Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

这项工作得到了美国国家卫生研究院的NIH-1R56AI135039-01A1、1R21A128295-01、U54GM115371以及蒙大拿州立大学农业实验站的资金以及默多克慈善信托基金的设备赠款的支持。.

健康献血者从肝素静脉血收集根据蒙大拿州立大学人体学科机构审查委员会批准的协议。所有捐助者均表示同意参加本研究。
1. 人类多态核白细胞的纯化和人血清的分离
注：所有试剂均应使用市售内毒素检测试剂盒定期检查内毒素是否存在，并应含有<25.0 pg/mL内毒素，以防止PMN产生不必要的启动。
<ol><li>携带 50 mL 的 3% dextran-0.9% NaCl （w/v），35 mL 的 0.9% NaCl （w/v），20 mL 的 1.8% NaCl （w/v），12 mL 的 1.077 g/mL 密度梯度溶液，以及 20 mL 的注水或灌溉级水到室温。</li>
	<li>为了分离人血清，在15 mL玻璃管中37°C下孵育4 mL新鲜抽取的人体血液，无需抗凝血剂30分钟。孵育后，在室温下以2，000~3，000 μg为10分钟。将上血清层转移到新鲜的15 mL圆锥形离心管中，并放在冰上。</li>
	<li>将25 mL的新鲜提取的肝素化（1000单位/mL）全人血与25 mL的室温3%dextran-0.9%NaCl（1：1比例）结合在两个复制50 mL锥形离心管（每管50 mL总体积）。通过轻轻摇动每个 50 mL 锥形管进行混合，然后在室温下站立 30 分钟。</li>
	<li>在室温下孵育后，会出现两个独立的层。将每个 dextran-血混合物的顶层转移到新的 50 mL 锥形管中，并在室温下以 450 x g离心 10 分钟，且无制动器。</li>
	<li>小心吸出上生子并丢弃，而不会干扰细胞颗粒。在室温为0.9%NaCl的2 mL中轻轻重新悬浮每个细胞颗粒，将重新悬浮的颗粒组合在一个50 mL锥形管中，然后加入剩余的0.9%NaCl（最终体积为35 mL）。</li>
	<li>使用手移液器在细胞悬浮液下方小心地将10 mL的室温1.077 g/mL密度梯度溶液覆盖。在室温下，在低或无制动器下以 450 x g旋转 30 分钟。轻轻吸出上清液，而不会干扰细胞颗粒。上清液将含有外周血单核细胞，可以收集如前所述14。</li>
	<li>通过在室温水中20 mL中重新悬浮细胞颗粒来使红血球赖尔。轻轻混合通过摇动管30s。红血球的流化将伴随着浊度的明显下降。</li>
	<li>立即加入20 mL的1.8%NaCl（在室温[RT]）和离心机样品在450 μg在室温10分钟。 注： 在红细胞裂洛后，尽量减少PMN单独留在水中的时间，以最大限度地提高PMN产量并防止PMN裂化和/或激活，这一点很重要。</li>
	<li>小心吸出上清液，而不会干扰细胞颗粒。轻轻将细胞颗粒重新悬浮在 2 mL 的 RT RPMI 1640 介质中，并放置在冰上。</li>
	<li>使用血细胞计对细胞进行计数。用冰冷的RPMI将纯化PMN以1 x107细胞/mL的浓度重新悬浮，并保持在冰上。</li>
	<li>将 100 μL 的纯化 PMN（1 x 106细胞）与 300 μL 的冰冷 Dulbeco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 结合在两个复制的流式细胞测定管中，含有 1 μL 的碘化钠染色。为了对血浆膜损伤进行正控制，将40μL的0.5%Triton X-100溶液加入流式细胞测定管中，并彻底混合。</li>
	<li>使用流式细胞测量测量纯化细胞的正向散射、侧散射和碘化钠染色（激励/排放最大值为535/617 nm）的纯化细胞（图1）。 注：正向和侧散射分析将识别淋巴细胞和单核细胞的不需要种群。碘化钠只会染色具有受损血浆膜和纯化PMN的细胞，这些PMN具有明显的碘化钠阳性细胞群，不应使用。对于这些研究，纯化PMN仅在其包括>98%的纯化细胞和<5%染色阳性碘化钠时才使用。</li>
	<li>通过涂覆用于此测定的 100 μL 的 20% 分离的人类血清（已用 DPBS 稀释）的单个孔，为 PMN 细胞毒性测定准备 96 孔板。 注：直接在塑料或玻璃上电镀PMN会导致细胞激活。确保至少包括一个仅接收介质的负控制井和接收 0.05% Triton X-100 的正控制井。</li>
	<li>在37°C下孵育板30分钟。孵育后，用冰冷的DPBS清洗涂膜孔两次，以去除任何多余的血清。轻轻按上下颠倒的盘子，取出任何残留的 DPBS 并放置在冰上。</li>
