Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

Protokollet som beskrivs här härrör från en publikation av Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Detta arbete stöds av bidrag R01GM10092 (till S.M.) och AI081077 (R.V.S.) från National Institutes of Health, CTSI-106564 (till S.M.) från Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, och PI4D-209263 (till S.M.) från Purdue University Institute for Inflammation, Immunology, and Infectious Disease.

1. Cellkultur och transfection
<ol><li>Seed HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller större vävnad kultur rätt och växa till 60%-90% sammanflödet i en cell kultur inkubator på 37 ° C och 5% CO2.</li>
	<li>Transfect celler med APEX2-märkta däggdjur uttryck plasmids med transfection reagens (se Table of Materials) enligt tillverkarens anvisningar.</li>
	<li>Vid 12–15 h efter transfection, tvätta celler en gång med fosfat buffrad koks (PBS). Ta bort celler från skålen genom mi...

CryoAPEX-protokollet som presenteras här ger en robust metod för att karakterisera lokaliseringen av membranproteiner i cellmiljön. Inte bara användningen av en genetiskt kodade APEX2 tagg ger exakt lokalisering av ett protein av intresse, men användningen av cryofixation och låg temperatur uttorkning ger utmärkt bevarande och färgning av den omgivande cellulära ultrastruktur. Kombinerat är dessa metoder ett kraftfullt verktyg för att lokalisera ett protein med hög precision i sitt subcellulära sammanhang.</...

