Name: the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

Burada açıklanan protokol Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48tarafından yayınlanan bir yayın kaynaklanmaktadır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R01GM10092 (S.M.'ye) ve AI081077 (R.V.S.) hibeleri ile desteklenir. Ctsi-106564 (S.M.) Indiana Klinik ve Çeviri Bilimleri Enstitüsü ve PI4D-209263 (S.M.) Purdue Üniversitesi Enstitüsü Inflamasyon, İmmünoloji ve Bulaşıcı Hastalık için.

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon
<ol><li>60 mm çapında veya daha büyük bir doku kültürü çanak üzerinde tohum HEK-293T hücreleri ve 37 °C ve% 5 CO2bir hücre kültürü kuluçka içinde% 60-90 birleştiğinde büyür.</li>
	<li>Apex2 etiketli memeli ekspresyonu ile transfect hücreleri transfeksiyon reaktifi kullanarak (Bkz. Malzemeler Tablosu)üreticinin talimatlarına göre.</li>
	<li>Transfeksiyon sonrası 12-15 h'de hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkay...

Burada sunulan kriyoAPEX protokolü, hücreli ortamda membran proteinlerinin lokalizasyonunu karakterize etmek için sağlam bir yöntem sağlar. Genetik olarak kodlanmış APEX2 etiketinin kullanımı sadece ilgi çekici bir proteinin kesin lokalizasyonunu sağlamakla kalmıyor, cryofixation ve düşük sıcaklıklı dehidratasyon kullanımı çevredeki hücresel ultrayapının mükemmel korunmasını ve boyanması sağlar. Bu yaklaşımlar, hücre altı bağlamında yüksek hassasiyetle bir proteini yerelleştirmek iç...

Biyolojik çalışmalar genellikle hücre ve organeller içinde subsellüler protein lokalizasyonu çözme sorularını içerir. İmmünofloresan mikroskopisi protein lokalizasyonu yararlı bir düşük çözünürlüklü görünüm sağlar, ve süper çözünürlüklü görüntüleme son gelişmeler floresan etiketli proteinler için çözünürlük sınırlarını zorluyor1,2,3. Ancak, elektron mikroskobu (EM) yüksek çözünürlüklü hücresel ultrayapı görüntüleme için altın standart kalır, proteinlerin etiketleme bir sorun olmasına rağmen.
Tarihsel olarak, ultrastrüktürel protein lokalizasyonu sorularını n için çeşitli EM yöntemleri kullanılmıştır. En sık kullanılan yöntemlerden biri immünelektron mikroskobu (IEM), antijene özgü primer antikorlar ilgi proteintespit etmek için kullanılır. EM sinyali elektron yoğun parçacıklar ile konjuge sekonder antikorların uygulanması ile oluşturulur, en sık kolloidal altın4,5. Alternatif olarak, at turp peroksidaz (HRP) gibi enzimler ile konjuge antikorlar bir elektron yoğun çökelti üretmek için kullanılabilir6,7,8. IEM için ön katıştırma ve katıştırma sonrası etiketleme olarak adlandırılan iki ana yaklaşım vardır. Ön gömme IEM'de antikorlar doğrudan hücrelere tanıtılır, bu da9,10,11. Her iki adım da ultrayapıya zarar verebilir12,13. 1.4 nm nanogold ile konjuge bir antikor Fab parçası oluşan önemli ölçüde daha küçük antikorların geliştirilmesi çok nazik permeabilizasyon koşulları kullanılmasını sağlar; ancak, nanogold TEM altında doğrudan görselleştirme için çok küçük ve görünür olmak için ek geliştirme adımları gerektirir14,15,16. Katıştırma sonrası IEM'de, fiksasyon, dehidratasyon ve reşin17'yekatıştırma ile tam olarak işlenmiş hücrelerin ince kısımlarına antikorlar uygulanır. Bu yaklaşım permeabilizasyon adımı önler iken, örnek hazırlanması boyunca ilgi epitopkorunması zor18,19,20. Işık fiksasyon Tokuyasu yöntemi donma takip, kriyo-kesit, ve antikor tespiti gelişmiş epitop koruma sağlar21,22. Ancak, kriyo-ultramikrotomi teknik gereksinimleri, hem de hücrede elde edilen alt-optimal kontrast, dezavantajlarıvardır 23.
