Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den amerikanske National Institutes of Health tilskud NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 samt midler fra Montana State University Agriculture eksperiment Station, og et udstyr tilskud fra Murdock velgørende Trust .

Heparinized venøs blod fra raske donorer blev indsamlet i overensstemmelse med protokollen godkendt af den institutionelle revision bestyrelsen for human Subjects på Montana State University. Alle donorer gav skriftligt samtykke til at deltage i denne undersøgelse.
1. rensning af humane polymorphonukleare leukocytter og isolering af humant serum
Bemærk: alle reagenser bør rutinemæssigt kontrolleres for tilstedeværelsen af endotoksin ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt endotoksin detektionssæt og bør indeholde < 25,0 pg/ml endotoksin for at forhindre uønsket priming af PMNs.
<ol><li>Medbring 50 mL 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 mL af 0,9% NaCl (w/v), 20 mL 1,8% NaCl (w/v), 12 mL 1,077 g/mL densitet gradient opløsning og 20 mL injektion-eller vandings kvalitet vand til stuetemperatur.</li>
	<li>For at isolere humant serum inkubateres 4 mL frisk trukket humant blod uden antikoagulerende middel ved 37 °C i et 15 mL glasrør i 30 min. Efter inkubation udtages centrifuge prøven i 2000 – 3000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Det øvre serum lag overføres til et frisk 15 mL konisk centrifugeglas og placeres på is.</li>
	<li>Der kombineres 25 mL frisk trukket hepariniseret (1000 enheder/mL) hele humant blod med 25 mL rumtemperatur 3% dextran-0,9% NaCl (1:1 ratio) i to replikate 50 mL koniske centrifugeglas (50 mL total volumen pr. tube). Bland med forsigtigt at Rocking hvert 50 mL konisk rør, og lad derefter stå ved stuetemperatur i 30 minutter.</li>
	<li>Efter inkubation ved stuetemperatur vises to separate lag. Det øverste lag af hver dextran-blod blanding overføres til nye 50 mL koniske rør og centrifugeres ved 450 x g i 10 minutter ved stuetemperatur med lave eller ingen bremser.</li>
	<li>Aspirér forsigtigt både supernatanter og kassér uden at forstyrre celle pillerne. Forsigtigt resuspension hver celle pellet i 2 mL stuetemperatur 0,9% NaCl, kombinere de opslæmmede pellets i en enkelt 50 mL konisk rør, derefter tilsættes de resterende 0,9% NaCl (endelige volumen af 35 mL).</li>
	<li>Underlæg forsigtigt 10 mL rumtemperatur på 1,077 g/mL tætheds forløbs opløsning under cellesuspensionen ved hjælp af en hånd pipette. Spin ved 450 x g i 30 minutter ved stuetemperatur med lave eller ingen bremser. Aspirér forsigtigt supernatanten uden at forstyrre celle pellet. Supernatant vil indeholde mononukleære celler i perifert blod, som kan indsamles som tidligere beskrevet14.</li>
	<li>Røde blodlegemer ved at resuspendere celle pellet i 20 mL rumtemperatur vand. Bland forsigtigt ved at Rocking røret i 30 s. Lyse af røde blodlegemer vil blive ledsaget af et markant fald i turbiditet.</li>
	<li>Tilsæt straks 20 mL 1,8% NaCl (ved stuetemperatur [RT]) og centrifuge prøve ved 450 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Bemærk: det er vigtigt at minimere den tid, som PMNs efterlades i vand alene ved at følge røde blodlegemer for at maksimere PMN-udbyttet og forhindre PMN-lysis og/eller aktivering.</li>
	<li>Forsigtigt aspirere supernatanten uden at forstyrre celle pellet. Resuspendér forsigtigt celle pellet i 2 mL RT RPMI 1640 medium og Placer på is.</li>
	<li>Tæl celler ved hjælp af en hemocytometer. Opstop rensede Pmn'er i en koncentration på 1 x 107 celler/ml med ISKOLD rpmi og hold på is.</li>
	<li>Der kombineres 100 μL rensede Pmn'er (1 x 106 celler) med 300 μl iskold dulbecco's fosfat-bufferet saltvand (dpbs) indeholdende 1 μl propidium iodidpletter i to replikat-flowcytometri-rør. For en positiv kontrol for plasma membran skader tilsættes 40 μL 0,5% Triton X-100 opløsning til et af strømnings cytometri rørene og blandes grundigt.</li>
	<li>Brug flowcytometri til at måle fremad scatter, side scatter og propidium kaliumiodid farvning (excitation/emission Maxima ved 535/617 nm) af rensede celler (figur 1). Bemærk: Forward og side scatter analyse vil identificere uønskede populationer af lymfocytter og monocytter. Propidium kaliumiodid vil kun plette celler med en kompromitteret plasma membran og renset PMNs, der har udtalt populationer af propidium kaliumiodid positive celler bør ikke anvendes. Til disse undersøgelser blev der kun anvendt rensede Pmn'er, hvis de bestod > 98% af de rensede celler og < 5% farvede positive for propidium Iodid.</li>