Biologiska studier inkluderar ofta frågor om att lösa subcellulära proteinlokalisering inom celler och organeller. Immunofluorescensmikroskopi ger en användbar lågupplösning sett till proteinlokalisering, och de senaste framstegen inom super-upplösning imaging driver gränserna för upplösning för fluorescerande taggade proteiner1,2,3. Men elektronmikroskopi (EM) är fortfarande guldmyntfoten för imaging högupplöst cellulära ultrastruktur, även om märkning av proteiner är en utmaning.
Historiskt sett har flera EM-metoder använts för att närma sig frågor om strukturella proteinlokalisering. En av de vanligaste metoderna är immunoelectron mikroskopi (IEM), där antigen-specifika primära antikroppar används för att upptäcka protein av intresse. EM-signal genereras av tillämpningen av sekundära antikroppar som konjugeras med elektrontäta partiklar, oftast kolloidalt guld4,5. Alternativt kan antikroppar som konjugeras med enzymer som pepparräd (HRP) användas för att producera en elektrontät fällning6,7,8. Det finns två huvudsakliga metoder för IEM, besiktigad förinbäddning och postbäddsmärkning. I pre-inbäddning IEM, antikroppar införs direkt i celler, vilket kräver ljusfixering och permeabilisering av cellerna9,10,11. Båda stegen kan skada ultrastructure12,13. Utveckling av betydligt mindre antikroppar bestående av ett antikroppsFab-fragment som konjugerats med 1,4 nm nanoguld gör att mycket milda permeabiliseringsförhållanden kan användas. Nanogold är dock för liten för direkt visualisering under TEM och kräver ytterligare förbättringssteg för att bli synliga14,15,16. I efterinbäddning IEM appliceras antikroppar på tunna delar av celler som har bearbetats helt genom fixering, uttorkning och inbäddning i harts17. Även om detta tillvägagångssätt undviker permeabilisering steg, bevara epitop av intresse under provberedning är utmanande18,19,20. Den Tokuyasu metoden för ljusfixering följt av frysning, cryo-snittning, och antikroppar upptäckt ger förbättrad epitop bevarande21,22. Men de tekniska kraven för cryo-ultramicrotomy, liksom den suboptimala kontrast som uppnås i cellen, är nackdelar23.
Användningen av genetiskt kodade taggar eliminerar många av svårigheterna med IEM i samband med upptäckt av protein av intresse. En mängd olika taggar finns tillgängliga, inklusive HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG och metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Var och en av dessa har fördelar jämfört med tidigare metoder, men var och en har också nackdelar som förhindrar utbredd användning. Dessa nackdelar sträcker sig från inaktivitet av HRP i cytosol till den stora storleken på ferritin taggen, ljuskänslighet ReAsH, och liten storlek och brist på kompatibilitet med cellulära färgning av metallothionein. Nyligen har ett protein som härrör från askorbat peroxidas e konstruerats som en EM-tagg, som heter APEX233,34. Som en peroxidas kan APEX2 katalysera oxidationen av 3,3'diaminobenzidine (DAB), som producerar en fällning som reagerar med osmiumetroxid för att ge lokal EM kontrast med minimal diffusion från protein av intresse (mindre än 25 nm)33,35. Till skillnad från traditionella HRP-baserade metoder är APEX2 extremt stabil och förblir aktiv i alla cellulära fack33. Prover kan bearbetas för TEM med traditionella EM-provfärgning och metoder som möjliggör bra visualisering av de omgivande strukturerna33,34,36. På grund av sin ringa storlek, stabilitet och mångsidighet har APEX2 vuxit fram som en EM-tagg med stor potential.
Många av de tillvägagångssätt som diskuteras ovan kan antingen inte vara eller ännu inte har kombinerats med det aktuella läget i konsten i strukturella bevarande, kryofixation och låg temperatur fryssubstitution. Således lider de av brist på membran bevarande och / eller cell färgning för att bestämma korrekt proteinlokalisering. Detta begränsar nödvändigtvis upplösningen och tolkningen av de uppgifter som kan erhållas. Cryofixation av högtrycksfrysning (HPF) innebär snabb frysning av prover i flytande kväve vid ett högt tryck (~2 100 bar), vilket orsakar förvinning snarare än kristallisering av vattenprover, vilket bevarar celler i ett nästan inbyggt tillstånd37,38,39. HPF följs av frysningsubstitution (FS), en låg temperatur (-90 °C) uttorkning i aceton i kombination med inkubation med typiska EM-fläckar som osmiumetroxid och uranylacetat. HPF och FS ger tillsammans en klar fördel jämfört med traditionell kemisk fixering (en längre process som kan leda till artefakter) och alkoholuttorkning vid rumstemperatur eller på is (vilket kan leda till extraktion av lipider och sockerarter), och därmed är önskvärda att kombinera med de bästa EM-taggarna för proteindetektering.