Genetik olarak kodlanmış etiketlerin kullanımı, iEM'nin ilgi proteininin saptanmasıyla ilgili birçok zorluklarını ortadan kaldırır. HrP, ferritin, ReAsH, miniSOG ve metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32dahil olmak üzere etiketleri çeşitli mevcuttur. Bunların her biri önceki yöntemlere göre avantajları vardır, ancak her biri de yaygın kullanımı engelleyen dezavantajları vardır. Bu sakıncaları ferritin etiketinin büyük boyutu sitosol HRP hareketsizlik arasında değişir, ReAsH ışık hassasiyeti, ve küçük boyutu ve metallothionein hücresel boyama ile uyumluluk eksikliği. Son zamanlarda, askorbat peroksidaz türetilen bir protein APEX233,34adlı bir EM etiketi olarak mühendislik olmuştur. Bir peroksidaz olarak, APEX2 3,3 'diaminobenzidin oksidasyon katalize edebilirsiniz,DAB),ilgi protein (az 25 nm)33,35 minimum difüzyon ile lokal EM kontrast sağlamak için osmiyum tetroksit ile reaksiyona bir çökelti üreten . Geleneksel HRP tabanlı yöntemlerin aksine, APEX2 son derece kararlıdır ve tüm hücresel bölmelerde aktif kalır33. Geleneksel EM örnek boyama ve çevredeki yapıların iyi görüntülenmesiiçin yöntemler kullanılarak TEM için numuneler işlenebilir33,34,36. Küçük boyutu, stabilitesi ve çok yönlülüğü nedeniyle APEX2 büyük potansiyele sahip bir EM etiketi olarak ortaya çıkmıştır.
Yukarıda tartışılan yaklaşımların çoğu, ultrastrüktürel koruma, cryofixation ve düşük sıcaklıklı donma-ikame sanatın mevcut durumu ile birleştirilemez veya henüz birleştirilmiştir. Böylece, doğru protein lokalizasyonunu belirlemek için membran koruma ve/veya hücre boyama eksikliğinden muzdarip olurlar. Bu, elde edilebilen verilerin çözümünü ve yorumlanmasını zorunlu olarak sınırlar. Yüksek basınç donma tarafından Cryofixation (HPF) yüksek basınçta sıvı azot örneklerinin hızlı donma içerir (~ 2,100 bar), hangi vitrifikasyon yerine sulu örneklerin kristalizasyonu neden, böylece yakın yerli devlet hücreleri koruyarak37,38,39. HPF'yi, osmiyum tetroksit ve uranyl asetat gibi tipik EM lekeleri ile birlikte asetonda düşük sıcaklık (-90 °C) dehidratasyon olan donma ikamesi (FS) takip eder. HPF ve FS birlikte geleneksel kimyasal fiksasyon üzerinde ayrı bir avantaj sağlar (eserler yol açabilir daha uzun bir süreç) ve oda sıcaklığında veya buz üzerinde alkol dehidratasyon (lipidler ve şekerlerin çıkarılmasına yol açabilir), ve böylece protein tespiti için en iyi EM etiketleri ile birleştirmek için arzu edilir.
HPF/FS'nin APEX2 etiketlemesi ile birleştirilememesinin bir nedeni, hafif kimyasal fiksasyonun dab reaksiyon uyrmacı ürününün difüzyonunu sınırlayan peroksidaz reaksiyonu için bir ön koşul olmasıdır. APEX2 çalışmalarında şimdiye kadar, fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonu boyama ve alkol dehidratasyon için geleneksel EM yöntemleri tarafından takip edilmektedir33,36. Ancak, HPF / FS ile kimyasal fiksasyon aşağıdaki geleneksel kimyasal fiksasyon ve alkol dehidratasyon tek başına40üzerinde koruma ayrı bir avantaj sağladığı gösterilmiştir. Geleneksel TEM örneklerinde görülen ultrastrüktürel bütünlük kaybı genellikle oda sıcaklığında veya buz üzerinde alkol kullanılarak yapılır dehidratasyon daha fiksasyon daha az bağlı görünür, ve lipidler ve şekerlerin çıkarılmasına yol açabilir40,41. CryoAPEX yöntemini geliştirmek için, kimyasal fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonunun, ardından HPF ve FS'nin, ultrayapısal koruma açısından optimum sonuç vereceğini varsaydık.
