Name: inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de I+D de China (2017YFC1103704)Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en la Provincia de Guangdong (2019), Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201412020), Fondo para el Alto Nivel Construcción de disciplina médica de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZJ2018059), Medical Fundación de Investigación Científica de la Provincia China de Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Todos los procedimientos de este protocolo siguieron los principios de bienestar animal del Comité de Revisión de la Etica del Shenzhen Second People's Hospital. Los receptores de injertos de isla y los donantes fueron ratones machoC de 8 a 10 semanas de edad comprados en el Centro Médico de Animales de la Provincia de Guangdong. El procedimiento de recolección, aislamiento, cultivo o administración de las células cosechadas se llevó a cabo en condiciones asépticas.
1. Preparación de is...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now.">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).</li><li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets.">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li><li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation.">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li><li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation.">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li><li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+islet+transplantation:+is+the+future+finally+now.">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li><li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients,+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants.">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li><li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes:+recent+advances+and+future+challenges.">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li><li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation?+Review+article.">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li><li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment.">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li><li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver.">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li><li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation:+alternative+sites.">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li><li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation.">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse.">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).</li><li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model.">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li></ol>

El trasplante de islotes de páncreas es una terapia prometedora para tratar la T1DM. El efecto de esta terapia se ve afectado por muchos factores y elegir un sitio óptimo para la implantación de islotes es extremadamente importante. El sitio anatómico ideal para el trasplante de islotes debe tener las siguientes características: accesibilidad para trasplantes simples, biopsia sin procedimientos de recuperación de injertos; complicaciones reducidas; alta tasa de éxito del control de la glucosa en sangre; y la super...

La incidencia y prevalencia mundial de la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) está aumentando rápidamente, según los datos estadísticos de la Federación Internacional de Diabetes (FID)1. El trasplante de islotes es uno de los enfoques más prometedores para el tratamiento de T1DM4. Dado que se informó del gran avance realizado en el trasplante clínico de islotes utilizando el protocolo Edmonton2, la supervivencia del injerto de islotes en funcionamiento en receptores de T1DM después de 5 años ahora alcanza aproximadamente el 50%3.
En el pasado, se exploraron varios sitios de trasplante, como el hígado, la cápsula renal, el bazo, la región intramuscular, el espacio subcutáneo, la médula ósea y la bolsa omental para el trasplante experimental de islotes5,6,7. Algunos de los sitios anteriores han sido probados en entornos clínicos8. Aunque el trasplante de islotes en el hígado sigue siendo el método más utilizado en la aplicación clínica en la actualidad9,hay varios problemas importantes para abordar cuando se utiliza este sitio. Por ejemplo, cómo reducir la pérdida temprana de los islotes trasplantados causada por la reacción inflamatoria mediada instantánea en sangre (IBMIR) y el suministro de mala oxigenación10,11 y cómo recuperar los injertos de islotes si es necesario, porque se localizan difusamente en el hígado. La cápsula renal puede ser un sitio ideal para los receptores de roedores. Sin embargo, la cápsula renal apretada limita el trasplante de suficientes islotes alogénicos en humanos, aunque puede ser un mejor ajuste para el xenotrasplante de islotes debido a las preparaciones de islotes porcinos altamente purificadas utilizadas clínicamente5,12. Por lo tanto, la búsqueda de un sitio más adecuado para el trasplante de islotes está en curso.
El espacio subcutáneo puede utilizarse como un sitio clínicamente aplicable para el trasplante de islotes debido a su accesibilidad. Sin embargo, la eficiencia del trasplante de islotes en el espacio subcutáneo es extremadamente baja, por lo que requiere un número relativamente grande de islotes para revertir la hiperglucemia13. Recientemente, un equipo de investigación japonés encontró el ISWAT, un sitio subcutáneo novedoso superior para el trasplante de islotes en un modelo murino en comparación con el hígado14. El ISWAT contiene la arteria epigástrica y la vena, por lo que el suministro de sangre rica puede asegurar la revascularización del injerto de islet. En este manuscrito, proponemos un método de implantación fácil utilizando un hidrogel de matriz de membrana de sótano para fijar islotes murinos sinémicos en el ISWAT. Este protocolo resulta eficaz para el trasplante de islotes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe-driven Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pasteur pipette</td>
			<td>JingAn Biological, China</td>
			<td>J00085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 surgical suture</td>
			<td>sh-Jinhuan, China</td>
			<td>CR537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>9180527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Glucagon antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10988</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse insulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3014s</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-pointed perfusion needle</td>
			<td>Oloey, China</td>
			<td>005</td>
			<td>32G, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Meilune, China</td>
			<td>MB4219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Medical Animal Center of Guangdong Province</td>
			<td></td>
			<td>8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL, China</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>General,Non-treated,87.8 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalosporin</td>
			<td>Lukang medical, China</td>
			<td>150303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codos Pet Clipper</td>
			<td>Szcodos, China</td>
			<td>CP-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase Type V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-hank&#39;s buffer</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5140-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining media</td>
			<td>Beyotime Biotech, China</td>
			<td>C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel-loading pipet tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin staining media</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14166S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1119</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>5190313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-tight culture dish</td>
			<td>DVS, China</td>
			<td>AN-5058548</td>
			<td>self-made, glass dish sprayed with black paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Adhesive Tape</td>
			<td>Cofoe, China</td>
			<td>K12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-invasive microtweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11033-11 and F12016-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>33391713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12012-12 and S11001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (penicillin / streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STZ (streptozotocin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Strip</td>
			<td>GenUltimate</td>
			<td>100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>SA00007-2</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamp</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R31006-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets

El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento terapéutico bien establecido para la diabetes tipo 1. La cápsula renal es el sitio más utilizado para el trasplante de islotes en modelos de roedores. Sin embargo, la cápsula renal apretada limita el trasplante de islotes suficientes en animales grandes y humanos. Se encontró que el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT), un nuevo espacio subcutáneo, era un sitio potencialmente valioso para el trasplante de islotes. Este sitio tiene mejor suministro de sangre que otros espacios subcutáneos. Además, el ISWAT acomoda una masa de islotes más grande que la cápsula renal, y el trasplante en ella es simple. Este manuscrito describe el procedimiento de aislamiento y trasplante de islotes de ratón en el sitio ISWAT de los receptores de ratones diabéticos singéricos. Usando este protocolo, los islotes pancreáticos murinos fueron aislados por la digestión de la colagenasa estándar y se utilizó un hidrogel de matriz de membrana del sótano para fijar los islotes purificados en el sitio ISWAT. Los niveles de glucosa en sangre de los ratones receptores se monitorizaron durante más de 100 días. Los injertos de islotes fueron recuperados en el día 100 después del trasplante para análisis histológicos. El protocolo para el trasplante de islotes en el sitio ISWAT descrito en este manuscrito es simple y eficaz.

En este protocolo se introducen dos procedimientos: preparación de islotes murinos y trasplante de islotes en el sitio ISWAT. En el primer procedimiento, después de perfumar y digerir con solución de colagenasa tipo V, purificar con Histopaque-1119 e Histopaque-1077 y un paso adicional de recogida manual, los islotes murinos aislados serán lo suficientemente puros para el trasplante (como se muestra en la Figura 1)y los islotes aislados que tienen una alta viabilidad se utilizarán para ...

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Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

En este protocolo, se describe un método de aislamiento de islotes murinos y trasplante en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal. Los islotes murinos sinémicos aislados se trasplantan en un receptor murino utilizando un hidrogel de membrana del sótano. Se controla el nivel de glucosa en sangre de los receptores y se realiza un análisis histológico de los injertos de islos.

Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

El trasplante de islotes es uno de los enfoques más prometedores para tratar la diabetes mellitus tipo I. Y la búsqueda de un sitio adecuado para el trasplante de islotes está en curso. El trasplante de islotes al tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal es un método simple pero eficaz que puede tener implicaciones clínicas.La extrapolación de este procedimiento a la clínica puede conducir al desarrollo de una cura para los diabéticos de tipo I. Este método podría proporcionar información sobre el trasplante clínico de islotes, ya que se ha determinado que el lingual no es un sitio ideal para el injerto de islotes. Es importante seguir cuidadosamente cada paso del procedimiento, especialmente los pasos clave, como la digestión del páncreas.La demostración visual ayudará a los investigadores nuevos en la técnica a determinar mejor cómo realizar el aislamiento del islote y la transmutación. Para la cosecha de islotes, primero rocíe el pelaje de un ratón C57 negro de 10 semanas con 75% de etanol, y llene una jeringa de cinco mililitros con solución de colágeno recién preparada. Equipe la jeringa con una aguja de perfusión puntiaguda contundente de calibre 32 y coloque el ratón en la posición supina en una bolsa de hielo.Utilice tijeras oftálmicas puntiagudas rectas para hacer una abertura transversal en la piel de la zona púbica, y extender la incisión hacia la cabeza del animal. Abra completamente el abdomen a través de una incisión en V desde la región púbica hasta el proceso de xifoide, y mueva el hígado para exponer la vesícula biliar y toda la longitud del conducto biliar común. Luego usa una abrazadera vascular para cerrar la abertura duodenal del conducto biliar común y corta una pequeña abertura en la vesícula biliar.Cannular el conducto biliar común a través de la abertura con la aguja de perfusión previamente preparada, e inyectar aproximadamente dos mililitros de solución de colagenasa en el páncreas. Cuando se haya entregado toda la colagenasa, utilice dos pares de micro pinzas no invasivas para separar el páncreas perfundido de los intestinos, el estómago y el bazo, y coloque el páncreas en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Una vez recogidas todas las muestras, añada 100 microlitros de dnasa I por páncreas a los tubos de 50 mililitros y agite vigorosamente cada tubo unas 40 veces durante un período de 10 segundos antes de colocar los tejidos en un baño de agua de 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos con un temblor moderado.Al final de la incubación, sume un volumen final de 50 mililitros de Stop Solution para detener la digestión. Y centrifuga los tubos a una velocidad de 750 veces G a cuatro grados Celsius antes de detener rápidamente la centrífuga. Después de desechar los sobrenadantes, lave los pellets dos veces en 15 a 25 mililitros de Stop Solution per wash en las mismas condiciones de centrifugación que acabamos de demostrar.Después del segundo lavado, acarone tres pellets por tubo en nuevos tubos cónicos de 50 mililitros. Y resuspender las células pancreáticas en un volumen total de diez mililitros de Histopaque 1119. A continuación añadir cuidadosamente cinco mililitros de Histopaque 1077 por el lado de cada tubo, seguido de cinco mililitros de HBSS.Separe las células por centrifugación y utilice una pipeta Pasteur de cinco mililitros para recoger los islotes de la interfaz HBSS Histopaque 1077. Acoja los islotes en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros en un volumen final de 50 mililitros de Stop Solution para centrifugación por pulsos, y deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en 30 mililitros de solución de parada fresca para una centrifugación de un minuto, y resuspender los islotes en 30 mililitros de medio de cultivo.Decantar los islotes en un plato de cultivo ligero de 10 centímetros por tubo. Y coloca el plato debajo del microscopio estéreo. Usando puntas de pipeta de carga de gel de 200 microlitros, escoja a mano los islotes esferoidales blancos de la solución.Colocar los islotes en un plato de cultivo celular no tratado que contenga 10 mililitros de medio de cultivo a medida que se cosechan. Compruebe la pureza de los islotes recogidos a mano mediante tinción de dithizona bajo un microscopio de luz. Y detectar la viabilidad de los islotes por fluoresceína diacetato propidium tinción de yoduro bajo un microscopio florescente.A continuación, cultivo de los islotes aislados en medio de cultivo fresco a 37 grados Celsius en 95%aire y 5% dióxido de carbono hasta el trasplante. A partir de los días tres y cuatro después de la inducción de la diabetes, perforar la vena caudal de cada macho C57 macho de ocho semanas de edad de edad de seis ratón negros alrededor de las 10:00 a.m. para recoger una muestra de sangre de cada animal receptor.Utilice un instrumento básico de control de la glucosa en sangre para