	<li>在每个涂层井（1 x 106 PMN/井）中，以1 x 107细胞/mL轻轻添加100 μL纯化的人体PMN。通过在冰上孵育板至少5分钟，让PMN在井中沉淀，保持板的水平，使每个井中的细胞均匀分布，并留在冰上，以避免PMN的意外激活。</li>
</ol>2. 对人多态核白细胞的S.aureus细胞外蛋白的细胞毒性测定
<ol><li>培养性 S. aureus在锥体大豆汤 （TSB） 中使用 37°C 的摇动培养箱过夜。对于这些研究，在单独的 150 mL Erlenmeyer 烧瓶中，20 mL TSB 接种了S. aureus菌株 USA300 或 USA300+saeR/S的冷冻培养物，生长约 14 小时，在 250 rpm 下摇动。</li>
	<li>亚培养S. aureus通过使用新鲜介质对隔夜细菌培养进行 1：100 稀释。在37°C下孵育，摇动，直到细菌达到早期静止生长阶段。 注：对于这些实验，在150 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种200 μL 隔夜培养的 USA300 或 USA300°saeR/S的 20 mL 试青大豆汤，并在 37°C 下孵育，在 250 rpm 下摇动 5 小时。</li>
	<li>当细菌达到早期固定生长阶段时，将1 mL的亚培养的S.氨胶转移到1.5 mL微离心管中，并在室温下以5000 μ g离心5分钟。</li>
	<li>离心后，将上清液转移到3mL注射器中。将超生物通过 0.22 μm 过滤器，进入冰上新的 1.5 mL 微离心管。</li>
	<li>使用用于培养S. aureus的冰冷的介质对超生物进行连续稀释。 注：对于所示的实验，来自美国300和USA300+saeR/S的超生物连续进行了四次1/2对数稀释与冰冷的TSB。</li>
	<li>从步骤 1.15 起，将仅将上清样品或介质轻轻添加到 96 孔板上含有 PMN 的 96 孔板的单个孔中（用于负和正控制）。对于这些实验，将10μL的USA300或USA300°saeR/S上清样品添加到每个井中。轻轻的岩板在井中分配上生物，并在37°C下孵育。</li>
	<li>在所需时间，从培养箱中取出盘子，放在冰上。将 40 μL 的 0.5% Triton X-100 添加到正控制井中。</li>
	<li>轻轻地将样品上下移移到每口孔中，以完全拉出所有附着在板上的PMN，然后将样品转移到冰面上流式细胞测定管，其中含有300 μL的冰冷DPBS，含有1μL的碘化钠。</li>
	<li>使用流动细胞测定测量碘化钠阳性PMN的比例（图2A）。当与DNA结合时，碘化钠在535/617nm处有激发/发射。</li>
</ol>3. 在噬菌体后，对人多态核白细胞的Aureus细胞毒性测定
注：生长曲线由600nm（OD600）的光学密度和细菌浓度所定义，在开始此测定之前，必须根据经验确定要测试的S.aureus菌株。这些实验的成功要求使用亚培养细菌的OD600在指数中生长阶段测试的每种A.aureus菌株的浓度一致。
<ol><li>如步骤 2.1.1 和 2.1.2 中所述，开始一夜之间培养S. aureus菌株和亚培养细菌。</li>
	<li>在达到中指数增长时，通过将培养细菌的 1 mL 转移到 1.5 mL 微离心管并在室温下在 5，000 μ g下离心 5 分钟，收获亚培养的 S. aureus。 注：在我们的生长条件下，USA300和USA300+saeR/S在大约135分钟的孵育6后达到中指数增长阶段。</li>
	<li>离心后通过吸气上清液、在 DPBS 的 1 mL 中重新悬浮颗粒细菌、将样品涡旋 30 s 和在室温下在 5，000 μ g下离心 5 分钟来洗涤S. aureus。</li>
	<li>将用DPBS稀释的1mL的20%人血清中重新悬浮细菌颗粒，并在37°C下用搅拌孵育15分钟。将S.aureus重新悬浮在1mL中。</li>
	<li>在室温下，在5，000 x g下将离心菌化5分钟。在离心后通过吸气上清液，将颗粒细菌重新悬浮在1 mL DPBS中，然后涡旋样品，直到细菌颗粒完全破碎，再加30秒，洗净了Aureus。在室温下，在5，000~g下离心细菌5分钟。 </li>
	<li>在1mL RPMI中重新悬浮成蛋白酶菌株，涡旋样品，直到细菌颗粒完全破碎，然后再将细菌放在冰上30s。</li>
	<li>用冰冷的RPMI稀释蛋白酶菌株至所需浓度。涡旋30s，并放置在冰上。</li>
	<li>通过在胰胶大豆琼脂上电镀1：10连续稀释细菌，确认蛋白石S.金黄色葡萄球菌的浓度。 注：由于此测定中使用的细菌浓度差异会对随后的PMN血浆膜渗透性产生重大影响（图3A），因此，每个实验的菌株浓度确定，并且菌株之间具有等效性，这一点非常重要。</li>