Burada, APEX2 etiketlemesini cryofixation ve freeze ikame yöntemleriyle birleştiren cryoAPEX protokolünü sıyoruz (Şekil 1). Bu basit protokol ilgi apex2 etiketli protein transfeksiyon oluşur, hücrelerin kimyasal fiksasyon, ve peroksidaz reaksiyonu. HPF ve FS daha sonra tipik reşin katıştırma ve ince kesit ler yapılır. TEM görüntüleme, bu yöntemle ultrayapının mükemmel bir şekilde korunmasını ortaya koymaktadır. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü subsellüler lokalizasyon ve bir endoplazmik retikulum (ER) lümenal proteinin mekansal dağılımı gözlendi. Bu yöntem elektron mikroskobu analizi için hücreler de membran protein lokalizasyonu nun saptanmasında yaygın olarak yararlıdır. Elimizde, yöntem hek-293T (insan embriyonik böbrek), HeLa (insan rahim ağzı kanseri), Cos7 (Afrika yeşil maymun böbrek fibroblast) ve BHK (bebek hamster böbrek) dahil olmak üzere doku kültüründe yetiştirilen hücre hatları çeşitli için başarıyla çalıştı. Ayrıntılı talimatlar hek-293T hücreleri kullanılarak aşağıda açıklanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (Glass Distilled)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers; Plastic, Disposable 120 cc</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>60952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Storage Vials, 2 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44611-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44612-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44613-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM Fluka,single component D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44614-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td>
			<td>Corning</td>
			<td>355104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knife Boats, 6.4 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Knifemaker</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer with Rapid Transfer System</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM PACT2</td>
			<td>Archived Product Replaced by Leica EM ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-266-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16707898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide, crystalline</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td>
			<td>Mager Scientific</td>
			<td>16702738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF2010-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102090-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS)</td>
			<td>Avantor Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7708-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Glass Knife Strips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate Dihydrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cryoapex method for electron microscopy analysis of membrane protein localization within ultrastructurally-preserved cells

Sinyal iletimi ve membran ticareti gibi önemli hücresel olaylar hücre kompartmanları içinde uygun protein konumuna dayanır. Proteinlerin kesin hücre altı lokalizasyonunu anlamak birçok biyolojik sorunun yanıtlanması için önemlidir. Yeterli hücresel koruma ve boyama ile birlikte protein lokalizasyonunu belirlemek için sağlam bir etiket arayışı tarihsel olarak zor olmuştur. Elektron mikroskobu (EM) görüntülemedeki son gelişmeler, hücresel koruma ve etiket hedef proteinlerini artırmak için birçok yöntem ve stratejinin geliştirilmesine yol açmıştır. Nispeten yeni peroksidaz bazlı genetik etiket, APEX2, klonlanabilir EM-aktif etiketleri umut verici bir liderdir. İletim elektron mikroskobu (TEM) için örnek hazırlama da son yıllarda yüksek basınç donma (HPF) ve düşük sıcaklık dehidratasyon ve donma ikamesi (FS) ile boyama ile cryofixation gelişiyle gelişmiştir. HPF ve FS, TEM görüntüleme için hücresel ultrayapının mükemmel korunmasını sağlar, vitreus örneklerinin doğrudan kriyo-görüntülemesi için ikinci sıradadır. Burada HPF ve FS ile APEX2 etiketinin kullanımını birleştiren cryoAPEX yöntemi için bir protokol salıyoruz. Bu protokolde, ilgi bir protein APEX2 ile etiketlenir, ardından kimyasal fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonu. Oda sıcaklığında geleneksel boyama ve alkol dehidratasyon yerine, örnek kriyofixed ve FS ile düşük sıcaklıkta dehidratasyon ve boyama uğrar. CryoAPEX kullanılarak, sadece ilgi bir protein hücre altı bölmeleri içinde tespit edilebilir, ama aynı zamanda ek bilgi yapısal olarak korunmuş bir membran içinde topolojisi ile ilgili olarak çözülebilir. Bu yöntemin, bir organel lümen içindeki protein dağılım modellerini deşifre edecek ve bir organel içindeki proteinin diğer etiketlenmemiş organellere yakın bir şekilde bölümlere ayrılmasını ayırt edecek kadar yüksek çözünürlük sağlayabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, cryoAPEX usulen basit ve doku kültüründe yetişen hücreleriçin münasip. Bu teknik olarak tipik cryofixation ve dondurma ikame yöntemleri daha zor. CryoAPEX, genetik olarak etiketlenebilen herhangi bir membran proteininin TEM analizi için yaygın olarak uygulanabilir.

