Name: inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medisinsk disiplin Bygging av Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medisinsk Vitenskapelig forskningsstiftelse i Guangdong-provinsen i Kina (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Alle prosedyrer i denne protokollen fulgte prinsippene for dyrevelferd av Ethics Review Committee of Shenzhen Second People's Hospital. Islet graft mottakere og givere var 8- til 10 uker gamle C57BL/6 mannlige mus kjøpt fra Medical Animal Center i Guangdong-provinsen. Prosedyren for høsting, isolasjon, kultur eller administrasjon av de høstede cellene ble utført under aseptiske forhold.
1. Holmeforberedelse
<ol><li>Klargjør en kollagentype V arbeidsløsning. Vekt kollagense type V og op...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).</li><li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+for+Type+1+Diabetes:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).</li><li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now.">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).</li><li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets.">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li><li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation.">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li><li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation.">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li><li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+islet+transplantation:+is+the+future+finally+now.">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li><li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients,+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants.">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li><li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes:+recent+advances+and+future+challenges.">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li><li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation?+Review+article.">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li><li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment.">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li><li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver.">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li><li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation:+alternative+sites.">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li><li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation.">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse.">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).</li><li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model.">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li></ol>

Bukspyttkjertel holmetransplantasjon er en lovende terapi for å behandle T1DM. Effekten av denne behandlingen påvirkes av mange faktorer, og det er ekstremt viktig å velge et optimalt sted for holmeimplantasjon. Det ideelle anatomiske stedet for holmetransplantasjon bør ha følgende egenskaper: tilgjengelighet for enkel transplantasjon, biopsi og graft gjenfinningprosedyrer; reduserte komplikasjoner; høy suksessrate for blodsukkerkontroll; og langsiktig overlevelse av holmen grafts15,</s...

Den verdensomspennende forekomsten og forekomsten av diabetes mellitus type 1 (T1DM) øker raskt, ifølge statistiske data fra International Diabetes Federation (IDF)1. Holmetransplantasjon er en av de mest lovende tilnærmingene for behandling av T1DM4. Siden det store gjennombruddet i klinisk holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen2 ble rapportert, fungerende holmegraftoverlevelse hos T1DM-mottakere etter 5 år nå når ca 50%3.
Tidligere ble flere transplantasjonssteder, som lever, nyrekapsel, milt, intramuskulær region, subkutan plass, benmarg og omentalpose utforsket for eksperimentell holmetransplantasjon5,6,7. Noen av de ovennevnte stedene har blitt testet i kliniske innstillinger8. Selv om holmetransplantasjon i leveren fortsatt er den mest brukte metoden i klinisk anvendelse i dag9,er det flere viktige problemer å løse når du bruker dette nettstedet. For eksempel, hvordan redusere tidlig tap av transplanterte holmer forårsaket av øyeblikkelig blod mediert inflammatorisk reaksjon (IBMIR) og dårlig oksygenering forsyning10,11 og hvordan å hente holme grafts om nødvendig, fordi de diffust lokalisere i leveren. Nyrekapselen kan være et ideelt sted for gnagermottakere. Den stramme nyrekapselen begrenser imidlertid transplantasjonen av tilstrekkelige allogene holmer hos mennesker, selv om det kan være bedre egnet for holmexenotransplantasjon på grunn av de svært rensede svineøyene som brukes klinisk5,12. Derfor er søket etter et mer egnet sted for holmetransplantasjon pågår.
Det subkutane rommet kan brukes som et klinisk aktuelt sted for holmetransplantasjon på grunn av tilgjengeligheten. Effektiviteten av holmetransplantasjon i det subkutane rommet er imidlertid ekstremt lav, og krever dermed et relativt stort antall holmer for å reversere hyperglykemi13. Nylig fant et japansk forskningsteam ISWAT, et nytt subkutan sted overlegen for holmetransplantasjon i en murine modell sammenlignet med leveren14. ISWAT inneholder epigastrisk arterie og vene, slik at den rike blodtilførselen kan sikre at holmetransplantatrevaskularisering. I dette manuskriptet foreslår vi en enkel implantasjonsmetode ved hjelp av en kjellermembranmatrisehydrogel for å fikse syngeneiske murine-holmer i ISWAT. Denne protokollen viser seg effektiv for holmetransplantasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe-driven Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pasteur pipette</td>
			<td>JingAn Biological, China</td>
			<td>J00085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 surgical suture</td>
			<td>sh-Jinhuan, China</td>
			<td>CR537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>9180527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Glucagon antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10988</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse insulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3014s</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-pointed perfusion needle</td>
			<td>Oloey, China</td>
			<td>005</td>
			<td>32G, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Meilune, China</td>
			<td>MB4219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Medical Animal Center of Guangdong Province</td>
			<td></td>
			<td>8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL, China</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>General,Non-treated,87.8 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalosporin</td>
			<td>Lukang medical, China</td>
			<td>150303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codos Pet Clipper</td>
			<td>Szcodos, China</td>
			<td>CP-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase Type V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-hank&#39;s buffer</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5140-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining media</td>
			<td>Beyotime Biotech, China</td>
			<td>C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel-loading pipet tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin staining media</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14166S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1119</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>5190313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-tight culture dish</td>
			<td>DVS, China</td>
			<td>AN-5058548</td>
			<td>self-made, glass dish sprayed with black paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Adhesive Tape</td>
			<td>Cofoe, China</td>
			<td>K12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-invasive microtweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11033-11 and F12016-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>33391713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12012-12 and S11001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (penicillin / streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STZ (streptozotocin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Strip</td>
			<td>GenUltimate</td>
			<td>100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>SA00007-2</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamp</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R31006-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets

Pankreas holmetransplantasjon er en veletablert terapeutisk behandling for type 1 diabetes. Nyrekapselen er det mest brukte stedet for holmetransplantasjon hos gnagermodeller. Den stramme nyrekapselen begrenser imidlertid transplantasjonen av tilstrekkelige holmer hos store dyr og mennesker. Det inuinale subkutane hvite fettvevet (ISWAT), et nytt subkutant rom, ble funnet å være et potensielt verdifullt sted for holmetransplantasjon. Dette nettstedet har bedre blodtilførsel enn andre subkutane mellomrom. Videre har ISWAT plass til en større holmemasse enn nyrekapselen, og transplantasjon i den er enkel. Dette manuskriptet beskriver prosedyren for mus holme isolasjon og transplantasjon i ISWAT stedet for syngeneic diabetisk mus mottakere. Ved hjelp av denne protokollen ble murine bukspyttkjerteløyer isolert av standard kollagennase fordøyelse og en kjellermembran matrise hydrogel ble brukt til å fikse rensede holmer i ISWAT-området. Blodsukkernivået til mottakermusene ble overvåket i mer enn 100 dager. Islet grafts ble hentet på dag 100 etter transplantasjon for histologisk analyse. Protokollen for holmetransplantasjon i ISWAT-nettstedet beskrevet i dette manuskriptet er enkel og effektiv.

To prosedyrer er innført i denne protokollen: murine holme forberedelse og holme transplantasjon i ISWAT området. I den første prosedyren, etter perfusing og fordøye med Type V kollagenslikløsning, rensing med Histopaque-1119 og Histopaque-1077 og en ekstra håndplukking trinn, vil de isolerte murine holmer være tilstrekkelig ren transplantasjon (som vist i figur 1) og de isolerte holmer som har høy levedyktighet vil bli brukt til transplantasjon (som vist i figur...

Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

I denne protokollen er en metode for murine holmeisolasjon og transplantasjon i det inuinale subkutane hvite fettvevet beskrevet. Isolerte syngeneiske murine holmer transplanterer til en murine mottaker ved hjelp av en kjeller membran hydrogel. Blodsukkernivået til mottakerne overvåkes, og histologianalyse av holmetransplantatene utføres.