	<li>从步骤 1.14 开始，在 96 孔板上的 PMN 中，将每个S. 铝菌株或 RPMI（用于正负控制）的 100 μL/孔轻轻添加。轻轻地摇动石板，在井中分配S. 金黄色葡萄球。</li>
	<li>在4°C15下，在500 μ g下离心板8分钟，同步方位细胞化。离心后在37°C下孵育板（T = 0）。</li>
	<li>在所需时间，从培养箱中取出板并放置在冰上。将 40 μL 的 0.5% Triton X-100 添加到正控制井中。</li>
	<li>轻轻地将样品上下移移到每个孔中，以完全拉出所有附着在板上的PMN，然后将样品转移到含有200 μL的冰冷DPBS的冰上，用1μL的碘化钠流动细胞学管。</li>
	<li>使用流式细胞测定法分析碘化钠染色的样品，如步骤 2.9 中所述。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., H&#246;&#246;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+invasion+and+evasion:+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus.">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li><li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses.">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+toxins.">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li><li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epic+Immune+Battles+of+History:+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus.">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li><li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytes.">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li><li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis.">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li><li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR/S+Dependent.">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+SaeR/S-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production.">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li><li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR/S-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus.">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li><li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence.">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).</li><li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocidins:+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors.">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li><li>B&#248;yum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils.">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

