Name: inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key F&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province of China (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Alle Verfahren in diesem Protokoll folgten den Grundsätzen des Tierschutzes der Ethik-Überprüfungskommission des Shenzhen Second People es Hospital. Islet-Transplantat-Empfänger und Spender waren 8- bis 10 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse, die vom Medical Animal Center der Provinz Guangdong gekauft wurden. Das Verfahren der Ernte, Isolierung, Kultur oder Verabreichung der geernteten Zellen wurde unter aseptischen Bedingungen durchgeführt.
1. Inselvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie e...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).</li><li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+for+Type+1+Diabetes:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).</li><li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now.">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).</li><li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets.">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li><li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation.">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li><li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation.">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li><li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+islet+transplantation:+is+the+future+finally+now.">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li><li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients,+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants.">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li><li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes:+recent+advances+and+future+challenges.">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li><li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation?+Review+article.">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li><li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment.">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li><li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver.">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li><li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation:+alternative+sites.">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li><li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation.">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse.">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).</li><li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model.">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li></ol>

Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine vielversprechende Therapie zur Behandlung von T1DM. Die Wirkung dieser Therapie wird von vielen Faktoren beeinflusst und die Wahl eines optimalen Ortes für die Implantation von Isleten ist äußerst wichtig. Die ideale anatomische Stelle für die Letentransplantation sollte folgende Merkmale aufweisen: Zugänglichkeit für einfache Transplantationen, Biopsie n- und Transplantatentnahmeverfahren; reduzierte Komplikationen; hohe Erfolgsrate der Blutzuckerkontrolle; und langfrist...

Die weltweite Inzidenz und Prävalenz von Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) steigt laut den statistischen Daten der International Diabetes Federation (IDF)1schnell an. Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von T1DM4. Seit der große Durchbruch in der klinischen Islet-Transplantation mit dem Edmonton-Protokoll2 berichtet wurde, erreicht das funktionierende Islet-Transplantat-Überleben bei T1DM-Empfängern nach 5 Jahren nun etwa 50%3.
In der Vergangenheit wurden mehrere Transplantationsstellen, wie Leber, Nierenkapsel, Milz, intramuskuläre Region, subkutaner Raum, Knochenmark und Omentalbeutel für experimentelle IsletTransplantation5,6,7untersucht. Einige der oben genannten Seiten wurden in klinischen Einstellungen getestet8. Obwohl die Letentransplantation in die Leber die am weitesten verbreitete Methode in der klinischen Anwendung derzeit9bleibt, gibt es mehrere wichtige Probleme bei der Verwendung dieser Website zu beheben. Zum Beispiel, wie man den frühen Verlust der transplantierten Inselchen durch die sofortige blutvermittelte Entzündungsreaktion (IBMIR) und schlechte Sauerstoffversorgung10,11 und wie man die Insel transplantiert, wenn nötig, zu reduzieren, weil sie diffus in der Leber lokalisieren. Die Nierenkapsel kann ein idealer Ort für Nagetier-Empfänger sein. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender allogener Inselchen beim Menschen, obwohl sie aufgrund der hochgereinigten Poreninselpräparate, die klinisch verwendet werden, besser für die Inselxenotransplantation geeignet seinkann. Daher ist die Suche nach einem geeigneteren Standort für die Letentransplantation im Gange.
Der subkutane Raum kann aufgrund seiner Zugänglichkeit als klinisch anwendbarer Standort für die Letentransplantation genutzt werden. Allerdings ist die Effizienz der Inseltransplantation in den subkutanen Raum extrem gering, so dass eine relativ große Anzahl von Inselchen erforderlich ist, um Hyperglykämie umzukehren13. Kürzlich fand ein japanisches Forscherteam die ISWAT, eine neuartige subkutane Stelle, die für die Letentransplantation in einem murinen Modell im Vergleich zur Leber14überlegen ist. Die ISWAT enthält die epigastrische Arterie und Vene, so dass die reiche Blutversorgung kann Islet Transplantat Revaskularisation gewährleisten. In diesem Manuskript schlagen wir eine einfache Implantationsmethode mit einem Kellermembran-Matrix-Hydrogel vor, um syngene murinische Inselchen im ISWAT zu fixieren. Dieses Protokoll erweist sich als wirksam für die Letentransplantation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe-driven Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pasteur pipette</td>
			<td>JingAn Biological, China</td>
			<td>J00085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 surgical suture</td>
			<td>sh-Jinhuan, China</td>
			<td>CR537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>9180527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Glucagon antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10988</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse insulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3014s</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-pointed perfusion needle</td>
			<td>Oloey, China</td>
			<td>005</td>
			<td>32G, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Meilune, China</td>
			<td>MB4219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Medical Animal Center of Guangdong Province</td>
			<td></td>
			<td>8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL, China</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>General,Non-treated,87.8 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalosporin</td>
			<td>Lukang medical, China</td>
			<td>150303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codos Pet Clipper</td>
			<td>Szcodos, China</td>
			<td>CP-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase Type V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-hank&#39;s buffer</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5140-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining media</td>
			<td>Beyotime Biotech, China</td>
			<td>C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel-loading pipet tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin staining media</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14166S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1119</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>5190313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-tight culture dish</td>
			<td>DVS, China</td>
			<td>AN-5058548</td>
			<td>self-made, glass dish sprayed with black paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Adhesive Tape</td>
			<td>Cofoe, China</td>
			<td>K12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-invasive microtweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11033-11 and F12016-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>33391713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12012-12 and S11001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (penicillin / streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STZ (streptozotocin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Strip</td>
			<td>GenUltimate</td>
			<td>100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>SA00007-2</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamp</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R31006-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets

Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine etablierte therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes. Die Nierenkapsel ist die am häufigsten verwendete Stelle für die Letentransplantation in Nagetiermodellen. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender Inselchen bei großen Tieren und Menschen. Das inguinale subkutane weiße Fettgewebe (ISWAT), ein neuer subkutaner Raum, wurde als potenziell wertvoller Ort für die Zelltransplantation gefunden. Diese Seite hat eine bessere Blutversorgung als andere subkutane Räume. Darüber hinaus beherbergt die ISWAT eine größere Isletmasse als die Nierenkapsel, und die Transplantation in sie ist einfach. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Isolierung und Transplantation von Mausinselaufderungen in der ISWAT-Site von syngenen diabetischen Mausempfängern. Mit diesem Protokoll wurden murine Pankreasinseln durch Standard-Kollagennase-Verdauung isoliert und ein Kellermembran-Matrix-Hydrogel wurde zur Befestigung der gereinigten Inselchen am ISWAT-Standort verwendet. Der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse wurde mehr als 100 Tage lang überwacht. Islet-Transplantate wurden am Tag 100 nach der Transplantation zur histologischen Analyse geborgen. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll für die Letentransplantation an der ISWAT-Site ist einfach und effektiv.

In diesem Protokoll werden zwei Verfahren eingeführt: die Präparation von murinen Inselen und die Inseltransplantation in den ISWAT-Standort. Im ersten Verfahren, nach durchdringenden und verdauenmit Mit Typ V Kollagenase-Lösung, Reinigung mit Histopaque-1119 und Histopaque-1077 und einem zusätzlichen Hand-Picking-Schritt, werden die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation sein (wie in Abbildung 1gezeigt ) und die isolierten Inselchen, die eine hohe Lebensfäh...