	<li>Forbered en 96-brønd plade til PMN cytotoksicitet assays ved belægning individuelle brønde, der vil blive anvendt i denne analyse med 100 μL af 20% isoleret humant serum, der er blevet fortyndet med DPBS. Bemærk: plating PMNs direkte på plastik eller glas vil forårsage aktivering af cellerne. Sørg for at inkludere mindst én negativ kontrol godt, der kun vil modtage medier og mindst én positiv kontrol godt, der vil modtage 0,05% Triton X-100.</li>
	<li>Pladen inkubates ved 37 °C i 30 minutter. Efter inkubation vaskes de coatede brønde to gange med iskold DPBS for at fjerne eventuelle overskydende serum. Tryk forsigtigt pladen på hovedet for at fjerne eventuelle resterende DPBS og anbringe på is.</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt 100 μL renset humant PMNs ved 1 x 107 celler/ml til hver belagt brønd (1 x 106 PMNs/brønd). Gør det muligt for Pmn'er at bosætte sig i brønde ved at inkube pladen på is i mindst 5 minutter. hold plade niveauet for at tillade jævn fordeling af celler i hver brønd og lad på is for at undgå uønsket aktivering af PMNs.</li>
</ol>2. cytotoksicitet assay af S. aureus ekstracellulære proteiner mod humane polymorphonukleære leukocytter
<ol><li>Kultur S. aureus natten over i trypticase soja bouillon (TSB) ved hjælp af en ryste inkubator sat til 37 °c. Til disse undersøgelser blev 20 mL TSB i separate 150 mL Erlenmeyer-kolber inokuleret med frosne kulturer af S. aureus -stammer USA300 eller USA300Δsaer/s og dyrket i ca. 14 timer med omrystning ved 250 rpm.</li>
	<li>Subculture S. aureus ved at udføre en 1:100 fortynding af overnight bakteriel kultur med friske medier. Inkuber ved 37 °C med rystelser, indtil bakterierne når tidlig stationær vækstfase. Bemærk: til disse forsøg blev 20 mL trypticase soja bouillon i 150 mL Erlenmeyer-kolber inokuleret med 200 μL overnight USA300 eller USA300Δsaer/S og inkuberet ved 37 °c med omrystning ved 250 rpm i 5 timer.</li>
	<li>Når bakterier har nået en tidlig stationær vækstfase, overføres 1 mL under kulet S. aureus til et 1,5 ml mikrocentrifuge glas og centrifugeres ved 5.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Efter centrifugering overføres supernatanten til en 3 mL sprøjte. Passere supernatanter gennem et 0,22 μm filter og ind i et nyt 1,5 ml mikrocentrifuge glas på is.</li>
	<li>Udfør serielle fortyndinger af supernatanter med iskold medier, der anvendes til kultur S. aureus. Bemærk: for de viste eksperimenter gennemgik supernatanter fra USA300 og USA300Δsaer/S fire på hinanden følgende 1/2 log fortyndinger med iskold TSB.</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt supernatanten prøver eller medier alene (for negative og positive kontroller) til individuelle brønde af 96-brønd plade indeholdende PMNs på is fra trin 1,15. Til disse eksperimenter blev der føjet 10 μL USA300 eller USA300Δsaer/S supernatanten prøver til hver brønd. Forsigtigt klippe pladen for at distribuere supernatanter i brønde og inkubere ved 37 °C.</li>
	<li>På de ønskede tidspunkter, fjerne pladen fra inkubator og sted på isen. Tilsæt 40 μL 0,5% Triton X-100 til den positive kontrol brønd.</li>
	<li>Afpipettér forsigtigt prøverne op og ned i hver brønd for helt at trække alle Pmn'er, der er klæbet til pladen, ud, og overfør derefter prøverne til strømnings cytometri-rør på is, som indeholder 300 μL iskold DPBS med 1 μL propidium Iodid.</li>
	<li>Måle andelen af propidium iodide-positive Pmn'er ved hjælp af flowcytometri (figur 2A). Ved bundet til DNA, propidium kaliumiodid har excitation/emission ved 535/617 nm.</li>
</ol>3. S. aureus cytotoksicitet assay mod humane polymorphonukleare leukocytter efter fagocytose
Bemærk: vækstkurver defineret ved den optiske tæthed ved 600 nm (OD600) og koncentrationen af bakterier skal bestemmes empirisk for S. aureus -stammerne, der skal testes, før denne analyse påbegyndes. Succesen af disse eksperimenter kræver en konsekvent høst af lige store koncentrationer af hver S. aureus stamme testet i midten eksponentiel vækstfase ved hjælp af OD600 af sub-dyrkede bakterier.
