido restante de la célula pellet usando la esquina de una toallita de laboratorio o toalla de papel. Deje que quede suficiente líquido que el pellet forma una pasta, similar en consistencia a la pasta de dientes.Aspirar de dos a tres microlitros del pellet celular y depositarlo en un portador de membrana. Llene el pozo del portador de membrana completamente para que la tensión superficial cree una ligera cúpula en la parte superior. Deslice el portador de membrana en el cartucho y asegúrelo.Coloque el cartucho en la máquina HPF que se ha preparado y preparado y pulse para empezar a congelarse. Manteniendo los cartuchos sumergidos en nitrógeno líquido, retire el portador de membrana de su cartucho. Colocar en una cápsula de plástico y colocar la cápsula de plástico en un Cryovial lleno de nitrógeno líquido.En una capucha química, preparar un mililitro por muestra de la solución de 0.2% de peso por volumen ácido tánico y 5%DI agua en acetona en un Cryovial. Colóquelos en nitrógeno líquido para congelarlos. Coloque la mezcla de sustitución de congelación de un vial y los Cryovials que contienen los pellets de células congeladas en la cámara de muestra de las unidades de sustitución de congelación.Transfiera la cápsula interna que contiene el portador de membrana del vial de nitrógeno líquido al vial correspondiente que contiene la mezcla de sustitución de congelación. Inicie un protocolo de sustitución por congelación a 90 grados Centígrados. Después de 24 horas, detenga la sustitución de congelación y lave las muestras tres veces durante cinco minutos con acetona que se ha enfriado a 90 grados centígrados.A continuación, en una capucha química, preparar un mililitro por muestra de una solución de 1%tetróxido de osmio, 0,2%acetato de uranilo y 5% DE DI agua en acetona en un Cryovial y colocarlos en nitrógeno líquido para congelar. Coloque los Cryovials con la mezcla de sustitución de congelación dos en la unidad de sustitución de congelación y transfiera las cápsulas del tercer lavado de acetona a la mezcla de sustitución de congelación de dos viales. Incubarlos y congelar la mezcla de sustitución dos durante 72 horas a 90 grados Celsius, seguido de calentamiento gradual a cero grados Celsius durante 12-18 horas.Mantenga la temperatura a cero grados Centígrados y agregue acetona preenfriada en los viales para lavar tres veces durante 10 minutos cada uno. Preparar una mezcla de resina de elección en un vaso de precipitados de plástico de acuerdo con las instrucciones del fabricante y añadir 2%4% y 8% de resina en los viales para sumergir las cápsulas. Incubar durante dos horas cada una a cero grados centígrados.Luego, incubar en 15%30%60%90%y 100%componentes de resina de A, B y D sólo durante cuatro horas cada uno a temperatura ambiente. Después de las 20 horas, preparar una mezcla de componentes de resina A, B, C y D e incubar durante cuatro horas. Coloque los portadores de membrana con el lado del pellet celular hacia arriba en moldes de incrustación plana y llene con la mezcla de resina A, B, C y D.Colóquelos en un horno para polimerizarlos a 60 grados Celsius durante 24-36 horas.Después de la polimerización, retire los bloques del molde y coloque la muestra en el mandril vertical del microtomo ultra donde se puede visualizar con aumento. Separe el portador de membrana del bloque mediante una combinación de nitrógeno líquido en el portador de membrana para separar el metal del plástico, y el uso de una cuchilla de afeitar para astillar la resina alrededor del portador de membrana. Cuando esté separado, levante suavemente el portador de la membrana, dejando la cúpula del pellet celular en la cara del bloque.Coloque el bloque con el pellet de celda expuesto mirando hacia arriba en un molde de incrustación plana que es ligeramente más profundo que el primer molde y llene con componentes de resina A, B, C y D.Polymerize a 60 grados Celsius durante 24-36 horas. Recorte el bloque alrededor del pellet de la célula usando una cuchilla de afeitar. A continuación, coloque el bloque en el portabrocas de muestra en el brazo de seccionamiento de un microtoma ultra.Usando un cuchillo de vidrio o diamante, recorte el bloque en una forma trapezoidal que rodea estrechamente el pellet celular. Obtenga secciones ultradelgadas de 90 nanómetros del pellet celular con un cuchillo de vidrio o diamante. Recoja una cinta de secciones en una cuadrícula TEM.Seque la rejilla hinchando el borde de un pedazo de papel de filtro y guárdelo en una caja de almacenamiento de rejilla TEM. Monte la rejilla en el soporte TEM y coloque el soporte en el microscopio. Utilice un Tecnai T12 a 80 kilovoltas para la detección de muestras crioAPEX.Adquiera imágenes de celdas y estructuras subcelulares de interés con el etiquetado APEX2. En este estudio, la preparación de la muestra por métodos tradicionales de APEX dio lugar a un etiquetado claro de estructuras de retículo endoplasmáticos organizadas y lisas. A un alto aumento, las membranas apiladas aparecieron con volantes y las brechas no uniformes estaban presentes entre las densidades de membrana concéntricas, lo que indica una mala preservación de la membrana y la extracción de lípidos.La muestra preparada por cryoAPEX también tenía un etiquetado claramente definido de estructuras de retículo endoplasmáticos organizadas y lisas, sin embargo, las membranas eran lisas y paralelas y se veía poca o ninguna extracción de lípidos. El análisis TEM de secciones delgadas de 90 nanómetros reveló que la proteína E que interactúa con la levadura Huntington estaba presente en todo el retículo endoplasmático periférico, así como en la envolvente nuclear. Además, la densidad de proteína E que interactúa con la levadura Huntington se resolvió en focos espaciados regularmente a lo largo de la membrana del retículo endoplasmático luminal.La levadura de Huntington que interactúa con la distribución de proteínaS E y los focos también fueron visibles en una muestra preparada con fijación tradicional y deshidratación. Sin embargo, se presentaron una extensa interrupción y extracción de la membrana, por lo que la muestra era subóptima. El etiquetado APEX2 se realizó utilizando tres marcadores celulares, de los cuales mito-V5-APEX2 proporcionó una tinción específica de las mitocondrias solamente y CAAX-APEX2 produjo una tinción distinta de la membrana plasmática solamente.No se observó etiquetado en orgánulos intracelulares. La tinción para el lumen golgi también se evaluó utilizando un marcador Alpha MAN2-APEX2 como se describe en nuestro manuscrito original de Sengupta et al. Después de este procedimiento, se pueden realizar métodos tridimensionales como la tomografía electrónica o la microscopía electrónica de barrido de haz iónico focalizado para investigar la distribución 3D de una proteína de interés.Muchos de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos, por lo que antes de su uso, las fichas de datos de seguridad deben ser consultadas para garantizar que los productos químicos se manipulan utilizando el equipo de protección personal adecuado y se eliminan de acuerdo con las directrices institucionales.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-FEM: Proteína localización usando la foto activada por microscopía de localización y Microscopía Electrónica

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Investigación

Biología

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Preparación de la rejilla microscópica crio-electrónica para estudios resueltos en el tiempo utilizando un nuevo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Estrategias para la optimización de la adquisición de datos de tomografía electrónica criogénica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Imágenes de dominios replicativos en cromatina ultraestructuralmente preservada por tomografía electrónica

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...