Name: inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Key FoU Program of China (2017YFC1103704)SpecialFunds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medicinsk disciplin Konstruktion av Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY2016029204849975, GJHZ201703141713575556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong-provinsen i Kina (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).

Alla förfaranden i detta protokoll följde principerna om djurskydd i etikprövningskommittén för Shenzhen Second People's Hospital. Holme moderplantor mottagare och givare var 8- till 10-veckor gamla C57BL/6 manliga möss köpt från Medical Animal Center i Guangdong-provinsen. Förfarandet för skörd, isolering, kultur eller administrering av de skördade cellerna utfördes under aseptiska förhållanden.
1. Holme beredning
<ol><li>Förbered en kollagentyp V-arbetslösning. Väg kollag...

<ol>
	<li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDF+Diabetes+Atlas:+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045.">IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li><li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).</li><li>Pathak, V., Pathak, N. M., O'Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+for+Type+1+Diabetes:+Current+Scenario+and+Future+Perspectives.">Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).</li><li>Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Future+of+Islet+Transplantation+Is+Now.">The Future of Islet Transplantation Is Now.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).</li><li>Stokes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+sites+for+human+and+murine+islets.">Transplantation sites for human and murine islets.</a> Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).</li><li>van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+choice+of+anatomical+site+for+islet+transplantation.">The choice of anatomical site for islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).</li><li>Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+an+Alternative+Site+of+Islet+Cell+Transplantation.">Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).</li><li>Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+islet+transplantation:+is+the+future+finally+now.">Clinical islet transplantation: is the future finally now.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).</li><li>Bellin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+islet+function+in+islet+allotransplant+and+autotransplant+recipients,+despite+lower+islet+mass+in+autotransplants.">Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants.</a> Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).</li><li>Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+cell+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes:+recent+advances+and+future+challenges.">Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).</li><li>Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+renal+subcapsular+space+the+preferred+site+for+clinical+porcine+islet+xenotransplantation?+Review+article.">Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).</li><li>Luan, N. M., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+allogeneic+islet+graft+survival+in+prevascularized+subcutaneous+sites+without+immunosuppressive+treatment.">Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment.</a> American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).</li><li>Yasunami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Subcutaneous+Site+of+Islet+Transplantation+Superior+to+the+Liver.">A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver.</a> Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).</li><li>Rajab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation:+alternative+sites.">Islet transplantation: alternative sites.</a> Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).</li><li>Ekser, B., Vagefi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+for+the+best+site+in+islet+xenotransplantation.">Search for the best site in islet xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Islet+Transplantation+to+the+Omentum+in+Mouse.">A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).</li><li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination.">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).</li><li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraportal+Transplantation+of+Pancreatic+Islets+in+Mouse+Model.">Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li></ol>

Pankreas holme transplantation är en lovande terapi för att behandla T1DM. Effekten av denna behandling påverkas av många faktorer och att välja en optimal plats för holme implantation är oerhört viktigt. Den idealiska anatomiska platsen för holmtransplantation bör ha följande egenskaper: tillgänglighet för enkla transplantations-, biopsi- och grafthämtningsförfaranden; minskade komplikationer; hög framgång av blodsockerkontroll; och långsiktig överlevnad av holme ympkvistar15<s...