<ol><li>Start overnight kulturer af S. aureus stammer og subkultur bakterier som beskrevet i trin 2.1.1 og 2.1.2.</li>
	<li>Høst opdyrket S. aureus , når den har nået en mid-eksponentiel vækst ved at overføre 1 ml dyrkede bakterier til et 1,5 ml mikrocentrifuge glas og centrifugeres ved 5.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Bemærk: under vores vækstbetingelser nåede USA300 og USA300Δsaer/S mellem eksponentiel vækstfase efter ca. 135 min. inkubation6.</li>
	<li>Vask S. aureus efter centrifugering ved at aspirere supernatanten, og resuspension de pelleterede bakterier i 1 ml dpbs, vortexning prøven for 30 S, og centrifuger ved 5.000 × g i 5 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Opsonize S. aureus ved at suspendere den bakterielle pellet i 1 ml 20% humant serum fortyndet med dpbs og inkuber ved 37 °c med agitation i 15 min.</li>
	<li>Centrifuge opsoniseres bakterier ved 5.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask S. aureus efter centrifugering ved at aspirere supernatanten, opblanding af de pelleterede bakterier i 1 ml dpbs, og vortex derefter prøven, indtil den bakterielle pellet er helt brudt fra hinanden plus yderligere 30 sekunder. Centrifuger bakterier ved 5.000 × g i 5 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Resuspension opsoniseres S. aureus stammer i 1 ml rpmi, vortex prøven, indtil bakteriel pellet er helt brudt fra hinanden, og derefter for en yderligere 30 S. Placer bakterier på is.</li>
	<li>Fortyndet opsoniseres S. aureus stammer til den ønskede koncentration med iskold rpmi. Vortex for 30 s og sted på is.</li>
	<li>Bekræft koncentrationen af opsoniseres S. aureus ved plating 1:10 serielle fortyndinger af bakterier på trypticase soja agar. Bemærk: da forskelle i koncentrationen af bakterier, der anvendes i denne analyse, kan have stor indflydelse på efterfølgende PMN-plasma membran permeabilitet (figur 3a), er det meget vigtigt, at koncentrationen af hver stamme, der testes, bestemmes for hvert eksperiment og er ækvivalent mellem stammer.</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt 100 μL/brønd af hver S. aureus stamme eller rpmi (for positive og negative kontroller) til PMNs i 96-brønd pladen på is fra trin 1,14. Forsigtigt klippe pladen til at distribuere S. aureus i brønde.</li>
	<li>Du synkroniserer fagocytose ved at centrifuger pladen ved 500 × g i 8 minutter ved 4 °c15. Inkuber pladen ved 37 °C umiddelbart efter centrifugering (T = 0).</li>
	<li>På de ønskede tidspunkter, fjerne pladen fra inkubator og sted på isen. Tilsæt 40 μL 0,5% Triton X-100 til den positive kontrol brønd.</li>
	<li>Afpipettér forsigtigt prøverne op og ned i hver brønd for helt at trække alle Pmn'er, der er klæbet fast på pladen, ud, og overfør derefter prøverne til flowcytometri-rør på is med 200 μL iskold DPBS med 1 μL propidium Iodid.</li>
	<li>Analyser prøver for propidium-kaliumiodid-farvning ved hjælp af flowcytometri som beskrevet i trin 2,9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., H&#246;&#246;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+invasion+and+evasion:+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus.">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li><li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses.">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+toxins.">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li><li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epic+Immune+Battles+of+History:+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus.">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li><li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytes.">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li><li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis.">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li><li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR/S+Dependent.">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+SaeR/S-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production.">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li><li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR/S-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus.">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li><li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence.">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).</li><li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocidins:+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors.">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li><li>B&#248;yum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils.">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne protokol beskriver rensningen af Pmn'er fra humant blod og to særskilte analyser, der anvender propidium Iodid til kvantificering af S. aureus cytotoksicitet mod disse vigtige medfødte immunceller. Succesen med disse procedurer vil afhænge af kvaliteten af rensede Pmn'er og den passende forberedelse af S. aureus og ekstracellulære proteiner, der produceres af dette patogen. Til isolering af PMNs er det vigtigt at minimere PMN-aktivering under og efter rensning ved hjælp af reagenser, der er fri for endotoksin kontaminering, behandling af celle præparater forsigtigt og opbevaring af celler ved den rette temperatur. Tegn, der indikerer aktivering af PMNs omfatter sammenklumpning af celler under rensning og når mere end 5% af isolerede celler pletter positiv for propidium iodide. På grund af PMNs relativt korte levetid skal disse celler isoleres fra humant blod og testes samme dag. PMNs vil begynde at udvise tegn på spontan apoptose hvis venstre på is i mere end 3 h efter rensning. Som tidligere nævnt er det meget vigtigt, at hvert PMN-præparat evalueres omhyggeligt ved hjælp af flow cytometri-analyse af frem-og side spredning samt propidium-kaliumiodid-farvning for at sikre de isolerede celleres renhed og integritet.