该协议描述了从人体血液中纯化PMN和两种截然不同的测定，使用碘化钠来量化S.aureus对这些重要的先天免疫细胞的细胞毒性。这些程序的成功将取决于纯化PMN的质量以及这种病原体产生的S.氨基和细胞外蛋白质的适当制备。为了分离PMN，重要的是在纯化期间和之后使用不含内毒素污染的试剂，温和地处理细胞制剂，并将细胞保持在适当的温度，从而尽量减少PMN的活化。指示PMN激活的符号包括细胞在纯化期间和超过5%的分离细胞染色阳性碘化钠时聚集。由于PMN的寿命相对较短，这些细胞必须从人体血液中分离出来，并在同一天进行测试。PMN在纯化后留在冰上超过3小时，将开始表现出自发凋亡的迹象。如前所述，使用向前和侧面散射的流式细胞测定分析以及碘化钠染色，确保分离细胞的纯度和完整性，对每种PMN制剂进行仔细评估是非常重要的。
S. aureus表达的双组分白细胞球菌负责使用本协议中所述的测定观察到的大多数受损的PMN血浆膜完整性。这些毒素和其他孔隙形成肽（如苯酚可溶性多聚素）在S.氨基苯株之间的表达变化，会产生细胞毒性对人体PMN的差异。 此外，在方细胞测定中，S.氨球与PMN的比例对随后的PMN血浆膜渗透性有重大影响（图3A），这些实验要求使用亚培养细菌的OD600在中指数生长阶段测试的每种A.aureus菌株的浓度一致。考虑到这些考虑，在开始细胞毒性测定之前，定义所有将检查的菌株的生长曲线是非常重要的。我们不推荐这些方法来分析在体外表现出显著生长差异的菌株的S.aureus细胞毒性。
USA300 是一种致命的MRSA分离物，已知对人类 PMN15具有高细胞毒性，该菌株中的 SaeR/S 的丢失大大减少了针对人类 PMN6、12的众多双组分白细胞素的转录，使这些菌株成为使用所述测定方法比较细胞毒性的理想模型。然而，不同的A.aureus分离物之间存在广泛的遗传变异，在测试其他Aureus菌株时，这些协议中详述的参数可能不会导致细胞毒性对人类PMN的实质性变化。定制生长条件，添加的超生物量，或细菌与PMN的比例可能需要使用这些方法使用其他菌株的S.aureus的成功。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