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Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von Typ-I-Diabetes mellitus. Und die Suche nach einem geeigneten Standort für die Letentransplantation läuft. Die Islet-Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe ist eine einfache, aber wirksame Methode, die klinische Implikationen haben kann.Die Extrapolation dieses Verfahrens auf die Klinik kann zur Entwicklung einer Heilung für Typ-I-Diabetiker führen. Diese Methode könnte Einblicke in die klinische Islettransplantation geben, da die Lingual als kein idealer Ort für die Transplantation von Isleten bestimmt wurde. Es ist wichtig, sorgfältig jeden Schritt des Verfahrens zu folgen, insbesondere wichtige Schritte, wie die Pankreasverdauung.Visuelle Demonstration wird Forschern helfen, die mit der Technik neu zu finden sind, um besser zu bestimmen, wie die Isolierung der Kleinen und die Transmutation durchgeführt werden. Für die Inselernte zuerst das Fell einer 10 Wochen alten C57 black six mouse mit 75% Ethanol besprühen und eine Fünf-Milliliter-Spritze mit frisch zubereiteter Kollagennaselösung füllen. Rüsten Sie die Spritze mit einer 32-Spur-Biegestumpf-Spitzen-Perfusionsnadel aus, und legen Sie die Maus in die Supine-Position auf einem Eisbeutel.Verwenden Sie gerade spitze Augenscheren, um eine Queröffnung in der Haut des Schambereichs zu machen, und erweitern Sie den Schnitt in Richtung des Kopfes des Tieres. Öffnen Sie den Bauch vollständig über einen V-Inzis aus der Schamregion zum xiphoiden Prozess, und bewegen Sie die Leber, um die Gallenblase und die gesamte Länge des gemeinsamen Gallengangs freizulegen. Dann verwenden Sie eine Gefäßklemme, um die Zwölffingerdarmöffnung des gemeinsamen Gallengangs zu schließen und eine kleine Öffnung in der Gallenblase zu schneiden.Den gemeinsamen Gallengang durch die Öffnung mit der zuvor vorbereiteten Perfusionsnadel zu nulaten und etwa zwei Milliliter Kollagenaselösung in die Bauchspeicheldrüse zu injizieren. Wenn die gesamte Kollagenase geliefert wurde, verwenden Sie zwei Paare von nichtinvasiven Mikro-Pinzetten, um die durchgeflossene Bauchspeicheldrüse von Darm, Magen und Milz zu trennen und die Bauchspeicheldrüse in eine 50 Milliliter konische Röhre auf Eis zu legen. Wenn alle Proben gesammelt wurden, fügen Sie 100 Mikroliter Dnase I pro Bauchspeicheldrüse zu den 50 Milliliter-Röhren hinzu und schütteln Sie jede Röhre etwa 40 Mal über einen Zeitraum von 10 Sekunden kräftig, bevor Sie das Gewebe drei bis fünf Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad mit moderatem Schütteln legen.Am Ende der Inkubation, addieren Sie sich zu einem endgültigen Volumen von 50 Milliliter Stop Solution, um die Verdauung zu stoppen. Und Pulszentrifugieren Sie die Rohre auf eine Geschwindigkeit von 750 mal G bei vier Grad Celsius, bevor sie die Zentrifuge schnell stoppen. Nach dem Wegwerfen der Überstände die Pellets zweimal in 15 bis 25 Milliliter Stop Solution pro Wäsche unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen waschen, wie soeben gezeigt.Nach der zweiten Wäsche drei Pellets pro Rohr in neue 50 Milliliter konische Röhren bündeln. Und setzen Sie die Bauchspeicheldrüsenzellen in einem Gesamtvolumen von zehn Millilitern Histopaque 1119 wieder aus. Als nächstes vorsichtig fünf Milliliter Histopaque 1077 an der Seite jeder Röhre hinzufügen, gefolgt von fünf Milliliter HBSS.Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pasteur-Pipette, um die Inselchen von der HBSS Histopaque 1077 Schnittstelle zu sammeln. Die Inselchen in einem neuen 50-Milliliter-Konusrohr in einem Endvolumen von 50 Millilitern Stop Solution für die Pulszentrifugation bündeln und den Überstand entsorgen. Das Pellet in 30 Milliliterfrischer Stop-Lösung für eine einminütige Zentrifugation wieder aufhängen und die Inselchen in 30 MilliliterKulturmedium wieder aufhängen.Dekantisieren Sie die Inselchen in eine 10 Zentimeter lichtdichte Kulturschale pro Röhre. Und legen Sie die Schale unter das Stereomikroskop. Mit 200 Mikroliter-Gel-Ladepipettenspitzen, von Hand wählen Sie die weißen sphäroidalen Inselchen aus der Lösung.Legen Sie die Inselchen in eine unbehandelte Zellkulturschale mit 10 Milliliter Kulturmedium, wie sie geerntet werden. Überprüfen Sie die Reinheit der handgepflückten Inseln durch Dithionfärbung unter einem Lichtmikroskop. Und die Lebensfähigkeit der Inseln durch Fluorescein-Diacetat propidium iodid färbung unter einem Floreszenzmikroskop erkennen.Dann kulturieren Die isolierten Inselchen in frischem Kulturmedium bei 37 Grad Celsius in 95% Luft und 5% Kohlendioxid bis zur Transplantation. Beginnend an den Tagen drei und vier nach der Diabetes-Induktion, punktieren Sie die kaudale Vene jedes