Ekspression af bikomponent leukocidiner af S. aureus er ansvarlig for størstedelen af kompromitteret PMN-plasma membran integritet, som observeres ved hjælp af de analyser, der er beskrevet i denne protokol. Variation i ekspression af disse toksiner og andre pore dannende peptider, såsom phenol-opløselige modulins, mellem stammer af S. aureus vil producere forskelle i cytotoksicitet mod humane PMNs. signifikante afvigelser under in vitro vækst mellem s. aureus stammer vil også påvirke ekspression af pore dannende toksiner og efterfølgende cytotoksicitet. Desuden har forholdet mellem S. aureus og PMNs i fagocytose analyser en stor indvirkning på den efterfølgende PMN-plasma membran permeabilitet (figur 3a), og disse eksperimenter kræver en konsekvent høst af lige store koncentrationer af hver S. aureus -stamme, der testes i midten af eksponentiel vækstfase ved hjælp af OD600 af under dyrkede bakterier. I betragtning af disse overvejelser, er det meget vigtigt at definere vækstkurver for alle stammer, der vil blive undersøgt før påbegyndelse cytotoksicitet assays. Vi anbefaler ikke disse metoder til at analysere S. aureus cytotoksicitet med stammer, der udviser betydelige vækstforskelle in vitro.
USA300 er en virulente MRSA isolat, der er kendt for at være meget cytotoksisk mod humane PMNs15 og tabet af saer/S i denne stamme dramatisk reducerer transkriptionen af talrige bi-komponent leukocidiner, der er målrettet humane PMNs6,12, hvilket gør disse stammer ideelle modeller for at sammenligne cytotoksicitet ved hjælp af de beskrevne analyser. Der er imidlertid omfattende genetisk variation mellem forskellige s. aureus -isolater, og parametrene i disse protokoller må ikke resultere i væsentlige ændringer i cytotoksicitet mod humane pmn'er ved afprøvning af andre s. aureus -stammer. Skræddersy vækstbetingelser, mængder af supernatanter tilsat, eller forholdet mellem bakterier til PMNs kan være nødvendig for succes med disse metoder ved hjælp af andre stammer af S. aureus.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus er en gram positiv bakterie, der forårsager et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker. Denne fremtrædende patogen producerer talrige virulensfaktorer, der bidrager til forskellige aspekter af infektion. Disse omfatter overflade molekyler, der tillader S. aureus at overholde forskellige typer af Host tissue1, ekstracellulære proteiner, der forstyrrer værten immunrespons2, og en vifte af udskilt toksiner, der er målrettet forskellige typer af værtsceller3. I denne rapport beskriver vi en metode, der kvantificerer cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af S. aureus mod humane polymorphonukleære leukocytter (PMNs eller neutrofiler), primære Effector celler i værts medfødte immunrespons.
PMNs er de mest rigelige leukocytter i pattedyr. Disse cirkulerende immunceller er hurtigt rekrutteret til stedet for vært væv fornærmelse som reaktion på faresignaler produceret af residente celler eller af forbindelser, der er unikke til at invadere mikrober. Det ekstracellulære input fra disse molekyler og fra direkte kontakt med aktiverede residente værtsceller under ekstravasation øger PMNs aktiveringstilstand i en proces, der kaldes priming4,5. Primede PMNs, der har nået nødlidende væv derefter udføre vigtige medfødte immunrespons designet til at forhindre etablering af infektion. Disse omfatter binding og internalisering, eller fagocytose, af invaderende mikroorganismer, der udløser en kaskade af intracellulære hændelser kumulering i mikrobe ødelæggelse af et batteri af potente antimikrobielle forbindelser5.
PMNs spiller en vigtig rolle for at beskytte mennesker mod at invadere patogener og er særligt vigtige for forebyggelse af S. aureus -infektion4. Men denne bakterie producerer en bred vifte af virulens gener, der hæmmer forskellige PMN funktioner. Disse omfatter ekstracellulære proteiner, der blokerer genkendelse af signalering molekyler, forhindre vedhæftning til vært væv, hæmme produktionen af antimikrobielle forbindelser, og kompromittere plasma membran integritet4. S. aureus orkestreer det tidsmæssige udtryk for disse virulens gener gennem den kollektive input fra flere to-komponent sensoriske systemer, der genkender specifikke miljømæssige signaler. Saer/S to-komponentsystem er en større op-regulator af S. aureus virulens gen transskription under infektion6,7,8,9,10,11. Dette system med to komponenter har især vist sig at være afgørende for produktionen af bikomponent-leukocidiner, der specifikt er rettet mod humane Pmn'er12.