KriyoAPEX yöntemini kullanarak ultrayapısal korumayı geleneksel fiksasyon ve dehidratasyonla karşılaştırmak için endoplazmik retikulum membranının (ERM; ER membran) peptid APEX2 ile etiketlendi ve HEK-293T hücrelerine transfected. ERM-APEX2 ER'nin sitoplazmik yüzüne lokalize olur ve ER yapısını organize pürüzsüz ER (OSER)34,42,43olarak bilinen morfolojik olarak farklı yapılara dönüştürür. OSER morfoloji...

Watch this Scientific Journal Video about The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells at JoVE.com

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Bu yöntem aynı zamanda membran bütünlüğü ve hücre altı mimarisi ni koruyarak bir membran proteiniçin leke yeteneği birleştirir. Yani bir zarla ilişkili proteini tam olarak lokalize etmek için gerçekten güçlüdür. Bu tekniğin en büyük avantajı, cryofixation ve freeze ikamesi de dahil olmak üzere elektron mikroskobu için hücresel koruma da son teknoloji yöntemleri ile sağlam bir genetik klonlanabilir etiket, APEX2 kullanımı birleştirir.Birlikte, bu iyi korunmuş bir hücre içinde hassas protein lokalizasyonu sağlar. Bu protokol, virüslerin ana hücre içinde çoğaldığı mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Virüsler genellikle kendi enfeksiyon düzeni sırasında konak proteinleri kaçırmak olacaktır.Virüsler, bu konak hücrelerin içinde çoğalmak için kullandıkları küçük genomlardır. Son zamanlarda, yayınlanmamış verilerle bu proteinleri virüslerin nasıl çoğaldığını anlamak için bu teknolojiyi kullanarak etiketleyebildik. Bu teknik golgi arıza neden olan bir bakteriyel toksin üzerinde son ortak çalışmada gerçekten kritik olduğunu kanıtladı.CryoAPEX kullanarak, biz tam parçalanmış golgi parçaları ile toksin lokalize başardık, aksi takdirde normal immünororesans teknikleri kullanarak görmek gerçekten zor bir şey. Bu tekniği gösteren Elaine Mihelc, bir lisansüstü öğrenci ve araştırma görevlisi, Stephanie Angel, bizim laboratuvarlardan olacaktır. Çanak hek293 hücreleri tohumlama sonra, APEX2 ile hücreleri transfect üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reaktif kullanarak memeli ekspresyonu plazmidler etiketli.Transfeksiyon sonrası 12-15 saat, pbs ile bir kez hücreleri yıkayın. Daha sonra, 15 mililitrelik konik tüp içine çanak PBS ile hücreleri yıkayın. 5dakika 500 x g'de santrifüj.Dikkatle supernatant çıkarın ve oda sıcaklığında pH 7.4 de% 2 glutaraldehit ve 0.1 molar sodyum cacodylate tampon iki mililitre pelet yeniden askıya. 30 dakika kuluçka için buz üzerinde örnek yerleştirin. Daha sonra, 4 santigrat derece beş dakika için 500 x g örnek pelet.Peleti her biri 0,1 molar sodyum kacodylate tamponunun iki mililitresi ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın. Peroksidaz reaksiyonu gerçekleştirmek için, 500 x g'de 500 x g'da beş dakika peletleme nin ardından üç mililitre DAB çözeltisi içinde yeniden askıya alarak peleti yıkayın.Sonra, 5.88 milimoler hidrojen peroksit ile DAB çözeltisi üç mililitre pelet yeniden askıya. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat. Pelet görünür kahverengi renkli olur, çözünmez DAB reaksiyon ürün varlığını gösteren.El yazmasına göre, DMEM'de sodyum kacodylate tamponu ile tekrar yıkandıktan sonra, %10 fetal sığır serumu ve %15 büyükbaş serum albumin içeren DMEM'in kriyoprotektif çözeltisinin 500 mikrolitresinde hücre peletini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 0.