金黄色葡萄球菌是一种引起人类广泛疾病的革兰氏阳性细菌。这种突出的病原体产生许多毒性因素，导致感染的不同方面。这些包括表面分子，使S.aureus粘附到不同类型的宿主组织1，细胞外蛋白质干扰宿主免疫反应2，和一系列分泌的毒素，针对不同类型的宿主细胞3。在本报告中，我们描述了一种将Aureus产生的细胞外蛋白对人多态核白细胞（PMN或中性粒细胞）的细胞外毒性量化的方法，这种细胞毒性是宿主先天免疫反应的主要效应细胞。
PMN是哺乳动物中最丰富的白细胞。这些循环免疫细胞被迅速招募到宿主组织侮辱的部位，以回应宿主细胞或入侵微生物特有的化合物产生的危险信号。在外溢过程中，从这些分子和与活化的宿主细胞直接接触的细胞外输入增加了PMN的激活状态，这个过程称为启动4，5。到达不良组织的引性PMN然后执行重要的先天免疫反应，以防止感染的建立。这些包括结合和内化，或方位体化，入侵微生物，触发细胞内事件累积的微生物破坏由一组强效抗菌化合物5。
PMN在保护人类免受病原体入侵方面发挥着至关重要的作用，对于预防金黄色葡萄球菌感染尤为重要。然而，这种细菌产生广泛的毒性基因，阻碍不同的PMN功能。这些蛋白质包括细胞外蛋白质，阻止信号分子的识别，防止附着组织粘附，抑制抗菌化合物的产生，并损害血浆膜的完整性4。Aureus通过来自多个双组分感觉系统的集体输入来协调这些毒力基因的时间表达，这些系统能够识别特定的环境线索。SaeR/S双组分系统是感染6、7、8、9、10、11期间S.aureus毒力基因转录的主要上调节器。特别是，这种双组分系统已被证明对生产特别针对人类PMN12的双组分白细胞素至关重要。
该协议分为三个不同的部分。第一部分使用根据Böyum13和Nauseef14建立的方法改编的协议，使用密度梯度离心法从人类血液中纯化PMN。第二节和第三节详细介绍了两种不同的技术来检查S.aureus细胞毒性;一种用S.aureus产生的细胞外蛋白质使PMN中毒，而另一种则检查活细菌在噬菌体后损害PMN的能力。这些程序使用碘化钠测量由S.aureus孔隙形成毒素引起的PMN血浆膜完整性损失。碘化钠是一种DNA结合的荧光素，通常细胞膜不透水，但可以穿过被S.aureus毒素破坏的血浆膜。流式细胞学分析允许碘化阳性PMN的快速定量，以测量S.aureus菌株的相对细胞毒性。甲氧西林抗黄体素（MRSA）被确定为脉冲场凝胶电泳类型USA300和同源删除突变的saeR/S在该菌株（USA300+saeR/S）已被用作模型，以证明这些程序可以量化S.aureus对人体PMN的细胞毒性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