Denne protokol er opdelt i tre forskellige sektioner. Det første afsnit beskriver rensning af PMNs fra humant blod ved hjælp af tæthed gradient centrifugering ved hjælp af en protokol, der er blevet tilpasset fra metoder, der er fastsat af Bøyum13 og Nauseef14. Det andet og tredje afsnit detaljeret to forskellige teknikker til at undersøge S. aureus cytotoksicitet; en beruset PMNs med ekstracellulære proteiner produceret af S. aureus mens den anden undersøger muligheden for levende bakterier til at beskadige PMNs efter fagocytose. Disse procedurer bruger propidium kaliumiodid til at måle tabet af PMN-plasma membran integritet forårsaget af S. aureus pore dannende toksiner. Propidium kaliumiodid er en DNA-bindende fluoroforet, der normalt er celle membran uigennemtrængelig, men kan krydse plasma membraner, der er blevet forstyrret af S. aureus toksiner. Flow cytometri analyse giver mulighed for hurtig kvantificering af propidium iodide-positive Pmn'er til måling af den relative cytotoksicitet af S. aureus stammer. Methicillin-resistent S. aureus (MRSA) identificeret som pulsed-felt gel elektroforese type USA300 og en isogene sletnings mutant af saer/s i denne stamme (USA300Δsaer/s) er blevet anvendt som modeller til at påvise, hvordan disse procedurer kan kvantificere cytotoksicitet af S. aureus mod humane pmn'er.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

Staphylococcus aureus er i stand til at udskiller en bred vifte af leukocidiner, der er målrettet og forstyrrer membranens integritet af polymorphonukleare leukocytter (PMNs eller neutrofiler). Denne protokol beskriver både rensning af humane Pmn'er og kvantificering af S. aureus cytotoksicitet mod PMNs i tre forskellige sektioner. Afsnit 1 beskriver isoleringen af PMNs og serum fra humant blod ved hjælp af tæthed centrifugering. Afsnit 2 tester cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af S. aureus mod disse rensede humane Pmn'er. punkt 3 måler cytotoksiciteten mod humane pmn'er efter fagocytose i live S. aureus. Disse procedurer måler afbrydelse af PMN-plasma membranens integritet med S. aureus leukocidiner ved hjælp af flow cytometri-analyse af pmn'er, der er behandlet med propidium iodide, en DNA-bindende fluoroforet, som er cellemembranen uigennemtrængelig. Kollektivt, disse metoder har den fordel, at hurtigt at teste S. aureus cytotoksicitet mod primære humane PMNs og kan let tilpasses til at studere andre aspekter af vært-patogen interaktioner.

Vi har påvist, hvordan de ovenfor beskrevne procedurer kan anvendes til relativt kvantificering af S. aureus cytotoksicitet mod humane pmn'er ved hjælp af MRSA PFGE-type USA300 og en ISOGEN sletnings mutant af saer/s i denne stamme (USA300Δsaer/s), der genereres i tidligere undersøgelser6. PMNs isoleret ved anvendelse af de procedurer, der er beskrevet i afsnit 1 i denne protokol, blev plettet med propidium kaliumiodid og undersøgt ved hjælp af flowcytometri. Der blev anvendt frem-og side punkt parceller til at illustrere kontaminering af rensede pmn'er ved hjælp af monocytter eller lymfocytter (figur 1A, B),og PMN-integriteten blev bestemt ved anvendelse af propidium kaliumiodid-farvning (figur 1C). Den beskrevne metode til menneskelig PMN rensning kan konsekvent give 0,5 x 107 til 1 x 108 PMNs, der er > 98% ren og er > 95% propidium kaliumiodid negative.
Cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af USA300 og USA300Δsaer/S blev testet mod renset PMNs (figur 2) efter de procedurer, der er beskrevet i afsnit 2 i denne protokol. Disse eksperimenter viser en koncentration afhængig stigning i propidium kaliumiodid farvning af rensede PMNs efter 30 min forgiftning med ekstracellulære proteiner produceret af USA300 (figur 2B). Tidligere undersøgelser har vist, at saer/S to-komponentsystem er vigtigt for ekspression af talrige bi-komponent leukocidiner, der er målrettet humane PMNs6,10,11,16. Kongruent med disse tidligere fund blev der påvist meget få propidium-positive Pmn'er efter eksponering for ekstracellulære proteiner fremstillet af USA300Δsaer/S (figur 2B). Yderligere forsøg viste en støt stigning i andelen af lyserede Pmn'er efter forgiftning med USA300 ekstracellulære proteiner, der plateauede efter ca. 30 min. (figur 2C). Minimal lyse af humane Pmn'er blev noteret på alle tidspunkter efter eksponering for ekstracellulære proteiner produceret af USA300Δsaer/S. Disse resultater illustrerer nytten af denne analyse for den relative kvantificering af cytotoksicitet ved ekstrellulære S. aureus proteiner mod humane PMNs.