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü aktarın. Pelet tekrar, biraz 500 x g santrifüj hızını artırarak.Peletin kuruması için yeterli sıvının kalmasını sağlayarak supernatantın çoğunluğunu atın. Wick uzak bir laboratuvar silme veya kağıt havlu köşesini kullanarak hücre pelet kalan sıvı. Yeterince sıvı pelet diş macunu tutarlılık benzer bir hamur oluşturur kalsın.Hücre peletinin 2-3 mikrolitresini aspire edin ve bir membran taşıyıcısına yatırın. Membran taşıyıcısının kuyuyu tamamen doldurun, böylece yüzey gerilimi üstte hafif bir kubbe oluşturur. Membran taşıyıcısını kartuşa doğru kaydırın ve emniyete alanın.Kartuşun hazırlanmış ve astarlanmış HPF makinesine yerleştirin ve donmaya başlayın. Kartuşları sıvı nitrojene batırılmış olarak tutarak, membran taşıyıcısını kartuşundan çıkarın. Plastik bir kapsül içine yerleştirin ve sıvı nitrojen dolu bir Cryovial içine plastik kapsül yerleştirin.Kimyasal bir başlık, hacim tannik asit ve bir Cryovial aseton% 5 DI su ile% 0.2 ağırlık çözeltisi başına bir mililitre hazırlamak. Dondurmak için sıvı nitrojen içine yerleştirin. Donma ikame karışımı bir şişe ve dondurulmuş hücre pelet içeren Cryovials dondurma ikame birimleri örnek odasına yerleştirin.Membran taşıyıcısını içeren iç kapsülü sıvı azot şişesinden ilgili şişeiçeren donma ikame karışımına aktarın. 90 santigrat derecede bir dondurma değiştirme protokolü başlatın. 24 saat sonra, dondurma ikamesini duraklatın ve numuneleri 90 santigrat dereceye kadar soğutulmuş aseton ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.Daha sonra, kimyasal bir başlık, bir Cryovial aseton% 1 osmiyum tetroksit, 0.2% uranyl asetat ve% 5 DI su bir çözelti nin numune başına bir mililitre hazırlamak ve dondurmak için sıvı nitrojen yerleştirin. Freeze ikame birimi içine iki karışımı ile Cryovials yerleştirin ve dondurma ikame karışımı içine üçüncü aseton yıkama kapsül leri aktarın iki şişe. Onları kuluçkave dondurma ikame karışımı 90 santigrat derece 72 saat için iki, 12-18 saat içinde sıfır derece santigrat kademeli ısınma izledi.Sıcaklığı sıfır derecede tutun ve şişelere önceden soğutulmuş aseton ekleyerek her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Üreticinin talimatlarına göre plastik bir kabın tercih edilen bir reçin karışımı hazırlayın ve kapsülbatık için şişeler içine% 2 4 ve% 8 reçin ekleyin. Her biri sıfır derecede iki saat kuluçkaya yat.Daha sonra, oda sıcaklığında her biri dört saat boyunca %15%30%60%90 ve A, B ve D'nin %100 reçine bileşenlerinde kuluçkaya yatırın. 20 saat sonra, rekarn bileşenleri A, B, C ve D karışımı nı hazırlayın ve dört saat kuluçkaya yatırın. Hücre pelet tarafı ile membran taşıyıcıları düz gömme kalıplara yerleştirin ve 24-36 saat boyunca 60 derecede polimerize etmek için bir fırına reşin karışımı A, B, C ve D.Place onları doldurun.Polimerizasyondan sonra, kalıptaki blokları çıkarın ve numuneyi büyütme ile görselleştirilebilen ultra mikrotomun dikey aynasına yerleştirin. Membran taşıyıcısını, metali plastikten ayırmak için membran taşıyıcısında sıvı nitrojen inip bir kombinasyon oluşturarak ve membran taşıyıcısının etrafındaki resenin yongasını parçalamak için bir jilet kullanarak bloktan ayırın. Ayrıldığınızda, yavaşça blok yüzünde hücre pelet kubbe bırakarak, membran taşıyıcı kaldırın.