金黄色葡萄球菌能够分泌广泛的白细胞，靶向和破坏多态核白细胞（PMN或中性粒细胞）的膜完整性。该协议描述了人类PMN的纯化和对PMN的S.氨细胞毒性的定量。第 1 节详细介绍了使用密度离心从人血中分离 PMN 和血清。第2节测试由A.aureus产生的细胞外蛋白质对这些纯化的人类PMN的细胞毒性。 第3节测量活S.Aureus的噬菌体后对人体PMN的细胞毒性。这些程序使用用碘化钠（一种DNA结合的荧光素）处理的PMN的流式细胞测定分析，测量S.aureus白细胞素对PMN血浆膜完整性的破坏，这是一种细胞膜不渗透的DNA结合荧光素。总之，这些方法具有快速测试对原发性人PMN的A.氨细胞毒性的优点，并可以很容易地适应研究宿主-病原体相互作用的其他方面。

我们已经演示了如何使用上述程序来相对量化S.aureus对人体PMN的细胞毒性，使用MRSA PFGE型USA300和在先前研究6中生成的该菌株（USA300+saeR/S）中saeR/S的异源删除突变。使用本协议第1节所述程序分离的PMN被染色了碘化钠，并使用流式细胞学进行了检查。前部和侧散射图用于说明单核细胞或淋巴细胞对纯化PMN的污染（图1A，B），PMN完整性是使用碘化钠染色确定的（图1C）。所述的人类PMN纯化方法可以持续产生0.5 x 107至108 PMN，纯度>98%，碘化钠负。
USA300 和 USA300+saeR/S产生的细胞外蛋白的细胞毒性根据纯化 PMN（图 2）进行了测试，遵循本协议第 2 节所述的程序。这些实验表明，在用USA300产生的细胞外蛋白中毒30分钟后，纯化PMN的碘化染色的浓度依赖性增加（图2B）。先前的研究已经表明，SaeR/S双组分系统对于表达许多针对人类PMN6、10、11、16的双组分白细胞素非常重要。与之前的这些发现一致，在接触USA300+saeR/S产生的细胞外蛋白（图2B）后，很少检测到碘化钠阳性PMN。进一步的实验表明，在USA300细胞外蛋白中毒后，被源化PMN的比例稳步上升，这些蛋白质在大约30分钟后趋于稳定（图2C）。在接触USA300+saeR/S产生的细胞外蛋白质后，在所有时间点上都注意到人类PMN的最小解酶。这些结果说明了这种测定对细胞外S.aureus蛋白对人体PMN的细胞毒性的相对定量的效用。
我们测试了USA300和USA300+saeR/S，使用S.aureus细胞毒性测定法，对本议定书第3节（图3）中描述的人类PMN进行检测。在USA300的吞噬后90分钟观察到碘化钠阳性PMN比例的浓度依赖性增加（图3A）。在USA300+saeR/S（图3A）之后，碘化钠阳性的PMN比例显著下降，支持了其他结果表明SaeR/S双组分系统对S.aureus对人体PMN的细胞毒性（图2）7、11）的重要性。如前文所述，如图3A所示，在噬菌体后，金黄色浓度的差异对PMN莱沙有显著影响。对上述每个实验中使用的USA300和USA300_saeR/S接种液的列举表明，这些菌株之间的细胞毒性对比不是由于所用细菌浓度的差异（图3B）。这些发现表明，在噬菌体后，对人体PMN的S.氨细胞毒性测定可用于评估不同Aureus菌株损害人类PMN血浆膜完整性的能力。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> 图1：纯化PMN的流式细胞测定分析。代表性流细胞学点图的纯化的人类PMN和（B） PMN被故意污染的外周血单核细胞.（C） 代表性流式细胞直方图，显示碘化钠染色量最小（<1%）纯化PMN（阴影灰色）与用0.05%Triton X-100（阴影红色）处理的PMN相比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> 图2：用S.aureus产生的细胞外蛋白对PMN的流式细胞学分析。（A） 在培养30分钟后，用介质控制（阴影蓝色），过滤的USA300上清液，最终浓度为1：110（阴影灰色），或0.05%Triton X-100（阴影红色），代表流量细胞学直方图。（B） 不同浓度为USA300或USA300+saeR/S超生剂孵育30分钟后碘化钠阳性PMN的比例。（C） 与 USA300 或 USA300°saeR/S上清液孵育后，碘化钠阳性 PMN 的比例，最终浓度为 1：110。数据以平均值 = SEM 形式呈现，至少 3 个单独的实验，由 ± p = 0.05 和 ± p = 0.005，由双尾 t 检验确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> 图3：在S.金尿毒症的噬菌体后PMN的流式细胞学分析。（A） 碘化钠阳性PMN的比例在US300或USA300或USA300®saeR/S. （B）用于小组A所示实验的实验的蛋白酶浓度后90分钟，以平均= SEM的形式呈现，由两尾t-测试确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