Den globala förekomsten och förekomsten av typ 1 diabetes mellitus (T1DM) ökar snabbt, enligt statistiska uppgifter från International Diabetes Federation (IDF)1. Holme transplantation är en av de mest lovande metoder för behandling av T1DM4. Eftersom det stora genombrott som gjorts i klinisk holme transplantation med Edmonton protokoll2 rapporterades, fungerande holme moderplantor överlevnad i T1DM mottagare efter 5 år når nu ca 50%3.
Tidigare undersöktes flera transplantationsplatser, såsom lever, njurkapsel, mjälte, intramuskulära regionen, subkutant utrymme, benmärg och omental påse för experimentell holmetransplantation5,6,7. Några av ovanstående platser har testats i kliniska inställningar8. Även om holme transplantation i levern är fortfarande den mest använda metoden i klinisk tillämpning för närvarande9,Det finns flera viktiga problem att ta itu med när du använder denna webbplats. Till exempel, hur man kan minska tidig förlust av de transplanterade holmarna som orsakas av omedelbar blod medierad inflammatorisk reaktion (IBMIR) och dålig syresättning leverans10,11 och hur man hämtar holme ympkvistar om det behövs, eftersom de diffust lokalisera i levern. Njurkapseln kan vara en idealisk plats för gnagare mottagare. Den snäva njurkapseln begränsar dock transplantationen av tillräckliga allogena holmar hos människor, även om det kan vara en bättre passform för holme xenotransplantation på grund av de starkt renade svinholmspreparatsom används kliniskt5,12. Därför pågår sökandet efter en lämpligare plats för holmtransplantation.
Det subkutana utrymmet kan användas som ett kliniskt tillämpligt område för holmtransplantation på grund av dess tillgänglighet. Emellertid, effektiviteten av holme transplantation i subkutan utrymme är extremt låg, vilket kräver ett relativt stort antal öar för att vända hyperglykemi13. Nyligen fann en japansk forskargrupp ISWAT, en ny subkutan plats överlägsen för holme transplantation i en murine modell jämfört med levern14. ISWAT innehåller epigastrigasartär och ven, så den rika blodtillförseln kan säkerställa holme graft revascularization. I detta manuskript föreslår vi en enkel implantationsmetod med hjälp av en membranmatrishydrogel för att fixa syngeneic murine holmar i ISWAT. Detta protokoll visar sig vara effektivt för holme transplantation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Syringe-driven Filter Unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pasteur pipette</td>
			<td>JingAn Biological, China</td>
			<td>J00085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 surgical suture</td>
			<td>sh-Jinhuan, China</td>
			<td>CR537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe</td>
			<td>Szboon, China</td>
			<td>20170623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Ethanol</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>9180527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Glucagon antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10988</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse insulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3014s</td>
			<td>Dilution (1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt-pointed perfusion needle</td>
			<td>Oloey, China</td>
			<td>005</td>
			<td>32G, yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Meilune, China</td>
			<td>MB4219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Medical Animal Center of Guangdong Province</td>
			<td></td>
			<td>8~10 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL, China</td>
			<td>TCD000100</td>
			<td>General,Non-treated,87.8 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cephalosporin</td>
			<td>Lukang medical, China</td>
			<td>150303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Codos Pet Clipper</td>
			<td>Szcodos, China</td>
			<td>CP-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase Type V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-hank&#39;s buffer</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5140-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin staining media</td>
			<td>Beyotime Biotech, China</td>
			<td>C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescein diacetate (FDA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel-loading pipet tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Coolaber, China</td>
			<td>PM5150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin staining media</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14166S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOPAQUE-1119</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RNBG0536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodophor</td>
			<td>LIRCON, China</td>
			<td>5190313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-tight culture dish</td>
			<td>DVS, China</td>
			<td>AN-5058548</td>
			<td>self-made, glass dish sprayed with black paint</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Adhesive Tape</td>
			<td>Cofoe, China</td>
			<td>K12001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-invasive microtweezers</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F11033-11 and F12016-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>33391713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12012-12 and S11001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S (penicillin / streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STZ (streptozotocin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Strip</td>
			<td>GenUltimate</td>
			<td>100-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>SA00007-2</td>
			<td>Dilution (1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamp</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>R31006-04</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inguinal subcutaneous white adipose tissue (iswat) transplantation model of murine islets

Pankreasholmstransplantation är en väletablerad terapeutisk behandling för typ 1-diabetes. Njurkapseln är den vanligaste platsen för holmtransplantation hos gnagare modeller. Den snäva njurkapseln begränsar dock transplantationen av tillräckliga öar hos stora djur och människor. Den inguinal subkutana vita fettvävnad (ISWAT), en ny subkutan utrymme, befanns vara en potentiellt värdefull plats för holme transplantation. Denna webbplats har bättre blodtillförsel än andra subkutanutrymmen. Dessutom rymmer ISWAT en större holme massa än njurkapseln, och transplantation i det är enkelt. Detta manuskript beskriver förfarandet för musislet isolering och transplantation i ISWAT platsen för syngeneic diabetiker mus mottagare. Med hjälp av detta protokoll isolerades murine bukspottkörteln holmar av standard kollagen matsmältningen och en källare membran matris hydrogel användes för fastställande av renade holmar i ISWAT webbplats. Mottagarmössens blodsockernivåer övervakades i mer än 100 dagar. Holme ympkvistar hämtades dag 100 efter transplantation för histologisk analys. Protokollet för holmtransplantation på ISWAT-webbplatsen som beskrivs i detta manuskript är enkelt och effektivt.

Två förfaranden införs i detta protokoll: murine holme förberedelse och holme transplantation i ISWAT webbplats. I det första förfarandet, efter genomblandning och smältning med typ V kollagenomlösning, renande med Histopaque-1119 och Histopaque-1077 och ytterligare handplockning steg, de isolerade murine holmar kommer att vara tillräckligt ren för transplantation (som visas i figur 1) och de isolerade holmar som har en hög lönsamhet kommer att användas för transplantation (som...