Inguinal Subkutan hvit fettvev (ISWAT) Transplantasjon Modell av Murine Holmer

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Holmetransplantasjon er en av de mest lovende tilnærmingene for behandling av type I diabetes mellitus. Og søket etter et passende sted for holmetransplantasjon pågår. Holmetransplantasjon til inguinal subkutant hvitt fettvev er en enkel, men effektiv metode som kan ha kliniske implikasjoner.Ekstrapolering av denne prosedyren til klinikken kan føre til utvikling av en kur for type I diabetikere. Denne metoden kan gi innsikt i klinisk holmetransplantasjon da lingual har blitt fastslått å ikke være et ideelt sted for holmegraftment. Det er viktig å nøye følge hvert trinn i prosedyren, spesielt viktige trinn, for eksempel bukspyttkjertelfordøyelsen.Visuell demonstrasjon vil hjelpe forskere nye til teknikken for å bedre bestemme hvordan du utfører holme isolasjon og omdamutasjon. For holmeinnhøsting, spray først pelsen til en 10 uker gammel C57 svart seks mus med 75% etanol, og fyll en fem milliliter sprøyte med nylaget collagenaseløsning. Utstyr sprøyten med en 32-gauge bøying stump spiss perfusjonsnål, og plasser musen i liggende stilling på en ispose.Bruk rett spiss oftalmisk saks for å lage en tverrgående åpning i huden på kjønnsområdet, og utvid snittet mot dyrets hode. Helt åpne magen via et V-snitt fra kjønnsområdet til xiphoid prosessen, og flytte leveren for å avsløre galleblæren og hele lengden av den vanlige gallekanalen. Bruk deretter en vaskulær klemme for å lukke duodenalåpningen av den vanlige gallekanalen og kutt en liten åpning i galleblæren.Kanylere den vanlige gallekanalen gjennom åpningen med den tidligere tilberedte perfusjonsnålen, og injiser omtrent to milliliter kollagenoppløsning i bukspyttkjertelen. Når alle kollagenase er levert, bruk to par ikke-invasive mikro pinsett for å skille den perfused bukspyttkjertelen fra tarmene, magen og milten, og legg bukspyttkjertelen i et 50 milliliter konisk rør på is. Når alle prøvene er samlet inn, legg til 100 mikroliter dnase i per bukspyttkjertel til de 50 milliliter rørene og kraftig riste hvert rør ca 40 ganger over en periode på 10 sekunder før du plasserer vevet i et 37 graders Celsius vannbad i tre til fem minutter med moderat risting.På slutten av inkubasjonen, legg opp til et endelig volum på 50 milliliter Stop Solution for å arrestere fordøyelsen. Og puls sentrifuge rørene til en hastighet på 750 ganger G ved fire grader Celsius før raskt stoppe sentrifuge. Etter å ha kastet supernativane, vask pellets to ganger i 15 til 25 milliliter Stop Solution per vask under de samme sentrifugasjonsforholdene som nettopp demonstrert.Etter den andre vasken, basseng tre pellets per rør i nye 50 milliliter koniske rør. Og resuspend bukspyttkjertelceller i et totalt volum på ti milliliter histopaque 1119. Deretter legger du forsiktig til fem milliliter histopask 1077 ned på siden av hvert rør, etterfulgt av fem milliliter HBSS.Skill cellene ved sentrifugering og bruk en fem milliliter Pasteur pipette for å samle holmene fra HBSS Histopaque 1077-grensesnittet. Pool holmene i en ny 50 milliliter konisk rør i et endelig volum på 50 milliliter Stop Solution for puls sentrifugering, og kast supernatant. Resuspend pellet i 30 milliliter frisk Stop Solution for en ett minutt sentrifugering, og resuspend holmene i 30 milliliter kultur medium.Dekanter holmene i en 10 centimeter lystett kulturrett per rør. Og legg parabolen under stereomikroskopet. Bruk 200 mikroliter gel-lasting pipette tips, hånd plukke de hvite sfæroide holmer fra løsningen.Plassere holmene i en ubehandlet celle kultur rett som inneholder 10 milliliter kultur medium som de høstes. Kontroller renheten på de håndplukkede holmene ved å fargedioner under et lett mikroskop. Og oppdage levedyktigheten til holmene ved fluorescein diacetate propidium iodide farging under et blomstrende mikroskop.Deretter kultur de isolerte holmene i frisk kultur medium på 37 grader Celsius i 95% luft og 5% karbondioksid til transplantasjon. Startdager tre og fire etter diabetesinduksjon, punktere caudalvenen til hver streptozotocin-injisert åtte uker gammel mannlig C57 svart seks mus rundt 10:00 a.m. for å samle en blodprøve fra hvert mottakerdyr.Bruk et grunnleggende blodsukkerovervåkingsinstrument for å