该协议描述了从全人类血液中纯化多态核白细胞的方法，以及两种独特的测定方法，用于量化金黄色葡萄球菌对这些重要的先天免疫细胞的细胞毒性。

量化金黄色葡萄球菌对人多态核白细胞的细胞毒性

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

金黄色葡萄球菌是一种克阳性细菌，产生多种促进发病机制的毒性因子。其中包括双组分白细胞毒素，这些毒素会破坏多态核白细胞的膜完整性，也称为PMN或中性粒细胞。此视频说明了 PMN 与人类全身血液的分离，以及两种独特的检测方法，用于量化这些重要的先天免疫细胞的 S.aureus 细胞毒性。这些测定都可以通过标准实验室设备完成，并且易于适应，以检查宿主病原体相互作用的其他方面。这些实验将使用从人类献血者那里抽出的全部血液，并需要得到适当的机构委员会或审查委员会的批准，并说明所有参与者都知情同意。这一程序的第一步是通过离心和密度梯度隔离嗜中性粒细胞。首先，携带50毫升3%dextran 0.9%氯化钠、35毫升0.9%氯化钠、20毫升1.8%氯化钠、每毫升1.077克12毫升溶液和20毫升水到室温。将25毫升新鲜提取的肝素全人类血液转移到两个锥形离心管中。将25毫升新鲜抽出的肝素全血与25毫升当量室温、3%dextran、0.9%氯化钠一对一的比例结合在一起。通过轻轻摇动每根 50 毫升锥形管混合，然后在室温下站立 30 分钟。在室温下孵育后，将出现两个单独的层。将每个 dextran 血液混合物的顶层转移到新的 50 毫升锥形管中。在室温下以 450 g 离心 10 分钟，低或无中断。小心吸吸两种超自然剂，在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃。轻轻地将每个细胞颗粒重新用两毫升0.9%氯化钠中重新暂停。将重新暂停的颗粒组合在单个 50 毫升圆锥体中，然后将剩余的 0.9% 氯化钠加入到 35 毫升的最终体积中。使用手移液器在细胞悬浮液下方小心地铺设 10 毫升 1.077 克 1.077 克的纤维溶液。在室温下旋转 450 g 30 分钟后，在低或无中断的情况下，轻轻吸吸上一提液，而不会干扰细胞颗粒，如前所述。将红血球在20毫升室温水中重新产生细胞颗粒，使红血球变小。通过摇动30秒轻轻混合。立即加入20毫升1.8%氯化钠，并在室温下以450克离心样品10分钟。如前所示，小心吸进上一液。轻轻将细胞颗粒重新暂停在两毫升室温 RPMI 中，并放在冰上。使用血速计计算细胞。用冰冷 RPMI 每毫升 10 至第 7 个细胞的浓度重新暂停纯化 PMN，并保持在冰上。将100微升纯化PMN与300微升的DPBS相结合，在两个复制流式细胞管中含有一微升碘化二甲二醇污渍。对于正对，将 40 微升 0.5% Triton X-100 溶液加入其中一个流式细胞仪管中，彻底混合。使用流式细胞仪测量正向散射、侧散射和碘化染色，以确定隔离 PMN 的纯度和完整性。只应使用超过98%纯正和95%以上二碘化物阴性PMN制剂。有关概述正常人血清分离的协议，请参阅全文。通过将用 DPBS 稀释的 20% 分离人类血清的 100 微升添加到用于此测定的单个孔中，为 PMN 细胞毒性测定准备一个 96 孔板。请务必包括至少一个只接收介质的负控制井和至少一个正控制井，该井将收到 0.05% Triton X. 孵化板在 37 摄氏度 30 分钟。孵育后，用100微升的冰冷DPBS洗两次编码井，将板放在冰上。从板井中去除任何残留的DPBS，并轻轻地将100微升的纯化人类PMN，每毫升10个细胞的10倍添加到每毫升第7个细胞到每个编码孔。允许镀微粒细胞在以下细胞毒性测定中使用前至少五分钟在冰上沉淀。本节介绍一种测定方法，该测定方法可量化金黄色葡萄球菌对人类PMN产生的细胞外蛋白质的细胞毒性。在实验前一天，在37摄氏度的震动培养箱中，在适当的介质中养殖S.aureus过夜。亚培养S.aureus通过执行1至100稀释过夜细菌培养与新鲜介质。在37摄氏度下孵育，并摇动，直到细菌达到早期静止生长阶段。经过5个小时的生长，将一毫升亚培养素S.aureus转移到1.5毫升微离心管中，并在室温下以5000克离心，5分钟。离心后，吸上一种。通过0.22微米注射器过滤器将吸气的过流液液进入新的1.5毫升微离心管中，并放在冰上。使用冰冷介质对超级钠进行连续稀释，用于培养金黄色葡萄球菌。如前所述，在冰上含有PMN的96孔板的单个孔中轻轻添加上超常样品或借来用于负和正对的介质。轻轻的岩石板，在井中分配超级钠，并在37摄氏度下孵育。在所需时间，从培养箱中取出板，放在冰上。在每个流动的细胞仪管中加入300微升含有一微升碘化物的冰冷DMBS。将样品转移到冰上流动的细胞仪管。对于正对照井，在转移到流式细胞仪管之前，在样品中加入20微升10%Triton X。使用流式细胞分析醉斑PMN的碘化污渍。本节介绍一种分析方法，该测定方法可量化人类 PMN 吞噬后 S.aureus 的细胞毒性。在进行此分析之前，必须确定由 600 纳米的光学密度和细菌浓度定义的生长曲线。开始一夜之间培养的S.aureus菌株和亚培养细菌，如前所述。一旦亚培养的金黄色葡萄球菌达到中指数生长，将一毫升培养细菌转移到1.5毫升微离心管，并在室温下以5000克离心5分钟。在不干扰颗粒的情况下吸气其上一提液，并在一毫升 DPBS 中重新暂停颗粒细菌，以吸气洗涤 S.aureus。旋转样品30秒。