Watch this Scientific Journal Video about Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets at JoVE.com

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

I detta protokoll beskrivs en metod för murinisletisolering och transplantation i inguinal subkutan vit fettvävnad. Isolerade syngeneic murine holmar transplanteras till en murine mottagare med hjälp av en källare membran hydrogel. Mottagarnas blodsockernivå övervakas och histologianalys av holmetransplantaten utförs.

Inguinal Subkutan vit fettvävnad (ISWAT) Transplantation modell av murinholmskulter

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Holme transplantation är en av de mest lovande metoder för behandling av typ I diabetes mellitus. Och sökandet efter en lämplig plats för holme transplantation pågår. Holme transplantation till inguinal subkutan vit fettvävnad är en enkel men effektiv metod som kan ha kliniska konsekvenser.Extrapolering av detta förfarande till kliniken kan leda till utveckling av ett botemedel mot typ I diabetiker. Denna metod skulle kunna ge insikt i kliniska holme transplantation som lingual har fastställts att inte vara en idealisk plats för holme engraftment. Det är viktigt att noggrant följa varje steg i förfarandet, särskilt viktiga steg, såsom bukspottkörteln matsmältningen.Visuell demonstration kommer att hjälpa forskare nya till tekniken för att bättre avgöra hur man utför holme isolering och transmutation. För holme skörd, först spraya pälsen av en 10 veckor gammal C57 svart sex mus med 75%etanol, och fyll en fem milliliter spruta med nyberedda kollagenaslösning. Utrusta sprutan med en 32-gauge böjning trubbig spetsig perfusion nål, och placera musen i ryggläge på en ispåse.Använd raka spetsiga oftalmiska saxar för att göra en tvärgående öppning i huden på blygdområdet, och förlänga snittet mot djurets huvud. Helt öppna buken via ett V-snitt från blygdregionen till xiphoid processen, och flytta levern för att exponera gallblåsan och hela längden av den gemensamma gallgången. Använd sedan en kärlklämma för att stänga den gemensamma gallgångens duodenalöppning och skära en liten öppning i gallblåsan.Cannulate den gemensamma gallgången genom öppningen med den tidigare beredda perfusionsnålen, och injicera cirka två milliliter kollagenaslösning i bukspottkörteln. När alla kollagenas har levererats, använd två par noninvasive mikropincett för att separera perfused bukspottkörteln från tarmarna, magen och mjälte, och placera bukspottkörteln i en 50 milliliter koniska rör på is. När alla prover har samlats in, tillsätt 100 mikroliter dnase I per bukspottkörtel till 50 milliliter rör och kraftigt skaka varje rör cirka 40 gånger under en period av 10 sekunder innan du placerar vävnaderna i en 37 graders Celsius vattenbad i tre till fem minuter med måttlig skakning.I slutet av inkubationen, lägga till upp till en slutlig volym på 50 milliliter Stop Solution att arrestera matsmältningen. Och puls centrifugera rören till en hastighet av 750 gånger G vid fyra grader Celsius innan snabbt stoppa centrifug. Efter att du har kasserat supernatanterna tvättar du pelletsen två gånger i 15 till 25 milliliter Stop Solution per tvätt under samma centrifugationsförhållanden som just visats.Efter den andra tvätten, pool tre pellets per rör i nya 50 milliliter koniska rör. Och resuspend bukspottskörteln celler i en total volym av tio milliliter av Histopaque 1119. Tillsätt sedan försiktigt fem milliliter Histopaque 1077 ner på sidan av varje rör, följt av fem milliliter HBSS.Separera cellerna genom centrifugering och använd en fem milliliter Pasteur-pipett för att samla in holmarna från HBSS Histopaque 1077-gränssnittet. Poola holmarna i ett nytt koniskt rör på 50 milliliter i en slutvolym på 50 milliliter Stop Solution för pulscentrifugeringen, och kassera supernatanten. Resuspend pelleten i 30 milliliter av färsk Stop Solution för en minut centrifugering, och återanvänder holmarna i 30 milliliter av odlingsmedium.Dekantera holmarna i en 10 centimeter ljustät odlingsfat per rör. Och placera skålen under stereomikroskopet. Med hjälp av 200 mikroliter gel-lastande pipettspetsar, hand plocka de vita sfäroidala holmar från lösningen.Placera holmarna i en obehandlad cellodlingsskål som innehåller 10 milliliter odlingsmedium när de skördas. Kontrollera renheten hos de handplockade holmarna genom att dithizone färga under ett ljusmikroskop. Och upptäcka livskraften hos holmarna genom fluorescein diacetate propidium iodid färgning under en florescent mikroskop.Sedan kultur de isolerade holmar i färsk kultur medium vid 37 grader Celsius i 95%luft och 5%koldioxid fram till transplantation. Startdagar tre och fyra efter diabetes induktion, punktera caudal venen av varje