Streptozotocin-injizierten acht Wochen alten männlichen C57 schwarz sechs Maus um 10:00 a.m. um eine Blutprobe von jedem EmpfängerTier zu sammeln.Verwenden Sie ein grundlegendes Blutzuckermessgerät, um den nicht fastenden Blutzuckerspiegel jeder Maus zu bestimmen und fügen Sie das Blut dann auf einzelne Teststreifen. Wenn ein Tier zwei Tage hintereinander einen Blutzuckerspiegel von mindestens 20 Millimole pro Liter nachgewiesen hat, wiegen und markieren Sie die Empfängermaus und bestätigen Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflexe bei den anästhesierten Tieren. Legen Sie ein Aliquot von Hydrogel von minus 20 Grad Celsius Lagerung auf Eis zum Auftauen.Und übertragen Sie 450 bis 500 Islet-Äquivalente pro Empfänger in ein steriles 1,5 Milliliter-Zenififugenrohr mit 200 Mikrolitern Medium pro Tube auf Eis. Den linken Leistenbereich des Empfängers mit 75% Ethanol abwischen und die Maus in die Supine-Position stellen. Fixieren Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband, und verwenden Sie Clipper, um das Haar um die chirurgische Stelle zu entfernen.Den Operationsbereich mit Iodophor abwischen und einen vertikalen Schnitt in der desinfizierten Haut machen. Identifizieren Sie die minderwertige epigastrische Arterie und Vene innerhalb des ISWAT und erstellen Sie eine kleine Tasche über den Gefäßen. Sedimentieren Sie die Inseln durch Zentrifugation und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich.Fügen Sie 20 Mikroliter aufgetautes Hydrogel in jedes Rohr, und halten Sie die Inselchen vorsichtig wieder auf, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden. Wenn eine homogene Suspension erhalten wurde, verwenden Sie eine 200 Mikroliter Pipettenspitze, um die gesamte Islet Hydrogelmischung vorsichtig aus einem Rohr in die Tasche zu liefern. Wenn das Hydrogel vollständig verfestigt ist, fügen Sie 20 Mikroliter Cephalosporin an die Transplantationsstelle und schließen Sie den Muskel und die Haut mit einer kontinuierlichen chirurgischen Naht von 5-0.Legen Sie den Empfänger dann in einen sauberen Käfig auf einem Thermopad mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Nach der murinen Inselverarbeitung, wie gezeigt, sind die isolierten murinen Inseln ausreichend rein für die Transplantation. Für die Transplantation sollten nur isolierte Inselchen mit hoher Lebensfähigkeit verwendet werden.Nach gründlichem Mischen der Islettransplantate mit Hydrogel kann das Transplantat in die ISWAT-Stelle implantiert werden. Nach etwa einem Monat Transplantation in die ISWAT kehren die Islettransplantate die Hyperglykämie um, während das Körpergewicht der Empfängermäuse allmählich zunimmt. Nach 100 Tagen nach der Transplantation führt die Entfernung der Transplantate zu einer sofortigen Erhöhung der 10:00 a.m.nicht fastenden Blutzuckerspiegel. Histologische Analysen zu diesem Zeitpunkt zeigen, dass die Islettransplantate intakt geblieben sind. Und Insulin und Glucagon immunfluoreszierende Färbung zeigen, dass die transplantierten Inseln auch an 100 Tagen nach der Transplantation funktionsfähig sind.Achten Sie darauf, die profused Bauchspeicheldrüsenzellen nicht zu robust zu schütteln, sonst wird die Fähigkeit der erhaltenen Inseln beeinträchtigt. Isolierte Inselchen können unter der Nierenkapsel als Kontrolle transplantiert werden, um die Auswirkungen der isolierten Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe an der Stelle zu vergleichen. Das Verfahren wird die Einleitung klinischer Studien zur Letztransplantation an anderen Stellen außer der Leber hinzufügen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Maus-Modell der chirurgisch-induzierten Endometriose durch Auto-Transplantation von Gebärmutter-Gewebe

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Forschung

Medizin

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Entwicklung einer Bronchiolitis obliterans in einem Mausmodell der orthotopen Lungentransplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Murine Cervical Herztransplantation Modell mithilfe eines modifizierten Cuff-Technik

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantation von Pulmonalklappe Mit einem Maus-Modell der heterotopen Herztransplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murine Hornhauttransplantation: Ein Modell, das die häufigste Form der Organtransplantation Studieren

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Eine Technik zur subkutanen abdominalen Fettgewebe Biopsie über eine nicht-Diathermie-Methode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantation von Fettgewebe-Derived Stem Cell Blatt, Leckage nach teilweiser Colectomy in einem Rattenmodell zu reduzieren

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...