Vi testede USA300 og USA300Δsaer/s ved hjælp af s. aureus cytotoksicitets analyse mod humane pmn'er efter fagocytose, som er beskrevet i afsnit 3 i denne protokol (figur 3). En koncentrationsafhængig stigning i andelen af propidium Iodid positive Pmn'er blev observeret 90 min efter fagocytose af USA300 (figur 3A). En signifikant nedgang blev observeret i andelen af pmn'er, der var propidium kaliumiodid positive efter fagocytose af USA300Δsaer/S (figur 3A), understøttende andre resultater, der indikerer saer/s to-komponentsystem er vigtigt for cytotoksicitet af s. aureus mod humane PMNs (figur 2)7,11. Som tidligere nævnt og påvist i figur 3Ahar forskelle i koncentrationen af S. aureus en udtalt virkning på PMN-lysis efter fagocytose. Opregning af USA300 og USA300Δsaer/S inokulum anvendt i hvert af disse forsøg viste, at kontrasten i cytotoksicitet mellem disse stammer ikke skyldtes forskelle i koncentrationen af de anvendte bakterier (figur 3B). Disse fund viser, hvordan s. aureus cytotoksicitet analyse mod humane pmn'er efter fagocytose kan anvendes til at vurdere de forskellige s. aureus -stammers evne til at kompromittere den humane PMN-plasma membran integritet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> Figur 1: flowcytometri-analyse af rensede Pmn'er. Repræsentative flow flowcytometri dot parceller af (A) renset humane PMNs og (B) PMNs, der er blevet bevidst forurenet med perifert blod mononukleære celler. C) repræsentativt flow cytometri-histogram, som påviser minimal propidium-iodiid-farvning (< 1%) af rensede Pmn'er (gråtonet) sammenlignet med PMNs behandlet med 0,05% Triton X-100 (nedtonet rødt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> Figur 2: flow cytometri analyse af Pmn'er beruset med ekstracellulære proteiner produceret af S. aureus. A) repræsentativt flow-cytometri-histogram af pmn'er, der er plettet med propidium Iodid efter 30 min. inkubation med mediekontrol (skygget blå), filtreret USA300 supernatanten ved en endelig koncentration på 1:110 (gråtonet) eller 0,05% Triton X-100 (nedtonet rødt). B) andelen af propidium iodiid-positive pmn'er efter 30 min. inkubation med forskellige koncentrationer af USA300 eller USA300 ∆saer/S supernatants. C) andelen af propidium iodiid-positive pmn'er over tid efter inkubation med USA300 eller USA300 ∆saer/S supernatanten i en endelig koncentration på 1:110. Data præsenteres som middel ± SEM på mindst 3 separate eksperimenter med * p ≤ 0,05 og * * p ≤ 0,005 som bestemt ved tosidet t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> Figur 3: flowcytometri-analyse af Pmn'er efter fagocytose af S. aureus. A) andelen af propidium iodiid-positive pmn'er 90 min efter fagocytose af forskellige koncentrationer af USA300 eller USA300 ∆saer/S. B) koncentrationen af de opsonerede S. aureus -stammer, der anvendes til forsøgene vist i panel A. data præsenteres som gennemsnit ± SEM af 4 separate eksperimenter med * p ≤ 0,01 som bestemt ved tosidet t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Denne protokol beskriver en metode til rensning af polymorphonukleare leukocytter fra hele humant blod og to særskilte analyser, der kvantificerer cytotoksicitet af Staphylococcus aureus mod disse vigtige medfødte immunceller.

Kvantificering af staphyloccus aureus cytotoksicitet mod humane Polymorphonukleare leukocytter

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Staphylococcus aureus er en gram-positive bakterier, der producerer en bred vifte af virulens faktorer, der fremmer patogenese. Disse omfatter bi-komponent leukotoksiner, der forstyrrer membranen integritet polymorphonuclear leukocytter, også kaldet PMNs eller neutrofiler. Denne video illustrerer isolering af PMN'er fra humant fuldblod og to forskellige analyser for kvantificering af S.aureus cytotoksicitet mod disse vigtige medfødte immunceller.Disse analyser kan alle udføres med standard laboratorieudstyr og er let kan tilpasses til at undersøge andre aspekter af vært patogen interaktion. Disse forsøg vil bruge fuldblod fra menneskelige donorer og vil kræve godkendelse fra det relevante institutionelle udvalg eller revisionsudvalg samt en erklæring om, at informeret samtykke blev indhentet fra alle deltagere. Det første skridt i denne procedure er isolering af neutrofiler ved hjælp af centrifugering og tæthed gradienter.Først skal du medbringe 50 milliliter 3%dextran 0,9% natriumchlorid, 35 milliliter 0,9% natriumchlorid, 20 milliliter 1,8% natriumchlorid, 12 milliliter 1,077 gram pr. milliliter ficoll opløsning og 20 milliliter vand til stuetemperatur. Overfør 25 milliliter nytrukket hepariniseret fuldblod i to koniske centrifugerør. Kombiner 25 milliliter nytrukket hepariniseret fuldblod med 25 milliliter ækvivalent volumen af stuetemperatur, 3% dextran, 0,9% natriumchlorid i et en-til-en forhold.Bland ved forsigtigt rokkende hver 50 milliliter koniske rør og lad derefter stå ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter inkubation ved stuetemperatur vises to separate lag. Overfør det øverste lag af hver dextran blodblanding i nye 50 milliliter koniske rør.Centrifuge ved 450 g i 10 minutter ved stuetemperatur med lave eller ingen pauser. Inspirer forsigtigt både supernatanter og kassér uden at forstyrre