Name: inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen (2019), Sanming Project of Medicine i Shenzhen (SZSM201412020), Fonden for Højt Niveau Medicinsk disciplin Konstruktion af Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY201602204849975, GJHZ201703141713575556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Videnskabelig Forskning Foundation of Guangdong-provinsen i Kina (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Alle procedurer i denne protokol fulgte principperne om dyrevelfærd i Den Etiske Review Committee of Shenzhen Second People's Hospital. Islet graft modtagere og donorer var 8- til 10-uger gamle C57BL/6 mandlige mus købt fra Medical Animal Center i Guangdong-provinsen. Proceduren for høst, isolation, kultur eller administration af de høstede celler blev udført under aseptiske forhold.
1. Forberedelse af
<ol><li>Forbered en kollagen type V arbejdsløsning. Afveje kollagen type V og opløs...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).</li><li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+for+Type+1+Diabetes:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).</li><li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now.">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).</li><li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets.">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li><li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation.">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li><li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation.">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li><li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+islet+transplantation:+is+the+future+finally+now.">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li><li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients,+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants.">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li><li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes:+recent+advances+and+future+challenges.">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li><li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation?+Review+article.">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li><li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment.">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li><li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver.">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li><li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation:+alternative+sites.">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li><li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation.">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse.">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).</li><li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model.">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li></ol>

Bugspytkirtel-olet transplantation er en lovende behandling til behandling af T1DM. Effekten af denne behandling påvirkes af mange faktorer og vælge et optimalt sted for islet implantation er yderst vigtigt. Det ideelle anatomiske sted for transplantation af fjorde bør have følgende karakteristika: tilgængelighed for simpel transplantation, biopsi og procedurer for transplantation af transplantater; reducerede komplikationer; høj succesrate for blodsukkerkontrol; og langvarig overlevelse af islettransplantaterne<su...

Den verdensomspændende forekomst og forekomst af type 1 diabetes mellitus (T1DM) er hurtigt stigende, ifølge de statistiske data fra International Diabetes Federation (IDF)1. Islettransplantation er en af de mest lovende tilgange til behandling af T1DM4. Da det store gennembrud i klinisk elet transplantation ved hjælp af Edmonton protokol2 blev rapporteret, fungerende islet graft overlevelse i T1DM modtagere efter 5 år nu når omkring 50%3.
I fortiden, flere transplantationssteder, såsom leveren, nyre kapsel, milt, intramuskulær region, subkutan plads, knoglemarv, og omental pose blev undersøgt for eksperimentel øtransplantationtransplantation 5,6,7. Nogle af de ovennævnte steder er blevet testet i kliniske indstillinger8. Selv om ø-transplantation i leveren er fortsat den mest udbredte metode i klinisk anvendelse på nuværendetidspunkt 9,der er flere vigtige problemer at løse, når du bruger dette websted. For eksempel, hvordan man kan reducere tidligt tab af de transplanterede holme forårsaget af instant blod medieret inflammatorisk reaktion (IBMIR) og dårlig iltning levering10,11 og hvordan man kan hente holmen grafts hvis det er nødvendigt, fordi de diffust lokalisere i leveren. Renal-kapslen kan være et ideelt sted for gnavere modtagere. Den stramme nyrekapsel begrænser imidlertid transplantationen af tilstrækkelige allogene holme hos mennesker, selv om den kan være bedre egnet til øxenotransplantation på grund af de meget rensede porcineøpræparater, der anvendes klinisk5,12. Derfor er søgningen efter et mere egnet sted for lettransplantation i gang.
Det subkutane rum kan anvendes som et klinisk anvendeligt sted for ø-transplantation på grund af dets tilgængelighed. Men effektiviteten af ø-transplantation i det subkutane rum er ekstremt lav, hvilket kræver et relativt stort antal holme til at vende hyperglykæmi13. For nylig fandt en japansk forskerhold ISWAT, en roman subkutan site overlegen for ø-transplantation i en murine model i forhold til leveren14. ISWAT indeholder epigastrisk arterie og vene, så den rige blodforsyning kan sikre ø-graft revaskularisering. I dette manuskript foreslår vi en nem implantationsmetode ved hjælp af en kældermembranmatrix hydrogel til at reparere de nyeste murineholme i ISWAT. Denne protokol viser sig effektiv til transplantation af fjord.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe-driven Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pasteur pipette</td>
			<td>JingAn Biological, China</td>
			<td>J00085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 surgical suture</td>
			<td>sh-Jinhuan, China</td>
			<td>CR537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>9180527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Glucagon antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10988</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse insulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3014s</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-pointed perfusion needle</td>
			<td>Oloey, China</td>
			<td>005</td>
			<td>32G, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Meilune, China</td>
			<td>MB4219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Medical Animal Center of Guangdong Province</td>
			<td></td>
			<td>8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL, China</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>General,Non-treated,87.8 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalosporin</td>
			<td>Lukang medical, China</td>
			<td>150303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codos Pet Clipper</td>
			<td>Szcodos, China</td>
			<td>CP-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase Type V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-hank&#39;s buffer</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5140-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining media</td>
			<td>Beyotime Biotech, China</td>
			<td>C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel-loading pipet tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin staining media</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14166S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1119</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>5190313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-tight culture dish</td>
			<td>DVS, China</td>
			<td>AN-5058548</td>
			<td>self-made, glass dish sprayed with black paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Adhesive Tape</td>
			<td>Cofoe, China</td>
			<td>K12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-invasive microtweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11033-11 and F12016-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>33391713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12012-12 and S11001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (penicillin / streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STZ (streptozotocin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Strip</td>
			<td>GenUltimate</td>
			<td>100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>SA00007-2</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamp</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R31006-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets

Pancreas islet transplantation er en veletableret terapeutisk behandling for type 1 diabetes. Nyrekapslen er det mest almindeligt anvendte sted for islettransplantation i gnavermodeller. Men, den stramme nyre kapsel begrænser transplantation af tilstrækkelige holme i store dyr og mennesker. Det ekutane subkutane hvide fedtvæv (ISWAT), et nyt subkutant rum, blev anset for at være et potentielt værdifuldt sted for ø-transplantation. Dette websted har bedre blodforsyning end andre subkutane rum. Desuden, ISWAT rummer en større dråbemasse end nyrekapsel, og transplantation i det er enkel. Dette manuskript beskriver proceduren for museøse isolation og transplantation i ISWAT site af syngeneic diabetisk mus modtagere. Ved hjælp af denne protokol, murine pancreas øer blev isoleret af standard kollagen fordøjelse og en kælder membran matrix hydrogel blev brugt til fastsættelse af rensede holme i ISWAT site. Blodsukkerniveauet for recipientmusene blev overvåget i mere end 100 dage. Isletgrafts blev hentet på dag 100 efter transplantation for histologisk analyse. Protokollen for lettransplantation i ISWAT-webstedet, der er beskrevet i dette manuskript, er enkel og effektiv.

To procedurer er indført i denne protokol: murine islet præparat og fjord transplantation i ISWAT site. I den første procedure, efter perfusing og fordøje med type V collagenase opløsning, rense med Histopaque-1119 og Histopaque-1077 og en ekstra hånd-picking trin, vil de isolerede murine holme være tilstrækkeligt ren til transplantation (som vist i figur 1), og de isolerede holme, der har en høj levedygtighed vil blive brugt til transplantation (som vist i figu...

Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

I denne protokol beskrives en metode til murineøsisolation og transplantation i det subkutane hvide fedtvæv. Isolerede murineholme transplanteres til en murinemodtager ved hjælp af en kældermembranhydrogel. Modtagernes blodsukkerniveau overvåges, og histologianalysen af islingtransplantaterne udføres.