En anledning till att HPF/FS inte har kombinerats med APEX2-märkning är att ljuskemisk fixering är en förutsättning för peroxidasreaktionen, vilket begränsar spridningen av DAB-reaktionsprodukten. I APEX2-studier följs hittills fixering och peroxidasreaktion av traditionella EM-metoder för färgning och alkoholuttorkning33,36. Det har dock visat sig att efter kemisk fixering med HPF/FS ger en tydlig fördel i bevarandet över traditionell kemisk fixering och alkoholuttorkning ensam40. Förlusten av strukturell integritet sett i traditionella TEM prover verkar mindre ansluten till fixering än uttorkning, som vanligtvis görs med alkohol i rumstemperatur eller på is, och kan leda till extraktion av lipider och sockerarter 40,41. För att utveckla cryoAPEX-metoden hypoteser vi att kemisk fixering och peroxidasreaktion, följt av HPF och FS, skulle ge ett optimalt resultat när det gäller strukturellbevarande.
Här presenterar vi cryoAPEX-protokollet, som kombinerar APEX2-märkning med kryofixation och fryser substitutionsmetoder (figur 1). Detta enkla protokoll består av transfection av ett APEX2-märkt protein av intresse, kemisk fixering av celler och peroxidasreaktionen. HPF och FS utförs sedan följt av typisk harts inbäddning och tunn snittning. TEM imaging avslöjar utmärkt bevarande av ultrastruktur med hjälp av denna metod. Dessutom observerades högupplöst subcellulär lokalisering och rumslig fördelning av en endoplasmatisk reticulum (ER) lumenalprotein. Denna metod är allmänt användbar för detektion av membranproteinlokalisering inom celler för elektronmikroskopi analys. I våra händer har metoden fungerat framgångsrikt för en mängd olika cellinjer som odlas i vävnadskultur, inklusive HEK-293T (mänskliga embryonala njurar), HeLa (human livmoderhalscancer), Cos7 (afrikansk grön apa njurfibroblast), och BHK (baby hamster njure). Detaljerade instruktioner beskrivs nedan med HEK-293T-celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Viktiga cellulära händelser som signaltransduktion och membranhandel är beroende av korrekt proteinplats i cellulära fack. Att förstå exakt subcellulära lokalisering av proteiner är därför viktigt för att svara på många biologiska frågor. Strävan efter en robust etikett för att identifiera proteinlokalisering i kombination med adekvat cellulär bevarande och färgning har historiskt utmanande. De senaste framstegen inom elektronmikroskopi (EM) bildbehandling har lett till utveckling av många metoder och strategier för att öka cellulära bevarande och etikett målproteiner. En relativt ny peroxidasbaserad genetisk tagg, APEX2, är en lovande ledare inom klonbara EM-aktiva taggar. Provberedning för transmissionelektronmikroskopi (TEM) har också avancerat under de senaste åren med tillkomsten av cryofixation genom högtrycksfrysning (HPF) och lågtemperaturuttorkning och färgning via frysningsubstitution (FS). HPF och FS ger utmärkt bevarande av cellulär ultrastruktur för TEM-avbildning, näst efter direkt kryo-imaging av glaskroppen prover. Här presenterar vi ett protokoll för cryoAPEX-metoden, som kombinerar användningen av APEX2-taggen med HPF och FS. I detta protokoll är ett protein av intresse märkt med APEX2, följt av kemisk fixering och peroxidasreaktion. I stället för traditionell färgning och alkoholuttorkning i rumstemperatur, provet är kryokefixet och genomgår uttorkning och färgning vid låg temperatur via FS. Med cryoAPEX kan inte bara ett protein av intresse identifieras inom subcellulära fack, utan även ytterligare information kan lösas med avseende på dess topologi inom ett strukturellt bevarat membran. Vi visar att denna metod kan ge tillräckligt hög upplösning för att dechiffrera proteindistributionsmönster inom en organelllumen, och att skilja uppdelningen av ett protein inom en organelle i närheten av andra omärkta organeller. Vidare är cryoAPEX procedurmässigt enkelt och mottagligt för celler som odlas i vävnadskultur. Det är inte mer tekniskt utmanande än typisk cryofixation och frysa substitutionsmetoder. CryoAPEX är allmänt tillämplig för TEM-analys av membranprotein som kan märkas genetiskt.