cellepillerne. Resuspend hver cellepellet opvarmes forsigtigt i to milliliter 0,9% natriumchlorid.Kombiner de resuspenderede pellets i en enkelt, 50 milliliter konisk derefter tilføje de resterende 0,9% natriumchlorid til et endeligt volumen på 35 milliliter. Underlæg omhyggeligt 10 milliliter 1,077 gram pr. milliliter ficoll-opløsning under celleaffjedringen ved hjælp af en håndpipette. Efter spinding ved 450 g i 30 minutter ved stuetemperatur, med lav eller ingen pauser, let aspirere supernatant uden at forstyrre cellille, som tidligere vist.Lyse de røde blodlegemer ved at resuspending celle pellet i 20 milliliter stuetemperatur vand. Bland forsigtigt ved at rokke i 30 sekunder. Der tilsættes straks 20 milliliter 1,8 % natriumchlorid og centrifugeprøve ved 450 g i 10 minutter ved stuetemperatur.Inspirer forsigtigt supernatant som vist før. Forsigtigt resuspenderet celle pellet i to milliliter stuetemperatur RPMI og sted på is. Tæl celler ved hjælp af et hemacytometer.Resuspend renset PMN'er i en koncentration på en gange 10 til 7th celler per milliliter med iskold RPMI og holde på is. Kombiner 100 mikroliter af rensede PMN'er med 300 mikroliter DPBS, der indeholder en mikroliter propidiumdodidplet i to replikerede flowcytometrirør. For en positiv kontrol, tilsæt 40 mikroliter af 0,5% Triton X-100 opløsning i en af flow cytometri rør og bland grundigt.Brug flowcytometri til at måle den fremadrettede scatter, side scatter, og propidium iodid farvning til at bestemme renhed og integritet af isolerede PMN'er. Der bør kun anvendes PMN-præparater, der er over 98 % rene og over 95 %propidiumdodidæt. For protokollen, der skitserer isolering af normalt menneskeligt serum, henvises til det fulde manuskript.Forbered en 96-brønd plade til PMN cytotoksicitet assays ved at tilføje 100 mikroliter af 20% isolerede humant serum fortyndet med DPBS til individuelle brønde, der vil blive brugt i denne analyse. Sørg for at inkludere mindst én negativ kontrol brønd, der kun vil modtage medier og mindst én positiv kontrol godt, der vil modtage 0,05% Triton X.Inkubere pladen ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Efter inkubationen vaskes de kodede brønde to gange med 100 mikroliter iskold DPBS og læg pladen på is.Fjern eventuelle resterende DPBS fra pladebæde og tilsæt forsigtigt 100 mikroliter af rensede humane PMN'er på én gang 10 til 7. Tillad belagte neutrofiler at bosætte sig ved at efterlade dem på is i mindst fem minutter før brug i følgende cytotoksicitetsanalyser. Dette afsnit beskriver en analyse, der kvantificerer cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af staph aureus mod humane PMN'er.Kultur S.aureus natten over i passende medier ved hjælp af en rystende inkubator sat til 37 grader Celsius dagen før eksperimentet. Subkultur S.aureus ved at udføre en en til 100 fortynding af natten bakterier kulturer med friske medier. Inkubere ved 37 grader Celsius med rysten, indtil bakterierne når tidlig stationær vækstfase.Efter fem timers vækst overføres en milliliter subkultur S.aureus til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og centrifuge ved 5.000 g i fem minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering, aspirere supernatants. Pass indsugning supernatants gennem en 0,22 mikron sprøjte filter i en ny 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og sted på is.Udfør serielle fortyndinger af supernatanter med iskolde medier, der bruges til at dyrke Staph aureus. Tilsæt forsigtigt supernatantprøver eller medier udlånt til negative og positive kontroller til individuelle brønde af en 96-brøndplade, der indeholder PMN'er på is, som beskrevet tidligere. Forsigtigt rock plade til at distribuere supernatanter i brønde og inkubere ved 37 grader Celsius.På de ønskede tidspunkter skal du fjerne pladen fra inkubatoren og placere på is. Der tilsættes 300 mikroliter iskold DPBS, der indeholder en mikroliter propidiumdodid til hvert flowcytometrirør. Overfør prøverne for at flyde cytometrirør på is.For den positive kontrol godt, tilsæt 20 mikroliter af 10% Triton X til prøven før overførsel til et flow cytometri rør. Analysér propidiumidodidfaring af berusede PMN'er ved hjælp af flowcytometri. Dette afsnit beskriver en analyse, der kvantificerer cytotoksiciteten af S.aureus efter fagocytose af humane PMN'er.Vækstkurver defineret ved den optiske massen ved 600 nanometer og koncentrationen af bakterier skal bestemmes for de relevante Staph aureus stammer før brug i denne analyse. Start natten kulturer S.aureus stammer og subkultur bakterier, som beskrevet tidligere. Når subkultureret Staph aureus har nået midten af eksponentiel vækst, overføre en milliliter af kultur bakterier til 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og centrifuge ved 5, 000 g i fem minutter ved stuetemperatur.Vask S.aureus ved at aspirere sin supernatant uden at forstyrre pellet og resuspend de pelleterede bakterier på en milliliter DPBS. Vortex prøverne i 30 sekunder. Centrifuge prøverne ved 5,000 g i fem minutter ved stuetemperatur.For at oxenize Staph aureus, først resuspend den bakterielle pellet i en milliliter 20% humant serum. Derefter inkuberes prøver ved 37 grader Celsius med omrøring i 15 minutter. Vask oxenized Staph aureus efter centrifugering