Name: inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

この研究は、中国の国家主要R&Dプログラム(2017YFC1103704)広東省の高レベル病院建設のための特別資金(2019年)、深センの三明医学プロジェクト(SZSM201412020)、高レベル基金からの助成金によって支えられました。深センの医療規律建設(2016031638)、深セン科学技術財団(JCJY20160229204849975、GJHZ20170314171714171314171333年、深セン保健家族計画委員会(SZXJ2010102010100年10月20日)中国広東省科学研究財団(A2019218)、中国ポドカルサイエンス財団(2018M633218)。

この議定書のすべての手続きは、深セン第二人民病院の倫理審査委員会の動物福祉の原則に従った。この座レット移植片のレシピエントとドナーは、広東省医療動物センターから購入した8~10週齢のC57BL/6雄マウスであった。収穫、単離、培養、または収穫した細胞の投与の手順を無菌条件で行った。
1. アイレットの準備
<ol><li>コラゲナーゼV型働き液を調製する。コラゲ...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).</li><li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+for+Type+1+Diabetes:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).</li><li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now.">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).</li><li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets.">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li><li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation.">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li><li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation.">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li><li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+islet+transplantation:+is+the+future+finally+now.">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li><li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients,+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants.">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li><li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes:+recent+advances+and+future+challenges.">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li><li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation?+Review+article.">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li><li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment.">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li><li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver.">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li><li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation:+alternative+sites.">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li><li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation.">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse.">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).</li><li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model.">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li></ol>

膵臓膵島移植は、T1DMを治療するための有望な治療法です。この療法の効果は多くの要因によって影響を受け、小便座移植のための最適な部位を選択することは非常に重要である。この小便座移植の理想的な解剖学的部位には、単純な移植、生検、移植片の検索手順に対するアクセス性があります。合併症を減らしました。血糖コントロールの高い成功率;そして、小口移植片15、...

国際糖尿病連盟(IDF)1の統計データによると、1型糖尿病(T1DM)の世界的な発生率と罹患率は急速に上昇しています。Islet移植は、T1DM4を治療するための最も有望なアプローチの1つである。エドモントンプロトコル2を用いた臨床島移植で行われた大きなブレークスルーが報告されていたので、5年後のT1DMレシピエントにおける機能性のスチーム移植片生存率は現在約50%3に達する。
これまで、肝臓、腎臓カプセル、脾臓、筋肉内領域、皮下空間、骨髄、およびオーメンタルポーチなどのいくつかの移植部位が実験的なポレット移植5、6、7について検討された。上記のサイトのいくつかは臨床設定8でテストされています。肝臓への小便の移植は現在9の臨床応用において最も広く用いられている方法であるが、この部位を使用する場合に対処すべきいくつかの重要な問題がある。例えば、即時血液媒介性炎症反応(IBMIR)および酸素供給不良10、11によって引き起こされる移植された小島の早期喪失を低減する方法、および必要に応じてこの島移植片を取り出す方法は、肝臓にびらんに局在化するためである。腎カプセルはげっ歯類のレシピエントにとって理想的な部位である可能性があります。しかし、タイトな腎臓カプセルは、ヒトにおける十分な同種間血島の移植を制限し、臨床的に使用される高度に精製されたブタ島の製剤に起因する異種移植に適している可能性があるが5、12。従って、より適した部位を探して、このサイトを、小便の移植が進んでいる。
皮下腔は、そのアクセス性のために、小便座移植のための臨床的に適用可能な部位として使用され得る。しかしながら、皮下空間への小島移植の効率は極めて低く、したがって高血糖13を逆にするために比較的多数の島を必要とする。最近、日本の研究チームは、ISWAT、肝臓14と比較してマウスモデルでの小便移植に優れた新しい皮下サイトを発見しました。ISWATは上胃動脈および静脈を含むので、豊富な血液供給は、小便移植片の再血管再生を保証することができる。本稿では、ISWATにおける同系マウス島の固定に基質膜マトリックスヒドロゲルを用いた容易な移植方法を提案する。このプロトコルは、小便の移植に有効であることが証明されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe-driven Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pasteur pipette</td>
			<td>JingAn Biological, China</td>
			<td>J00085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 surgical suture</td>
			<td>sh-Jinhuan, China</td>
			<td>CR537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>9180527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Glucagon antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10988</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse insulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3014s</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-pointed perfusion needle</td>
			<td>Oloey, China</td>
			<td>005</td>
			<td>32G, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Meilune, China</td>
			<td>MB4219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Medical Animal Center of Guangdong Province</td>
			<td></td>
			<td>8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL, China</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>General,Non-treated,87.8 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalosporin</td>
			<td>Lukang medical, China</td>
			<td>150303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codos Pet Clipper</td>
			<td>Szcodos, China</td>
			<td>CP-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase Type V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-hank&#39;s buffer</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5140-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining media</td>
			<td>Beyotime Biotech, China</td>
			<td>C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel-loading pipet tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin staining media</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14166S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1119</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>5190313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-tight culture dish</td>
			<td>DVS, China</td>
			<td>AN-5058548</td>
			<td>self-made, glass dish sprayed with black paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Adhesive Tape</td>
			<td>Cofoe, China</td>
			<td>K12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-invasive microtweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11033-11 and F12016-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>33391713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12012-12 and S11001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (penicillin / streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STZ (streptozotocin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Strip</td>
			<td>GenUltimate</td>
			<td>100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>SA00007-2</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamp</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R31006-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets

膵島移植は、1型糖尿病に対する十分に確立された治療療法である。腎臓カプセルは、げっ歯類モデルにおける小便の移植に最も一般的に使用される部位である。しかし、タイトな腎臓カプセルは、大型動物およびヒトにおける十分な小島の移植を制限する。新しい皮下空間である創尿下白脂肪組織(ISWAT)は、小便座移植にとって潜在的に貴重な部位であることが判明した。このサイトは、他の皮下空間よりも優れた血液供給を有する。また、ISWATは、腎臓カプセルよりも大きな小便の質量を収容し、それに移植することは簡単である。本稿では、同系糖尿病マウスレシピエントのISWAT部位におけるマウスの膵野の分離および移植の手順について説明する。このプロトコルを用いて、マウス膵島を、ISWAT部位の精製された小島を固定するために標準的なコラゲナーゼ消化および基質膜マトリックスヒドロゲルによって単離した。レシピエントマウスの血糖値を100日以上モニタリングした。この座子移植片は、組織学的分析のために移植後100日目に回収した。本稿に記載されているISWATサイトにおける、このサイトにおける小便の移植に関するプロトコルは、簡素で効果的である。

このプロトコルでは、マウスのマウスの準備と ISWAT サイトへの小便の移植の 2 つの手順が導入されています。第1の手順では、ヒストモメ-1119およびヒストモメ不全-1077および追加の手摘みステップで精製するV型コラゲターゼ溶液を浸透させ、消化した後、単離されたマウス島は移植のために十分に純粋である(図1に示すように)、そして生存率が高い孤立した島を移植に...

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Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

このプロトコルでは、マウスの小口分離および、皮下白色脂肪組織への移植の方法が記載されている。単離された同系マウス島は、基質膜ヒドロゲルを用いてマウスレシピエントに移植される。レシピエントの血糖値をモニターし、そして、血小移植片のヒストロジー分析を行う。

マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

小子移植は、I型糖尿病を治療するための最も有望なアプローチの1つです。そして、小地移植に適した場所の探索が進行中です。皮下白脂肪組織への小子移植は、臨床的な意味を持つ可能性のある単純でありながら効果的な方法である。この手順をクリニックに外挿すると、I型糖尿病患者の治療法が開発される可能性があります。この方法は、言語が小地の生着のための理想的な部位ではないと判断されたように、臨床小地移植への洞察を提供することができる。手順のすべてのステップ、特に膵臓消化などの重要なステップに注意深く従うことが重要です。視覚的なデモンストレーションは、この技術に新しい研究者が、小口分離と突然変異を実行する方法をより良く決定するのに役立ちます。小地の収穫のために、最初に75%エタノールで10週齢のC57ブラックシックスマウスの毛皮をスプレーし、5ミリリットルのシリンジに作りたてのコラゲラーゼ溶液を充填します。32ゲージの曲げ鈍い尖った灌流針を注射器に装備し、マウスをアイスバッグの上のスペピンの位置に置きます。まっすぐ尖った眼科のはさみを使用して陰部の皮膚に横の開口部を作り、切開を動物の頭部に向かって伸ばします。恥部からxiphoidプロセスへのV-切開を介して腹部を完全に開き、胆嚢および共通胆管の全長を露出させるために肝臓を動かす。次に、血管クランプを使用して、共通の胆管の十二指腸開口部を閉じ、胆嚢の小さな開口部を切断します。以前に準備した灌流針で開口を通して共通の胆管をカンニュレートし、約2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を膵臓に注入する。すべてのコラゲナーゼが送達されたら、2組の非侵襲的なマイクロピンセットを使用して、浸透した膵臓を腸、胃、脾臓から分離し、膵臓を氷の上の50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。すべてのサンプルが採取されたら、膵臓1個につき100マイクロリットルのDnaSEを50ミリリットルチューブに加え、10秒間にわたって各チューブを約40回激しく振ってから、適度な揺れで3〜5分間37度の水浴に入れます。インキュベーションの最後に、消化を阻止するためにストップソリューションの50ミリリットルの最終体積に追加します。そして、速く遠心分離機を停止する前に、摂氏4度で750倍Gの速度にチューブをパルス遠心分離します。上清を捨て、ちょうど実証したように同じ遠心状態で洗浄1回15〜25ミリリットルのストップ溶液でペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、チューブあたり3つのペレットを新しい50ミリリットル円錐形チューブにプールします。そして、ヒスト不透明1119の10ミリリットルの総体積で膵臓細胞を再懸濁する。次に、各チューブの側面にヒスト不透明な1077の5ミリリットルを慎重に追加し、その後に5ミリリットルのHBSSを追加します。遠心分離によって細胞を分離し、HBSSヒスト不透明1077インターフェイスから小島を収集するために5ミリリットルパスツールピペットを使用しています。新しい50ミリリットルの円錐形チューブに小島を50ミリリットルの最終体積のストップソリューションでプールしてパルス遠心分離を行い、上清を捨てます。ペレットを30ミリリットルの新鮮な停止溶液で1分間の遠心分離のために再懸濁し、30ミリリットルの培養培地で島を再懸濁する。小島をチューブあたり10センチメートルの軽密培養皿にデカントします。そして、ステレオ顕微鏡の下に皿を置きます。200マイクロリットルのゲルローディングピペットチップを使用して、溶液から白い回転楕円体小島を手で選びます。10ミリリットルの培養培地を収穫する際に、未処理の細胞培養皿に小島を入れる。軽顕微鏡でジチゾン染色することにより、手摘み小島の純度を確認します。フロレス化顕微鏡下でヨウ化プロピジウム染色をしたフルオレセイン・ジアセテート・ジアセテートで、小島の生存率を検出した。その後、分離した島を95%の空気で摂氏37度、移植まで5%の二酸化炭素で新鮮な培養培地で培養する。糖尿病誘導後3日目と4日目から、各レンサプトゾトシン注射8週齢8週間齢の雄C57黒6マウスの尾静脈を10:00a.m頃に穿刺し、各レシピエント動物から血液サンプルを採取する。基本的な血糖値モニタリング器具を使用して、各マウスの非空腹時血糖値を決定し、個々のテストストリップに血液を追加します。動物が2日連続で1リットル当たり少なくとも20ミリモルの血糖値を実証した場合、レシピエントマウスの体重を量ってマークし、麻酔動物のペダル反射に対する応答の欠如を確認する。解凍のために氷の上にマイナス20度の摂氏貯蔵からヒドロゲルのアリコートを置きます。そして、1回の受取人あたり450〜500の島分を、氷上のチューブあたり200マイクロリットルの培地を含む無菌1.5ミリリットル遠心管に移します。レシピエントの左のインジナル領域を75%エタノールでスワブし、マウスをスピーヌ位置に置きます。手術用テープで手足を固定し、バリカンを使用して外科現場の周りの毛髪を取り除きます。ヨードファーで手術領域をスワブし、感染した皮膚に垂直切開を行います。ISWAT内の下側の上頭動脈と静脈を特定し、血管の上に小さなポケットを作成します。遠心分離によって島を沈降し、できるだけ多くの上清を除去する。各チューブに解凍したヒドロゲルを20マイクロリットル加え、気泡を避けるように注意して小島を静かに再中断します。均質な懸濁液が得られたら、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、1本のチューブから小水ゲル混合物全体を慎重にポケットに送り込みます。ヒドロゲルが完全に固まったら、移植部位に20マイクロリットルのセファロスポリンを加え、筋肉と皮膚を5-0連続外科的縫合で閉じる。その後、完全な債務まで監視と熱パッド上のきれいなケージに受信者を配置します。マウスの小便処理が実証された後、分離されたマウス小子は移植のために十分に純粋になります。移植には生存率の高い孤立した島のみを使用する必要があります。ヒドロゲルとの小葉移植片の完全な混合の後、移植片はISWAT部位に移植することができる。ISWATへの移植の約1ヶ月後、杯は、レシピエントマウスの体重が徐々に増加しながら、逆高血糖を移植する。移植後100日で、移植片の除去は10:00 a.mの即時増加をもたらす。非空腹時血糖値.この時点での組織学的分析は、小地移植片がそのまま残っていることを明らかにする。インスリンおよびグルカゴン免疫蛍光染色とは、移植後100日で移植された小島も機能していることを示している。あまりにも堅牢に、または取得した膵島の能力が損なわれるように、多用膵臓細胞を振り回さないように注意してください。孤立した小島は、部位での皮下白脂肪組織への単離された移植の効果を比較するコントロールとして腎カプセルの下に移植することができる。この手順は、肝臓以外の他の部位に小口移植の臨床試験の開始を追加します。.

Research

JoVE Journal

Medicine

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