För att jämföra det strukturella bevarandet med kryoAPEX-metoden med traditionell fixering och uttorkning, förberedde vi prover där ett endoplasmaiskt reticulummembran (ERM; ER membran) peptid var märkt med APEX2 och transfected i HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserar till ER:s cytoplasmatiska ansikte och ommodellerar ER-strukturen till morfologiskt distinkta strukturer som kallas organiserad smooth ER (OSER)34,42,43. OSE...

Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Detta protokoll beskriver cryoAPEX-metoden, där ett APEX2-märkt membranprotein kan lokaliseras genom överföring elektronmikroskopi inom optimalt bevarad cellultrastruktur.

CryoAPEX-metoden för elektronmikroskopi analys av membranproteinlokalisering inom ultrastrukturellt bevarade celler

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Denna metod kombinerar förmågan att fläcka för ett membranprotein samtidigt som man bevarar membranintegritet och subcellulär arkitektur. Så det är verkligen kraftfull för exakt lokalisera ett membran tillhörande protein. Den största fördelen med denna teknik är att den kombinerar användningen av en robust genetiskt klonbara tag, APEX2, med toppmoderna metoder i cellulära bevarande för elektronmikroskopi, inklusive kryofixation och frysa substitution.Tillsammans möjliggör dessa exakt proteinlokalisering inom en välbevarad cell. Detta protokoll kan användas för att dissekera mekanismer genom vilka virus replikera inuti värdcellen. Virus ofta kommer att kapa värd proteiner under deras infektion system.Virus är de små genom, som de använder för att replikera inuti dessa värdceller. Nyligen har vi kunnat i opublicerade data, märka dessa proteiner med hjälp av denna teknik för att förstå hur virus replikera. Denna teknik visade sig vara riktigt kritisk i en nyligen samarbetsstudie på ett bakterietoxin som orsakar golgi uppdelning.Med hjälp av cryoAPEX kunde vi exakt lokalisera toxinet med de fragmenterade golgibitarna, något som var riktigt svårt att se på annat sätt med normala immunofluorescenstekniker. Visar denna teknik kommer att Elaine Mihelc, en doktorand, och forskarassistent, Stephanie Angel, från våra laboratorier. Efter sådd HEK293 celler i skålen, transfect cellerna med APEX2 taggade däggdjur uttryck plasmider med hjälp av transfection reagens enligt tillverkarens anvisningar.Vid 12-15 timmar efter transfection, tvätta cellerna en gång med PBS. Sedan tvätta bort cellerna med PBS från skålen till en 15 milliliter koniska röret. Centrifugera vid 500 x g i fem minuter.Tag försiktigt bort supernatanten och åter upphäva pelleten i två milliliter av 2%glutaraldehyd och 0,1 molar natriumkodynadsbuffert vid pH 7,4 vid rumstemperatur. Placera provet på is för att ruva i 30 minuter. Sedan, pellet provet vid 500 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius.Tvätta pelleten tre gånger i fem minuter vardera med två milliliter på 0,1 molar natrium cacodylate buffert genom centrifugering vid fyra grader Celsius. Efter centrifugeringen, ta bort supernatanten. För att utföra peroxidasreaktionen, tvätta pelleten genom återuppstängning i tre milliliter DAB-lösning följt av pelletering vid 500 x g i fem minuter.Sedan, åter upphäva pelleten i tre milliliter AV DAB lösning med 5,88 millimolar väteperoxid. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur. Pelleten blir synligt brunfärgad, vilket indikerar närvaron av den olösliga DAB-reaktionsprodukten.Efter tvätt igen med natrium cacodylate buffert i DMEM, enligt manuskriptet, åter upphäva cellen pelleten i 500 microliters av en cryoprotectant lösning av DMEM som innehåller 10%fetala nötkreatur serum och 15%nötkreatur serum albumin. Överför cellupphängningen till ett 0,5 milliliter mikrocentrifugrör. Pellet igen, något öka centrifug hastighet från 500 x g.Kasta majoriteten av supernatanten, se till att tillräckligt med vätska lämnas så att pelleten inte torkar ut. Wick bort eventuell kvarvarande vätska från cellen pelleten med hjälp av hörnet av ett laboratorium torka eller pappershandduk. Låt tillräckligt med vätska förbli att pelleten bildar en pasta, liknande i konsistens som tandkräm.Aspirera två till tre mikroliter av cellpelleten och deponera den på en membranbärare. Fyll membranbärarens brunn helt så att ytspänningen skapar en liten kupol ovanpå. Skjut in membranhållaren i patronen och säkra.Placera patronen i HPF-maskinen som har preppats och primas och tryck på start för att frysa. Hålla patronerna nedsänkta i flytande kväve, ta bort membranet bäraren från sin patron. Placera i en plastkapsel och placera plastkapseln i en Cryovial full av flytande kväve.I en kemisk huva, preparera en milliliter per prov av lösningen av 0,2%vikt i volym garvsyra och 5%DI vatten i aceton i en Cryovial. Placera dem i flytande kväve för att frysa. Placera frysersättningsblandningen en injektionsflaska och Cryovials som innehåller de frysta cellpelletsen i provkammaren för frysersättningsenheter.