bestemme det ikke-faste blodsukkernivået til hver mus og legg deretter blodet på individuelle teststrimler. Når et dyr har vist et blodsukkernivå på minst 20 millimol per liter to dager på rad, veie og merk mottakermusen og bekreft mangel på respons på pedalrefleks hos bedøvede dyr. Plasser en aliquot av hydrogel fra minus 20 grader Celsius lagring på is for tining.Og overfør 450 til 500 holmekvivalenter per mottaker til et sterilt sentrifugerør på 1,5 milliliter som inneholder 200 mikroliter medium per rør på is. Vattpinne venstre inngangsområde av mottakeren med 75% etanol og plasser musen i liggende stilling. Fest lemmer med kirurgisk tape, og bruk clippers for å fjerne håret rundt operasjonsstedet.Vattpinne det kirurgiske området med iodophor og gjøre et vertikalt snitt i den desinfiserte huden. Identifiser den dårligere epigastriske arterien og venen i ISWAT og lag en liten lomme over karene. Sediment holmene ved sentrifugering og fjern så mye overnatur som mulig.Tilsett 20 mikroliter tint hydrogel til hvert rør, og forsiktig bruke holmene, og ta vare på å unngå bobler. Når en homogen suspensjon er oppnådd, bruk en 200 mikroliter pipettespiss for å forsiktig levere hele holmehydrogelblandingen fra ett rør og inn i lommen. Når hydrogelen er helt størknet, tilsett 20 mikroliter cefalosporin til transplantasjonsstedet, og lukk muskelen og huden med en 5-0 kontinuerlig kirurgisk sutur.Plasser deretter mottakeren i et rent bur på en termisk pute med overvåking til full recumbency. Etter murine holmebehandling som demonstrert, vil de isolerte murine holmene være tilstrekkelig rene for transplantasjon. Kun isolerte holmer med høy levedyktighet bør brukes til transplantasjon.Etter grundig blanding av holmetransplantater med hydrogel, kan transplantatet implanteres inn i ISWAT-området. Etter omtrent en måned med transplantasjon i ISWAT, reverserer holmetransplantatet hyperglykemi mens kroppsvekten til mottakermusene gradvis øker. Ved 100 dager etter transplantasjon resulterer fjerning av transplantatene i en umiddelbar økning i 10:00 a.m.ikke-fastende blodsukkernivå. Histologisk analyse på dette tidspunktet, avslører at holmetransplantater har forblitt intakte. Og insulin og glukagon immunofluorescent farging indikerer at de transplanterte holmene er også funksjonelle ved 100 dager etter transplantasjon.Vær forsiktig så du ikke rister de profused bukspyttkjertelcellene for robust, ellers vil evnen til de oppnådde holmene bli kompromittert. Isolerte holmer kan transplanteres under nyrekapselen som en kontroll for å sammenligne effekten av den isolerte transplantasjonen i inngangsskåret hvitt fettvev på stedet. Prosedyren vil legge initiering av kliniske studier av holmetransplantasjon til andre steder i tillegg til leveren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Mus Modell av kirurgisk indusert Endometriose av Auto-transplantasjon av livmor Tissue

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Utvikling av obliterans Bronkiolitt i en murine modell av Orthotopic lungetransplantasjon

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Murint Cervical hjertetransplantasjon Model Ved hjelp av en modifisert Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantasjon av Pulmonary Valve Bruke en mus modell av Heterotop hjertetransplantasjon

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murine Hornhinnen Transplantasjon: En modell for å studere den vanligste formen for organtransplantasjon

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Innkapsling Thermogenic preadipocytes for Transplantasjon inn fettvev depoter

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

En allsidig Murine modell av Subkortikal hvit substans Stroke for studier av aksonal degenerasjon og hvit substans nevrobiologi

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Opprettelse og transplantasjon av en liggende under Adipose-avledet stilk cellen (ASC) ark i en diabetiker sårhelende modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknikk for Subcutaneous Abdominal fettvev biopsi via en ikke-diathermy-metode

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantasjon av fettvev-avledet stilk cellen ark å redusere lekkasje etter delvis Colectomy i en rotte modell

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...