在室温下以5000克离心样品5分钟。要氧化金黄色葡萄球菌，首先将细菌颗粒重新在20%人血清的一毫升中重新暂停。然后在37摄氏度下孵育样品，搅拌15分钟。如前面所示，在离心后洗涤牛化金黄色葡萄球菌。稀释牛性金黄色葡萄球菌菌株到1倍10到第8个菌落形成单位，每毫升CU，与冰冷的RMHI。旋转样品30秒，放在冰上。通过电镀一至10系列细菌在阿加上，确认用于这些测定的金黄色葡萄球菌的浓度。从步骤 1.14 开始，在每口金黄色葡萄球菌菌株（或用于正负对控的 RPMI）的 96 井板中轻轻添加 100 微升。轻轻的岩石板，在井中分配金黄色葡萄球菌。在4摄氏度下，在500克的离心板中同步噬菌体，在4摄氏度下在37摄氏度下孵育板，即时间零。在所需的时间点，将板放在冰上，并添加200微升的冰冷DPBS，其中包含一个微升的碘化丙二，每个流动的细胞测量管，然后转移样品到相应的管。使用流量细胞学分析样品，如2.8和2.9所述。以金黄色葡萄球菌为目标的双组分白细胞毒素的转录要求SA或S2成分系统证明所述测定的效用，以量化金黄色葡萄球菌细胞毒性。这些实验是在临床上相关的金黄色葡萄球菌分离物中进行的，该分离物被确定为此菌株中SA或S的原生缺失突变物中的USUS300。左面板描述纯化的 PMN，右面板以有意污染的样品为例。使用本协议第一节所述程序隔离的PMN被染色为碘化丙胺，并使用流式细胞仪进行检测。前向和侧散射图用于检测纯化PMN在1A年和1B年被纯化PMN的污染。通过使用所述的人类PMN纯化方法，我们可以持续分离5倍10到7至10倍至8个PMN，这些PMN超过98%纯，超过95%的碘化阴性。对经过纯化的PMN进行细胞毒性测试，对美国300和阿赛R/S突变体产生的细胞外蛋白的细胞毒性进行了检测。这些实验表明，在用美国300生产的细胞外蛋白中毒30分钟后，纯化PMN的碘化染色浓度增加，但与阿赛R/S突变体无关。进一步的实验表明，美国300个细胞外蛋白中毒后，碘化丙胺阳性PMN的比例稳步上升，在大约30分钟后趋于稳定。在接触 AsaeR/S 突变体产生的细胞外蛋白质后，所有时间点都注意到人类 PMN 的碘化染色最小。最后，对同步吞噬后美国300和SaeR/S突变体对PMN的细胞毒性进行了测试，在美索细胞病后90分钟观察到碘化阳性PMN的浓度依赖性增加。在 AsaeR/S 突变体形成噬菌体后，PMN 的碘化阳性显著减少。在这些实验中都使用了美国300和SaeR/S突变 inculum 的枚举，表明这些菌株之间的细胞毒性对比并不是由于所用细菌浓度的差异。该协议描述了从人类血液中的PMN的纯化，用两种不同的技术来量化S.aureus对这些先天免疫细胞的细胞毒性。这些程序的成功将取决于纯化的PMN的质量以及金黄色葡萄球菌或超级钠的适当制备。请查阅全文，了解执行这些程序时要考虑的要点。USA300 是一种致命的 MRSA 分离物，AsaeR/S 的丧失显著减少了针对人类 PMN 的毒性因子的转录，使这些菌株成为使用所述分析比较细胞毒性的理想模型。使用其他金黄色葡萄球菌菌株时，可能需要定制生长条件、添加的超级盐剂数量或细菌与 PMN 的比率。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

滴流和旋转盘反应器使用金黄色葡萄球菌生物膜分析

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

科研

免疫与感染

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

皮下感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

耐甲氧西林实验性心内膜炎模型<em&gt;金黄色葡萄球菌</em&gt;（MRSA）的大鼠

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

金黄色葡萄球菌生长使用人血红蛋白作为铁源

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

??PCR?????????????????????MEC??????V<em&gt;???????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

相互作用的研究<em&gt;金黄色葡萄球菌</em与中性粒细胞通过流式细胞仪和时间推移显微镜

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

生物能量和氧化突发：协议用于人类白细胞和血小板的隔离与评价

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

从人类母胎界面分离白细胞

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

针对相关生物膜<em&gt;金黄色葡萄球菌</em&gt;使用基于刃天青药物敏感性测定

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

基因分型<em&gt;金黄色葡萄球菌</em&gt;由核糖体垫片的PCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...