Name: inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van national key R&D Program of China (2017YFC103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medische Discipline Bouw van Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medisch Scientific Research Foundation van de Chinese provincie Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Alle procedures in dit protocol volgden de principes van dierenwelzijn van de Ethics Review Committee van Shenzhen Second People's Hospital. Islet graft ontvangers en donoren waren 8- tot 10-week oude C57BL / 6 mannelijke muizen gekocht van het Medisch Dier Centrum van de provincie Guangdong. De procedure van het oogsten, isoleren, cultuur of toediening van de geoogste cellen werd uitgevoerd in aseptische omstandigheden.
1. Voorbereiding van het aantal van de hoogte
<ol><li>Bereid een collag...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).</li><li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+for+Type+1+Diabetes:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).</li><li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now.">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).</li><li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets.">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li><li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation.">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li><li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation.">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li><li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+islet+transplantation:+is+the+future+finally+now.">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li><li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients,+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants.">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li><li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes:+recent+advances+and+future+challenges.">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li><li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation?+Review+article.">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li><li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment.">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li><li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver.">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li><li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation:+alternative+sites.">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li><li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation.">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse.">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).</li><li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model.">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li></ol>

Alvleeskliereilandjetransplantatie is een veelbelovende therapie voor de behandeling van T1DM. Het effect van deze therapie wordt beïnvloed door vele factoren en het kiezen van een optimale plaats voor het implanteren van het aantal bezoekers is uiterst belangrijk. De ideale anatomische plaats voor eilandjetransplantatie moet de volgende kenmerken hebben: toegankelijkheid voor eenvoudige transplantatie,biopsie en procedures voor het ophalen van grafts; verminderde complicaties; hoge slagingspercentage van de bloedglucos...

De wereldwijde incidentie en prevalentie van type 1 diabetes mellitus (T1DM) nemen snel toe, volgens de statistische gegevens van de International Diabetes Federation (IDF)1. Eilandjestransplantatie is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van T1DM4. Aangezien de grote doorbraak in klinische eilandjetransplantatie met behulp van het Edmonton protocol2 werd gemeld, functioneert het overleven van eilandjes bij T1DM-ontvangers na 5 jaar nu ongeveer 50%3.
In het verleden werden verschillende transplantatielocaties onderzocht, zoals de lever, niercapsule, milt, intramusculaire regio, onderhuidse ruimte, beenmerg en een omental zakje voor experimentele eilandjetransplantatie5,6,7. Sommige van de bovenstaande sites zijn getest in klinische instellingen8. Hoewel eilandjetransplantatie in de lever de meest gebruikte methode blijft in klinische toepassing op dit moment9,zijn er verschillende belangrijke problemen aan te pakken bij het gebruik van deze site. Bijvoorbeeld, hoe vroeg verlies van de getransplanteerde eilandjes veroorzaakt door de instant bloed gemedieerde ontstekingsreactie (IBMIR) en slechte oxygenatietoevoer10,11 te verminderen en hoe de eilandjegrafts terug te halen indien nodig, omdat ze diffuus lokaliseren in de lever. De niercapsule kan een ideale plek zijn voor knaagdierontvangers. De strakke niercapsule beperkt echter de transplantatie van voldoende allogene eilandjes bij de mens, hoewel het beter geschikt kan zijn voor eilandje xenotransplantatie als gevolg van de sterk gezuiverde varkenseilandletpreparaten die klinisch worden gebruikt5,12. Daarom is de zoektocht naar een meer geschikte site voor eilandjetransplantatie in volle gang.
De onderhuidse ruimte kan worden gebruikt als een klinisch toepasbare locatie voor eilandjetransplantatie vanwege de toegankelijkheid ervan. De efficiëntie van eilandjetransplantatie in de onderhuidse ruimte is echter extreem laag, waardoor een relatief groot aantal eilandjes nodig is om hyperglykemie te keren13. Onlangs vond een Japans onderzoeksteam de ISWAT, een nieuwe onderhuidse site superieur voor eilandjetransplantatie in een murine model in vergelijking met de lever14. De ISWAT bevat de epigastrische slagader en ader, dus de rijke bloedtoevoer kan zorgen voor het revascularisatie van het levene ent. In dit manuscript stellen we een eenvoudige implantatiemethode voor met behulp van een keldermembraanmatrixhydrogel om synogenische urineeilandjes in de ISWAT te fixeren. Dit protocol blijkt effectief voor eilandjetransplantatie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe-driven Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pasteur pipette</td>
			<td>JingAn Biological, China</td>
			<td>J00085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 surgical suture</td>
			<td>sh-Jinhuan, China</td>
			<td>CR537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>9180527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Glucagon antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10988</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse insulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3014s</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-pointed perfusion needle</td>
			<td>Oloey, China</td>
			<td>005</td>
			<td>32G, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Meilune, China</td>
			<td>MB4219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Medical Animal Center of Guangdong Province</td>
			<td></td>
			<td>8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL, China</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>General,Non-treated,87.8 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalosporin</td>
			<td>Lukang medical, China</td>
			<td>150303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codos Pet Clipper</td>
			<td>Szcodos, China</td>
			<td>CP-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase Type V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-hank&#39;s buffer</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5140-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining media</td>
			<td>Beyotime Biotech, China</td>
			<td>C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel-loading pipet tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin staining media</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14166S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1119</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>5190313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-tight culture dish</td>
			<td>DVS, China</td>
			<td>AN-5058548</td>
			<td>self-made, glass dish sprayed with black paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Adhesive Tape</td>
			<td>Cofoe, China</td>
			<td>K12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-invasive microtweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11033-11 and F12016-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>33391713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12012-12 and S11001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (penicillin / streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STZ (streptozotocin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Strip</td>
			<td>GenUltimate</td>
			<td>100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>SA00007-2</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamp</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R31006-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets

Alvleeskliereilandje transplantatie is een gevestigde therapeutische behandeling voor type 1 diabetes. De niercapsule is de meest gebruikte site voor eilandjetransplantatie in knaagdiermodellen. De strakke niercapsule beperkt echter de transplantatie van voldoende eilandjes bij grote dieren en mensen. Het inguinal onderhuidse witte vetweefsel (ISWAT), een nieuwe onderhuidse ruimte, bleek een potentieel waardevolle locatie voor eilandjetransplantatie. Deze site heeft een betere bloedtoevoer dan andere onderhuidse ruimtes. Bovendien, de ISWAT herbergt een grotere eilandje massa dan de niercapsule, en transplantatie in het is eenvoudig. Dit manuscript beschrijft de procedure van muiseilandjeisolatie en transplantatie op de ISWAT-site van synogene diabetische muisontvangers. Met behulp van dit protocol, murine pancreaseilandjes werden geïsoleerd door standaard collagenase spijsvertering en een kelder membraan matrix hydrogel werd gebruikt voor de vaststelling van de gezuiverde eilandjes in de ISWAT site. De bloedsuikerspiegel van de ontvangende muizen werden gedurende meer dan 100 dagen gecontroleerd. Eilandjegrafts werden op dag 100 na transplantatie teruggevonden voor histologische analyse. Het protocol voor eilandjestransplantatie op de ISWAT-site die in dit manuscript wordt beschreven, is eenvoudig en effectief.

In dit protocol worden twee procedures ingevoerd: murineeilandvoorbereiding en eilandjestransplantatie op de ISWAT-site. In de eerste procedure, na het doornemen en verteren met type V collagenase oplossing, zuiveren met Histopaque-1119 en Histopaque-1077 en een extra stap met het plukken van de hand, zullen de geïsoleerde murineeilandjes voldoende zuiver zijn voor transplantatie (zoals weergegeven in figuur 1) en de geïsoleerde eilandjes die een hoge levensvatbaarheid hebben, zullen worde...

Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In dit protocol wordt een methode van murineeilandisolatie en transplantatie in het inguinal onderhuids wit vetweefsel beschreven. Geïsoleerde synogenische murine eilandjes worden getransplanteerd in een murine ontvanger met behulp van een kelder membraan hydrogel. De bloedsuikerspiegel van de ontvangers wordt gecontroleerd en de histologieanalyse van de levensperie-transplantaties wordt uitgevoerd.

Inguinal Subcutane white Adipose Tissue (ISWAT) Transplantatie Model van Murine Eilandjes