determinar el nivel de glucosa en sangre no en ayunas de cada ratón y luego agregue la sangre a las tiras reactivas individuales. Cuando un animal ha demostrado un nivel de glucosa en sangre de al menos 20 milimolemols por litro dos días seguidos, pesar y marcar el ratón receptor y confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en los animales anestesiados. Coloque una alícuota de hidrogel de menos 20 grados Centígrados de almacenamiento sobre hielo para descongelar.Y transfiera de 450 a 500 equivalentes de islotes por receptor a un tubo centrífuga estéril de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de medio por tubo en hielo. Frote el área inguinal izquierda del receptor con 75% de etanol y coloque el ratón en la posición supina. Fije las extremidades con cinta quirúrgica y use cortadoras para eliminar el cabello alrededor del sitio quirúrgico.Frotar el área quirúrgica con yodoforo y hacer una incisión vertical en la piel desinfectada. Identifique la arteria epigástrica inferior y la vena dentro del ISWAT y cree un pequeño bolsillo por encima de los vasos. Sedimentar los islotes por centrifugación y eliminar tanto sobrenadante como sea posible.Añadir 20 microlitros de hidrogel descongelado a cada tubo, y resuspender suavemente los islotes, teniendo cuidado de evitar burbujas. Cuando se haya obtenido una suspensión homogénea, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para entregar cuidadosamente toda la mezcla de hidrogel de islotes de un tubo en el bolsillo. Cuando el hidrogel se haya solidificado por completo, añadir 20 microlitros de cefalosporina al sitio de trasplante, y cerrar el músculo y la piel con una sutura quirúrgica continua de 5-0.A continuación, coloque el destinatario en una jaula limpia en una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recumbencia completa. Después del procesamiento de islotes murinos como se ha demostrado, los islotes murine aislados serán lo suficientemente puros para el trasplante. Sólo se deben utilizar islotes aislados con una alta viabilidad para el trasplante.Después de una mezcla exhaustiva de los injertos de islotes con hidrogel, el injerto se puede implantar en el sitio ISWAT. Después de aproximadamente un mes de trasplante en el ISWAT, los injertos de islotes invierten la hiperglucemia mientras que el peso corporal de los ratones receptores aumenta gradualmente. A los 100 días después del trasplante, la extracción de los injertos da como resultado un aumento inmediato en la 10:00 a.m.nivel de glucosa en sangre no en ayunas. El análisis histológico en este momento.revela que los injertos de islotes han permanecido intactos. Y la tinción inmunofluorescente de insulina y glucagón indica que los islotes trasplantados también funcionan a los 100 días después del trasplante.Tenga cuidado de no agitar las células del páncreas profundadas demasiado robustas o de lo contrario la capacidad de los islotes obtenidos se verá comprometida. Los islotes aislados se pueden trasplantar bajo la cápsula renal como control para comparar los efectos del trasplante aislado en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal en el lugar. El procedimiento añadirá el inicio de ensayos clínicos de trasplante de islotes a otros sitios además del hígado.

Research

JoVE Journal

Medicine

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Modelo de ratón de la endometriosis quirúrgicamente inducida por la Auto-trasplante de tejido uterino

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Investigación

Medicina

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

El desarrollo de bronquiolitis obliterante en un modelo murino de trasplante de pulmón ortotópico

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Murino Cervical Trasplante Cardiaco Modelo Usando una técnica de Cuff Modificado

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

El trasplante de la válvula pulmonar Utilizando un modelo de ratón de heterotópico trasplante cardiaco

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murino Trasplante corneal: un modelo para estudiar la forma más común de trasplante de órganos sólidos

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

La encapsulación termogénico preadipocitos para el trasplante en los depósitos de tejido adiposo

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Un movimiento versátil modelo murino de la sustancia blanca subcortical para el Estudio de la degeneración axonal y la sustancia blanca Neurobiología

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

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Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

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Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Trasplante de células madre derivadas de tejido adiposo hoja para reducir fugas después de colectomía parcial en un modelo de rata

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...