Inguinal Subkutan hvidt fedtvæv (ISWAT) Transplantation Model af Murine Holme

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Islet transplantation er en af de mest lovende tilgange til behandling af type I diabetes mellitus. Og jagten på et egnet sted for ø-transplantation er i gang. Islet transplantation til den lyskeagtige subkutane hvide fedtvæv er en enkel, men effektiv metode, der kan have kliniske konsekvenser.Ekstrapolering af denne procedure til klinikken kan føre til udvikling af en kur mod type I diabetikere. Denne metode kan give indsigt i klinisk øtransplantation, da det flersprogede er blevet besluttet ikke at være et ideelt sted for ø-indkaptning. Det er vigtigt at nøje følge hvert trin i proceduren, især vigtige trin, såsom bugspytkirtlen fordøjelsen.Visuel demonstration vil hjælpe forskere nye til teknikken til bedre at bestemme, hvordan man udfører øen isolation og transmutation. For ø-høst, først spray pelsen af en 10 uger gammel C57 sort seks mus med 75% ethanol, og fyld en fem milliliter sprøjte med frisklavet kollagenopløsning. Udstyr sprøjten med en 32-gauge bøjning stump spids perfusion nål, og læg musen i liggende position på en ispose.Brug lige spidse oftalmologiske saks til at lave en tværgående åbning i huden af skambenet område, og udvide snittet mod hovedet af dyret. Helt åbne maven via en V-snit fra pubetisk regionen til xiphoid processen, og flytte leveren til at udsætte galdeblæren og hele længden af den fælles galdegang. Brug derefter en vaskulær klemme til at lukke den duodenal åbning af den fælles galdegang og skære en lille åbning i galdeblæren.Kannulate den fælles galdegang gennem åbningen med den tidligere forberedte perfusion nål, og injicere ca. to milliliter kollagenopløsning i bugspytkirtlen. Når alle kollagenase er blevet leveret, bruge to par noninvasive mikro pincet til at adskille perfundere bugspytkirtlen fra tarmene, mave, og milt, og placere bugspytkirtlen i en 50 milliliter konisk rør på is. Når alle prøverne er indsamlet, tilsættes 100 mikroliter dnase I pr. bugspytkirtel til de 50 milliliterrør og kraftigt ryste hvert rør omkring 40 gange over en periode på 10 sekunder, før væv i en 37 grader Celsius vandbad i tre til fem minutter med moderat rystelser.Ved slutningen af inkubationen, tilsættes op til et endeligt volumen på 50 milliliter Stop Solution til at standse fordøjelsen. Og puls centrifuge rørene til en hastighed på 750 gange G ved fire grader Celsius før hurtigt at stoppe centrifuge. Efter at supernatanterne er kasseret, vaskes pillerne to gange i 15 til 25 milliliter Stop Solution per vask under de samme centrifugeringsforhold, som netop påvist.Efter den anden vask, pool tre pellets pr rør i nye 50 milliliter koniske rør. Og resuspend bugspytkirtlen celler i et samlet volumen af ti milliliter histopaque 1119. Næste forsigtigt tilføje fem milliliter histopaque 1077 ned siden af hvert rør, efterfulgt af fem milliliter HBSS.Adskjling af cellerne ved centrifugering og brug en pasteurpipette på fem milliliter til at indsamle holmene fra HBSS Histopaque 1077-grænsefladen. Bassin holmene i et nyt konisk rør på 50 milliliter i et endeligt volumen på 50 milliliter Stop Solution til impulscentrifugering, og supernatanten kasseres. Opsplit pellet i 30 milliliter frisk Stop Solution for en et minut centrifugering, og resuspend holmene i 30 milliliter kultur medium.Dekanter holmene i en 10 centimeter lystæt kulturskål pr. rør. Og læg skålen under stereomikroskopet. Ved hjælp af 200 mikroliter gel-loading pipette tips, håndplukke de hvide sfæriske holme fra opløsningen.Placering af holmene i en ubehandlet cellekulturskål, der indeholder 10 milliliter kulturmedium, efterhånden som de høstes. Kontroller renheden af de håndplukkede holme ved dithizone farvning under et let mikroskop. Og opdage levedygtigheden af holmene ved fluorescein diacetat propidium iodid farvning under en florescent mikroskop.Derefter kultur de isolerede holme i frisk kultur medium ved 37 grader Celsius i 95% luft og 5% kuldioxid indtil transplantation. Startdage tre og fire efter diabetes induktion, punktere haleåre af hver streptozotocin-injiceres otte uger gamle mandlige C57 sort seks mus omkring 10:00 a.m. at indsamle en blodprøve fra hver modtager dyr.Brug en grundlæggende