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Eilandje transplantatie is een van de meest veelbelovende benaderingen voor de behandeling van type I diabetes mellitus. En de zoektocht naar een geschikte locatie voor eilandjestransplantatie is aan de gang. Eilandjetransplantatie in het inguinale onderhuidse witte vetweefsel is een eenvoudige maar effectieve methode die klinische implicaties kan hebben.Extrapolatie van deze procedure naar de kliniek kan leiden tot de ontwikkeling van een remedie voor type I diabetici. Deze methode kan inzicht geven in klinische eilandjestransplantatie, omdat de linguale is vastgesteld dat het geen ideale locatie is voor eilandjes. Het is belangrijk om zorgvuldig te volgen elke stap van de procedure, met name belangrijke stappen, zoals de alvleesklier spijsvertering.Visuele demonstratie zal onderzoekers helpen die nieuw zijn in de techniek om beter te bepalen hoe ze de eilandjesisolatie en de transmutatie moeten uitvoeren. Voor eilandje oogst, eerst spuiten de vacht van een 10 weken oude C57 zwarte zes muis met 75%ethanol, en vul een vijf milliliter spuit met vers bereide collagenase oplossing. Rust de spuit uit met een 32-gauge buigende stompe puntige perfusienaald en plaats de muis in de supinepositie op een ijszak.Gebruik rechte puntige oogheelkundige schaar om een dwarse opening in de huid van de schaamstreek te maken en de incisie uit te breiden naar het hoofd van het dier. Open de buik volledig via een V-incisie van het schaamstreek naar het xiphoidproces en verplaats de lever om de galblaas en de volledige lengte van het gemeenschappelijke galkanaal bloot te leggen. Gebruik vervolgens een vasculaire klem om de duodenale opening van de gemeenschappelijke galbuis te sluiten en een kleine opening in de galblaas te snijden.Kannuleert de gemeenschappelijke galkanaal door de opening met de eerder voorbereide perfusienaald, en injecteer ongeveer twee milliliter collagenase oplossing in de alvleesklier. Wanneer alle collagenase is geleverd, gebruik maken van twee paar niet-invasieve micro pincet om de geperfundeerde alvleesklier te scheiden van de darmen, maag en milt, en plaats de alvleesklier in een 50 milliliter conische buis op ijs. Wanneer alle monsters zijn verzameld, voeg 100 microliter Dnase I per alvleesklier aan de 50 milliliter buizen en krachtig schudden elke buis ongeveer 40 keer over een periode van 10 seconden voor het plaatsen van de weefsels in een 37 graden Celsius waterbad gedurende drie tot vijf minuten met matige schudden.Aan het einde van de incubatie, optellen tot een laatste volume van 50 milliliter van Stop Solution om de spijsvertering te arresteren. En puls centrifuge de buizen tot een snelheid van 750 keer G bij vier graden Celsius voordat snel stoppen met de centrifuge. Na het weggooien van de supernatants, was de pellets twee keer in 15 tot 25 milliliter Stop Solution per wasbeurt onder dezelfde centrifugatieomstandigheden als net aangetoond.Na de tweede wasbeurt, zwembad drie pellets per buis in nieuwe 50 milliliter conische buizen. En resuspend de alvleeskliercellen in een totaal volume van tien milliliter van Histopaque 1119. Voeg vervolgens voorzichtig vijf milliliter Histopaque 1077 aan de zijkant van elke buis toe, gevolgd door vijf milliliter HBSS.Scheid de cellen door centrifugatie en gebruik een vijf milliliter Pasteur pipet om de eilandjes te verzamelen van de HBSS Histopaque 1077 interface. Pool de eilandjes in een nieuwe conische buis van 50 milliliter in een uiteindelijk volume van 50 milliliter Stop Solution voor pulscentrifugatie en gooi de supernatant weg. Resuspend de pellet in 30 milliliter verse Stop Solution voor een minuut centrifugatie, en resuspend de eilandjes in 30 milliliter van cultuur medium.Decanteer de eilandjes in één 10 centimeter lichtdichte kweekschotel per buis. En leg het gerecht onder de stereomicroscoop. Met behulp van 200 microliter gel-loading pipet tips, met de hand pick de witte sferoïdale eilandjes uit de oplossing.Het plaatsen van de eilandjes in een onbehandelde celkweek schotel met 10 milliliter van cultuurmedium als ze worden geoogst. Controleer de zuiverheid van de met de hand geplukte eilandjes door dithizone vlekken onder een lichtmicroscoop. En detecteer de levensvatbaarheid van de eilandjes door fluoresceïne diacetaat propidium jodide kleuring onder een fluescent microscoop.Dan cultuur de geïsoleerde eilandjes in verse cultuur medium op 37 graden Celsius in 95% lucht en 5% kooldioxide tot transplantatie. Vanaf dag drie en vier na diabetes inductie, punctie de caudale ader van elke streptozotocine geïnjecteerd acht weken oude mannelijke C57 zwarte zes muis rond 10:00 a.m. om een