streptozotocin-injiceras åtta veckor gammal manlig C57 svart sex mus runt 10:00 a.m. att samla in ett blodprov från varje mottagare djur.Använd ett grundläggande blodsockerövervakningsinstrument för att bestämma blodglukosnivån som inte är fastande för varje mus och tillsätt sedan blodet på enskilda testremsor. När ett djur har visat en blodsockernivå på minst 20 millimol per liter två dagar i rad, väga och markera mottagarmusen och bekräfta en brist på svar på pedalreflex hos de sövda djuren. Placera en alikvot av hydrogel från minus 20 grader Celsius lagring på is för upptining.Och överför 450 till 500 holme ekvivalenter per mottagare i en steril 1,5 milliliter centrifugrör som innehåller 200 mikroliter medium per rör på is. Svabb vänster inguinal område av mottagaren med 75%etanol och placera musen i ryggläge. Fixa lemmar med kirurgisk tejp, och använda clippers för att ta bort håret runt den kirurgiska platsen.Svabb det kirurgiska området med iodophor och gör ett vertikalt snitt i desinficerad hud. Identifiera sämre epigastric artär och ven inom ISWAT och skapa en liten ficka ovanför fartygen. Sedimentera holmarna genom centrifugering och avlägsna så mycket supernatant som möjligt.Tillsätt 20 mikroliter av tinade hydrogel till varje rör, och försiktigt återanvända holmarna, var noga med att undvika bubblor. När en homogen suspension har erhållits, använd en 200 microliter pipett spets för att försiktigt leverera hela holmen hydrogel blandningen från ett rör i fickan. När hydrogel har helt stelnat, tillsätt 20 mikroliter av cephalosporin till transplantationsstället, och stäng muskel och hud med en 5-0 kontinuerlig kirurgisk sutur.Placera sedan mottagaren i en ren bur på en termisk pad med övervakning tills full recumbency. Efter murine holme bearbetning som visats, de isolerade murine holmarna kommer att vara tillräckligt ren för transplantation. Endast isolerade holmar med hög livsduglighet ska användas för transplantation.Efter noggrann blandning av holmetransplantaten med hydrogel kan transplantatet implanteras i ISWAT-platsen. Efter ungefär en månads transplantation i ISWAT, vänder holmetransplantaten tillbaka hyperglykemi medan kroppsvikten hos mottagarmössen gradvis ökar. Vid 100 dagar efter transplantation, avlägsnande av ympkvistar resulterar i en omedelbar ökning av 10:00 .m.blodglukosnivå som inte är fastande. Histologisk analys vid denna tidpunkt, avslöjar att holme ympkvistar har förblivit intakt. Och insulin och glukagon immunofluorescerande färgning tyder på att de transplanterade holmar är också funktionella på 100 dagar efter transplantation.Var noga med att inte skaka profunderade bukspottkörteln celler för robust eller annars förmågan hos de erhållna holmar kommer att äventyras. Isolerade holmar kan transplanteras under njurkapseln som en kontroll för att jämföra effekterna av den isolerade transplantationen i den inguinal subkutana vita fettvävnaden på platsen. Förfarandet kommer att lägga inledandet av kliniska prövningar av holme transplantation till andra platser förutom levern.

Research

JoVE Journal

Medicine

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue

Musmodell av kirurgiskt inducerad Endometrios av Auto-transplantation av uterus Tissue

Endometriosis is a chronic, painful disease whose etiology remains unknown. Furthermore, treatment of endometriosis can require laparoscopic removal of ...

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Utveckling av obliterativ bronkiolit i en musmodell av ortotopisk Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Murina Cervical Heart Transplantation Modell hjälp av en modifierad Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantation av pulmonell ventil med hjälp av en musmodell av Heterotopisk hjärttransplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murina hornhinnetransplantation: En modell för att studera vanligaste formen av organtransplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Inkapslings Thermogenic preadipocyter för transplantation till fettvävnad Depåer

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

En mångsidig Murina Modell av subkortikala vita substansen Stroke för studien av axonal degeneration och vit substans neurobiologi

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Skapande och Transplantation av en Adipose-derived Stem Cell (ASC) blad i en diabetiker sårläkning modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

En teknik för subkutan buken fettvävnad biopsi via en icke-diatermi metod

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantation av fettvävnad-Derived stamceller blad att minska läckage efter partiell kolektomi i en råtta modell

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...