som vist tidligere.Fortyndet oxenized Staph aureus stammer til en gange 10 til 8th koloni-dannende enheder, CFUs per milliliter, med iskold RPMI. Vortex prøven i 30 sekunder og sted på is. Bekræft koncentrationerne af Staph aureus, der anvendes til disse analyser ved at grundfælde en til 10 serielle fortyndinger af bakterier på agar.Tilsæt forsigtigt 100 mikroliter pr. brønd af hver Staph aureus stamme, eller RPMI for positive og negative kontroller, til PMN'er i en 96-brønd plade på is fra trin 1.14. Forsigtigt rock plade til at distribuere Staph aureus i brønde. Synkroniser fagocytose ved centrifugering plade ved 500 g i otte minutter ved fire grader Celsius og inkuber plade ved 37 grader Celsius umiddelbart efter centrifugering som tid nul.På de ønskede tidspunkter, sætte pladen på is og tilsæt 200 mikroliter af iskold DPBS indeholder en microliter propidium iodid til hver flow cytometri rør derefter overføre prøver til deres tilsvarende rør. Analysér prøver til propidiumdodidfaring ved hjælp af flowcytometri som beskrevet i 2.8 og 2.9. Transskriptionen af tokomponent leukotoksiner, der er rettet mod humane PMN'er ved Staph aureus, kræver, at SA- eller S2-komponentsystemet demonstrerer nytten af de beskrevne analyser til kvantificering af Staph aureus-cytotoksicitet mod humane PMN'er.Disse forsøg blev udført med et klinisk relevant Staph aureus isolat identificeret som USA300 i en isologenisk sletning mutant af SA eller S i denne stamme. Det venstre panel viser rensede PMN'er, og højre panel skildrer bevidst forurenede prøver som et eksempel. PMN'er, der var isoleret ved hjælp af de procedurer, der er beskrevet i afsnit et i denne protokol, blev plettet med propidiumidodid og undersøgt ved hjælp af flowcytometri.Frem- og sidesprømmeområder blev anvendt til at påvise kontaminering af rensede PMN'er med monocytter eller lymfocytter i årevis 1A og 1B. PMN-integritet blev bestemt ved hjælp af propidiumdodidfaring. Ved at bruge den beskrevne metode til human PMN rensning, kan vi konsekvent isolere fem gange 10 til 7th til en gange 10 til 8th PMNs, der er over 98% ren og er over 95% propidium iodid negative.Cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af USA300 og AsaeR/S-mutanten blev testet mod rensede PMN'er. Disse forsøg viser en koncentrationsafhængig stigning i propidiumdodidfaringen af rensede PMN'er efter 30 minutters forgiftning med ekstracellulære proteiner produceret af USA300, men ikke med AsaeR/S-mutanten. Yderligere forsøg viste en støt stigning i andelen af propidium iodid positive PMNs efter forgiftning af USA300 ekstracellulære proteiner, plateaued efter ca 30 minutter.Minimal propidiumidodidfaring af humane PMN'er blev bemærket på alle tidspunkter efter eksponering for ekstracellulære proteiner produceret af AsaeR/S-mutanten. Sidst blev cytotoksiciteten af USA300 og AsaeR/S mutant mod PMN'er efter synkroniseret fagocytose testet, en koncentrationsafhængig stigning i andelen af propidiumidodid positive PMN'er blev observeret 90 minutter efter fagocytose af USA300. Betydeligt færre PMN'er var propidiumdodide positive efter asaeR/S-mutantens fagocytose.Optælling af USA300 og AsaeR/S mutant inoculum blev anvendt i hvert af disse forsøg, viste, at kontrasten i cytotoksicitet mellem disse stammer ikke skyldtes forskelle i koncentrationen af de anvendte bakterier. Denne protokol beskriver rensninger af PMN'er fra humant blod i to forskellige teknikker til kvantificering af cytotoksicitet af S.aureus mod disse medfødte immunceller. Disse procedurers succes vil afhænge af kvaliteten af de rensede PMN'er og den passende forberedelse af Staph aureusbakterier eller supernatanter.Se hele manuskriptet for vigtige punkter at overveje, mens du udfører disse procedurer. USA300 er en ondartet MRSA isolat og tabet af AsaeR / S dramatisk reducerer transskription af virulens faktorer, der er rettet mod menneskelige PMNs, hvilket gør disse stammer ideelle modeller til sammenligning cytotoksicitet ved hjælp af de beskrevne analyser. Skræddersy vækstbetingelser, mængder af supernatanter tilsat, eller forholdet mellem bakterier til PMNs kan være påkrævet, når du bruger andre stammer af Staph aureus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Eksperimentel Endocarditis Model af Methicillin Resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) i rotte

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Vækst med humant hæmoglobin som en jernkilde

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay til Typing af stafylokokker Cassette Kromosom Mec Typer I til V i Methicillin-resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studere Interaktioner af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik og oxidativ Burst: Protokoller til isolering og Evaluering af humane leukocytter og blodplader

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering af leukocytter fra Human Maternal-føtal grænseflade

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Målretning Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Brug Resazurin Baseret Drug-modtagelighed Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypebestemmelse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; ved Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...