bloedmonster te verzamelen van elk ontvangend dier.Gebruik een basis bloedglucose monitoring instrument om de niet-nuchtere bloedsuikerspiegel van elke muis te bepalen en voeg vervolgens het bloed op individuele teststrips. Wanneer een dier twee dagen achter elkaar een bloedglucosegehalte van ten minste 20 millimol per liter heeft aangetoond, weegt en markeert u de ontvangende muis en bevestigt u een gebrek aan reactie op pedaalreflex bij de verdoofde dieren. Plaats een aliquot van hydrogel van min 20 graden Celsius opslag op ijs voor ontdooien.En breng 450 tot 500 eilandjequivalenten per ontvanger over in een steriele 1,5 milliliter centrifugebuis met 200 microliter medium per buis op ijs. Swab het linker inguinale gebied van de ontvanger met 75%ethanol en plaats de muis in de supine positie. Fix de ledematen met chirurgische tape, en gebruik tondeuse om het haar te verwijderen rond de chirurgische site.Neem het chirurgische gebied met iodophor en maak een verticale incisie in de gedesinfecteerde huid. Identificeer de inferieure epigastrische slagader en ader in de ISWAT en maak een kleine zak boven de vaten. Sediment de eilandjes door centrifugatie en verwijder zoveel mogelijk supernatant mogelijk.Voeg 20 microliter ontdooide hydrogel toe aan elke buis en zet de eilandjes voorzichtig opnieuw op, waarbij ze zorgen voor bellen. Wanneer een homogene suspensie is verkregen, gebruik dan een 200 microliter pipetpunt om het hele eilandje hydrogelmengsel voorzichtig van één buis in de zak te leveren. Wanneer de hydrogel volledig gestold is, voeg dan 20 microliter cefalosporine toe aan de transplantatieplaats en sluit de spier en huid met een 5-0 continue chirurgische hechting.Plaats vervolgens de ontvanger in een schone kooi op een thermische pad met monitoring tot volledige recumbency. Na murine eilandje verwerking zoals aangetoond, de geïsoleerde murine eilandjes zal voldoende zuiver zijn voor transplantatie. Alleen geïsoleerde eilandjes met een hoge levensvatbaarheid mogen worden gebruikt voor transplantatie.Na het grondig mengen van de eilandjestransplantaten met hydrogel, kan het transplantaat worden geïmplanteerd in de ISWAT-site. Na ongeveer een maand van transplantatie in de ISWAT, het eilandje grafts omgekeerde hyperglykemie, terwijl het lichaamsgewicht van de ontvanger muizen geleidelijk toeneemt. Na 100 dagen na transplantatie resulteert verwijdering van de grafts in een onmiddellijke toename van de 10:00 a.m.niet-nuchtere bloedsuikerspiegel. Histologische analyse op dit moment, blijkt dat het eilandje grafts intact zijn gebleven. En insuline en glucagon immunofluorescente kleuring geven aan dat de getransplanteerde eilandjes ook functioneel zijn na 100 dagen na transplantatie.Wees voorzichtig niet te schudden de verende alvleesklier cellen te robuust of anders het vermogen van de verkregen eilandjes zal worden aangetast. Geïsoleerde eilandjes kunnen worden getransplanteerd onder de niercapsule als een controle om de effecten van de geïsoleerde transplantatie te vergelijken in het inguinale onderhuidse witte vetweefsel ter plaatse. De procedure zal de initiatie van klinische proeven van eilandjetransplantatie toevoegen aan andere plaatsen naast de lever.

Research

JoVE Journal

Medicine

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Muismodel van chirurgisch geïnduceerde Endometriose door Auto-transplantatie van baarmoeder weefsel

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Ontwikkeling van Bronchiolitis obliterans in een muizenmodel van orthotope longtransplantatie

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Muizen Baarmoederhalskanker harttransplantatie Model met een aangepaste manchet Techniek

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantatie van Pulmonary Valve een muis model van Heterotope Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Muizen hoornvliestransplantatie: een model om de meest voorkomende vorm van een orgaantransplantatie Bestudeer

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Een veelzijdige muizenmodel van Subcortical White Matter Stroke voor de Studie van axonale degeneratie en White Matter Neurobiologie

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creatie en transplantatie van een blad van de stamcel adipeus afkomstige (ASC) in een diabetische wondgenezing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Een techniek voor subcutane abdominale adipeus weefsel biopsie via een niet-diathermie methode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantatie van stamcellen adipeus weefsel afkomstige blad om lekkage na gedeeltelijke Colectomy in een Rat-Model

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...