Överför den inre kapseln som innehåller membranbäraren från den flytande kväveflaskan till motsvarande injektionsflaska som innehåller fryssubstitutionsmix en. Starta ett frysersättningsprotokoll vid 90 grader Celsius. Efter 24 timmar, pausa frysersättningen och tvätta proverna tre gånger i fem minuter med aceton som har kylts till 90 grader Celsius.Nästa, i en kemisk huva, förbereda en milliliter per prov av en lösning av 1%osmium tetroxid, 0,2%uranylacetat, och 5%DI vatten i aceton i en Cryovial och placera dem i flytande kväve att frysa. Placera Cryovials med frysersättningsblandningen två i frysersättningsenheten och överför kapslarna från den tredje acetontvätten i frysersättningsblandningen två injektionsflaska. Inkubera dem och frys substitution blanda två i 72 timmar vid 90 grader Celsius, följt av gradvis uppvärmning till noll grader Celsius under 12-18 timmar.Håll temperaturen vid noll grader Celsius och tillsätt färdigkyld aceton i injektionsflaskan för att tvätta tre gånger i 10 minuter vardera. Förbered en harts blandning av val i en plastbägare enligt tillverkarens anvisningar och tillsätt 2%4%och 8%av harts i injektionsflaskorna för att sänka kapslarna. Inkubera i två timmar vardera vid noll grader Celsius.Därefter, inkubera i 15%30%60%90%och 100%harts komponenter av A, B, och D endast för fyra timmar vardera vid rumstemperatur. Efter de 20 timmarna, förbereda en blandning av harts komponenter A, B, C, och D och inkubera i fyra timmar. Placera membranet bärare med cell pellet sida upp i platta inbäddning formar och fyll med harts blandning A, B, C och D.Place dem i en ugn för att polymerisera vid 60 grader Celsius i 24-36 timmar.Efter polymerisering, ta bort blocken från formen och placera provet i den vertikala chucken av ultra mikrotom där den kan visualiseras med förstoring. Separera membranbärare från blocket genom en kombination av dabbing flytande kväve på membranet transportören att separera metallen från plasten, och med hjälp av ett rakblad för att chip bort hartset runt membranet transportören. När separeras, försiktigt lyfta bort membranet transportören, lämnar cell pelleten kupolen på ansiktet av blocket.Placera blocket med den exponerade cellpelleten uppåt i en platt inbäddningsform som är något djupare än den första formen och fyll med hartskomponenterna A, B, C och D.Polymerisera vid 60 grader Celsius i 24-36 timmar. Trimma blocket runt cellpelletsen med hjälp av ett rakblad. Placera sedan blocket i provchucken på snittarmen på en ultramikrotom.Med hjälp av en glas- eller diamantkniv, trimma blocket till en trapetsform nära kring cellpelletsen. Erhåll 90 nanometer ultratunna sektioner av cellpelletsen med hjälp av en glas- eller diamantkniv. Plocka upp ett band av sektioner på ett TEM-rutnät.Torka gallret genom att blotta kanten på ett stycke filterpapper och förvara den i en TEM-rutbox. Montera gallret på TEM-hållaren och placera hållaren i mikroskopet. Använd en Tecnai T12 vid 80 kilovolt för screening av cryoAPEX-prover.Skaffa bilder av celler och subcellulära strukturer av intresse med APEX2-märkning. I denna studie resulterade beredning av provet med traditionella APEX-metoder i tydlig märkning av organiserade, släta endoplasmatiska retikalstrukturer. Vid hög förstoring, verkade staplade membranen ruggig och icke-enhetliga luckor var närvarande mellan koncentriska membran tätheter, som anger dålig membran bevarande och lipid extraktion.Provet som utarbetats av cryoAPEX hade också klart definierade märkning av organiserade, smidig endoplasmic reticulum strukturer, dock var membranen släta och parallellt och liten till ingen lipid extraktion sågs. TEM analys av 90 nanometer tunna sektioner visade att Huntington jäst interagerar protein E var närvarande i hela den perifera endoplasmic reticulum samt kärnhöljet. Dessutom löstes Huntingtonjäst interagerande protein E densitet i regelbundet fördelade högborgar längs luminala endoplasmic reticulum membranet.Huntingtonjäst interagerande protein E distribution och foci var också synliga i ett prov som utarbetats med traditionell fixering och uttorkning. Omfattande membran störningar och extraktion var dock närvarande, vilket gör provet suboptimal. APEX2-märkning utfördes med hjälp av tre cellulära markörer, varav mito-V5-APEX2 som specifik färgning av mitokondrierna endast och CAAX-APEX2 produceras distinkt färgning av plasmamembranet endast.Ingen märkning observerades i intracellulära organeller. Färgning för golgilumen bedömdes också med hjälp av en Alpha MAN2-APEX2-markör som beskrivs i vårt ursprungliga Sengupta et al manuskript. Efter detta förfarande, tredimensionella metoder såsom elektrontomografi eller fokuserad jonstrålen scanning elektronmikroskopi kan utföras i syfte att undersöka 3D-fördelningen av ett protein av intresse.Många av de kemikalier som används i detta protokoll är giftiga, så före användning bör säkerhetsdatablad konsulteras för att säkerställa att kemikalierna hanteras med hjälp av korrekt personlig skyddsutrustning och bortskaffas enligt institutionella riktlinjer.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-Fem: proteinlokalisering Använda Photo-aktiverad lokalisering Mikroskopi och elektronmikroskopi

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

En standardiserad metod för analys av lever Sinusformig endotelceller och deras fenestrationer genom svepelektronmikroskopi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Studera den supramolekylära organisationen av foto membran i Freeze-brutna bladvävnader av Cryo-svepelektronmikroskopi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Flerfärgade lokalisering mikroskopi av enda membranproteiner i organeller av levande däggdjursceller

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Cryo-Elektron mikroskopiska rutnät förberedelse för tidsuppgjorda studier med hjälp av ett nytt robotsystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategier för optimering av kryogen elektrontomografi dataförvärv

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Imaging Replicative Domains i ultrastrukturellt bevarat kromatin genom elektrontomografi

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...