İlk kalıptan biraz daha derin olan düz bir katıştırma kalıbına bakacak şekilde bloğu açıkta kalan hücre peletini yerleştirin ve 24-36 saat boyunca 60 derecede A, B, C ve D.Polimerize rezorabileşenleriyle doldurun. Bir jilet kullanarak hücre pelet etrafında blok kırpın. Daha sonra ultra mikrotomun kesit koluna blok uyerleştirin.Bir cam veya elmas bıçak kullanarak, hücre pelet çevreleyen bir yamuk şeklinde blok kırpın. Bir cam veya elmas bıçak kullanarak hücre pelet 90 nanometre ultra ince bölümleri elde edin. TEM şebekesindeki bölümlerden oluşan bir şerit seçin.Kenarı bir filtre kağıdı üzerinde lekeleyerek ızgarayı kurutun ve TEM ızgara depolama kutusunda saklayın. Izgarayı TEM tutucuya monte edin ve tutucuyu mikroskoba yerleştirin. CryoAPEX numunelerinin taranması için 80 kilovolt'ta Tecnai T12 kullanın.APEX2 etiketleme ile hücrelerin ve hücre altı yapıların görüntülerini edinin. Bu çalışmada, numunenin geleneksel APEX yöntemleri ile hazırlanması organize, pürüzsüz endoplazmik retikulum yapılarının açık bir şekilde etiketletilmesi ile sonuçlanmıştır. Yüksek büyütme de, yığılmış membranlar kabarık ve konsantrik membran yoğunlukları arasında tekdüze olmayan boşluklar mevcut olarak ortaya çıktı, kötü membran koruma ve lipid çıkarma gösteren.CryoAPEX tarafından hazırlanan örnek de organize, pürüzsüz endoplazmik retikulum yapıların açıkça tanımlanmış etiketleme vardı, ancak, membranlar pürüzsüz ve paralel ve çok az lipid ekstraksiyon görüldü. 90 nanometre inceliğinde yapılan TEM analizi, Huntington mayası etkileşen protein E'nin periferik endoplazmik retikulum ve nükleer zarf boyunca mevcut olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca, Huntington maya etkileşimprotein E yoğunluğu luminal endoplazmik retikulum membran boyunca düzenli aralıklı foci içine çözüldü.Huntington mayası etkileşen protein E dağılımı ve foci de geleneksel fiksasyon ve dehidratasyon ile hazırlanan bir örnekte görülebilir. Ancak, geniş membran bozulması ve ekstraksiyon, örnek suboptimal hale mevcuttu. APEX2 etiketleme sito-V5-APEX2 sadece mitokondri ye özgü boyama sağlayan ve CAAX-APEX2'nin sadece plazma zarında belirgin boyama ürettiği üç hücresel belirteç kullanılarak yapıldı.Hücre içi organellerde etiketleme gözlenmedi. Golgi lümeniçin boyama da orijinal Sengupta ve ark el yazması açıklandığı gibi bir Alpha MAN2-APEX2 marker kullanılarak değerlendirildi. Bu işlemden sonra, bir proteinin 3Boyutlu dağılımını araştırmak için elektron tomografisi veya odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu gibi üç boyutlu yöntemler uygulanabilir.Bu protokolde kullanılan kimyasalların çoğu toksiktir, bu nedenle kullanılmadan önce, kimyasalların uygun kişisel koruyucu ekipmanlar kullanılarak işlendiğinden ve kurumsal kurallara uygun olarak bertaraf edilmesini sağlamak için güvenlik veri levhalarına danışılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Kriyojenik Elektron Tomografi Veri Kazanımının Optimizasyonu stratejileri

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Elektron Tomografisi ile Ultrayapısal Olarak Korunmuş Kromatinde Görüntüleme Replikasyon Alanları

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...