blodsukkerovervågning instrument til at bestemme den ikke-fastende blodsukkerniveau af hver mus og derefter tilføje blodet på individuelle teststrimmel. Når et dyr har vist et blodsukkerniveau på mindst 20 millimoler pr. liter to dage i træk, vejes og mærkes modtagerens mus, og bekræft manglende reaktion på pedalrefleksen hos de bedøvede dyr. Placer en aliquot af hydrogel fra minus 20 grader Celsius opbevaring på is til optøning.Og overføre 450 til 500 øækvivalenter pr. modtager til et sterilt 1,5 milliliter centrifugerør indeholdende 200 mikroslitere medium pr. rør på is. Podning venstre lyskeområde af modtageren med 75% ethanol og placere musen i liggende position. Fix lemmerne med kirurgisk tape, og brug klippere til at fjerne håret omkring operationsstedet.Podning det kirurgiske område med iodophor og gøre et lodret snit i den desinficerede hud. Identificer den ringere epigastriske arterie og vene i ISWAT og skabe en lille lomme over fartøjerne. Sediment holmene ved centrifugering og fjerne så meget supernatant som muligt.Tilføj 20 mikroliter optøet hydrogel til hvert rør, og forsigtigt resuspenderede holmene, idet du skal passe på at undgå bobler. Når der er opnået en homogen suspension, skal du bruge en 200 mikroliterpipettespids til omhyggeligt at levere hele lommens hydrogelblanding fra et rør i lommen. Når hydrogel har helt størknet, tilføje 20 mikroliter af cephalosporin til transplantationsstedet, og lukke muskler og hud med en 5-0 kontinuerlig kirurgisk sutur.Derefter placere modtageren i et rent bur på en termisk pad med overvågning, indtil fuld recumbency. Efter murine ø behandling som påvist, vil de isolerede murine holme være tilstrækkeligt ren til transplantation. Kun isolerede holme med høj levedygtighed bør anvendes til transplantation.Efter grundig blanding af øtransplantater med hydrogel kan transplantatet implanteres i ISWAT-stedet. Efter ca. en måneds transplantation i ISWAT vender øtransplanterne hyperglykæmi, mens kropsvægten af recipientmus gradvist øges. 100 dage efter transplantationen medfører fjernelse af transplantaterne en øjeblikkelig stigning i 10:00 a.m.blodsukkerniveauet, der ikke er fastende. Histologisk analyse på dette tidspunkt, afslører, at øen grafts er forblevet intakt. Og insulin og glukagon immunofluorescerende farvning viser, at de transplanterede holme er også funktionelle på 100 dage efter transplantation.Pas på ikke at ryste de profunderede bugspytkirtelceller for robust ellers evnen af de opnåede holme vil blive kompromitteret. Isolerede øer kan transplanteres under nyrekapslen som en kontrol for at sammenligne virkningerne af den isolerede transplantation i det lyskeagtige subkutane hvide fedtvæv på stedet. Proceduren vil tilføje indledning af kliniske forsøg med ø-transplantation til andre steder ud over leveren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Musemodel af kirurgisk induceret Endometriose af Auto-transplantation af uterin væv

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Udvikling af obliterativ bronchiolitis i en musemodel for Orthotopisk lungetransplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Muse Livmoderhalskræft Heart transplantation model ved hjælp af en modificeret Cuff Teknik

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantation af pulmonale ventilen med en musemodel af Heterotop Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murin hornhindetransplantation: en model til at studere den mest almindelige form for organtransplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Indkapsling Thermogenic præadipocytter for transplantation i fedtvæv Depoter

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Et alsidigt murin model af subkortikale White Matter Stroke for Studiet af axonal degeneration og White Matter Neurobiologi

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Oprettelse og Transplantation af et fedtholdigt-afledte stamceller (ASC) ark i en diabetisk sårheling Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknik til subkutan Abdominal fedtvæv biopsi via en ikke-Diatermi metode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantation af fedtvæv-afledte stamceller ark til at reducere udsivningen efter delvis kolektomi i en rotte Model

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...