Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse National Institutes of Health subsidies NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 evenals fondsen van de Montana State University Agriculture experiment station, en een uitrusting subsidie van Murdock liefdadigheid Trust .

Heparinized veneuze bloed van gezonde donoren werd verzameld in overeenstemming met het protocol goedgekeurd door de institutionele Review Board voor menselijke proefpersonen aan de Montana State University. Alle donoren hebben schriftelijke toestemming gegeven om deel te nemen aan deze studie.
1. zuivering van menselijke polymorfonucleaire leukocyten en isolatie van menselijk serum
Opmerking: alle reagentia moeten routinematig worden gecontroleerd op de aanwezigheid van endotoxine met behulp van een in de handel verkrijgbare endotoxine detectiekit en moeten < 25.0 PG/mL endotoxine bevatten om ongewenste priming van Pmn's te voorkomen.
<ol><li>Breng 50 mL van 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 mL 0,9% NaCl (w/v), 20 mL 1,8% NaCl (w/v), 12 mL van 1,077 g/mL dichtheidsgradiënt oplossing, en 20 mL water van injectie of irrigatie-niveau op kamertemperatuur.</li>
	<li>Om humaan serum te isoleren, incuberen 4 mL vers getrokken menselijk bloed zonder anti-coagulans bij 37 °C in een glazen buis van 15 mL gedurende 30 minuten. Na incubatie, centrifugeer monster bij 2000 – 3000 × g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Breng de bovenste serum laag over in een nieuwe conische centrifugebuis van 15 mL en plaats op ijs.</li>
	<li>Combineer 25 ml vers getekende gehepariniseerd (1000 eenheden/ml) volbloed met 25 ml kamertemperatuur 3% dextran-0,9% NaCl (1:1 ratio) in twee replicaatconische centrifugebuizen van 50 ml (50 ml totaal volume per buis). Meng door zachtjes elke 50 mL conische buis te rocken en laat dan 30 min op kamertemperatuur staan.</li>
	<li>Na incubatie bij kamertemperatuur worden twee afzonderlijke lagen weergegeven. Breng de bovenste laag van elk dextran-bloed mengsel over in nieuwe conische buisjes van 50 mL en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met lage of geen remmen bij 450 x g .</li>
	<li>Aspireren zowel supernatanten en gooi zonder verstoring van de celpellets. Zachtjes resuspendeer elke celpellet in 2 mL kamertemperatuur 0,9% NaCl, combineer de geresuspendeerde pellets in een enkele 50 mL conische buis, voeg vervolgens de resterende 0,9% NaCl (eindvolume van 35 mL).</li>
	<li>Onderleg voorzichtig 10 mL kamertemperatuur van 1,077 g/mL dichtheidsgradiënt oplossing onder de celsuspensie met behulp van een hand pipet. Spin bij 450 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met lage of geen remmen. Zuig de supernatant zachtjes op zonder de celpellet te storen. Supernatant zal perifere bloed mononucleaire cellen bevatten die kunnen worden verzameld zoals eerder beschreven14.</li>
	<li>Lyse de rode bloedcellen door het resuspenseren van de celpellet in 20 mL kamertemperatuur water. Meng zachtjes door de buis te schudden voor 30 sec. De lysis van rode bloedcellen zal gepaard gaan met een duidelijke afname van troebelheid.</li>
	<li>Voeg onmiddellijk 20 mL 1,8% NaCl (bij kamertemperatuur [RT]) en centrifuge monster bij 450 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: het is belangrijk om de tijd te minimaliseren dat PMNs alleen in water achterblijven na de rode bloedcel lysis om de PMN-opbrengst te maximaliseren en PMN-lysis en/of activering te voorkomen.</li>
	<li>Zuig de supernatant voorzichtig op zonder de celpellet te verstoren. Breng de celpellet voorzichtig over in 2 mL RT RPMI 1640 medium en plaats op ijs.</li>
	<li>Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Respendeer gezuiverde Pmn's met een concentratie van 1 x 107 cellen/ml met IJSKOUDE rpmi en blijf op ijs.</li>
	<li>Combineer 100 μL gezuiverde PMNs (1 x 106 cellen) met 300 μL ijskoude dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (dpbs) met 1 μL propidium jodide vlek in twee replicaatcytometrie buisjes. Voor een positieve controle op beschadiging van het plasma membraan, voeg 40 μL 0,5% Triton X-100 oplossing toe aan een van de flow cytometrie buizen en meng grondig.</li>
	<li>Gebruik stroom cytometrie voor het meten van de voorwaartse spreiding, Side Scatter en propidium jodide kleuring (excitatie/emissiemaxima bij 535/617 nm) van gezuiverde cellen (Figuur 1). Let op: forward en side Scatter analyse zal ongewenste populaties van lymfocyten en monocyten identificeren. Propidium jodide zal alleen cellen vlekken met een aangetast plasma membraan en gezuiverde pmns die populaties van propidium jodide positieve cellen hebben uitgesproken, mogen niet worden gebruikt. Voor deze studies werden gezuiverde PMNs alleen gebruikt als ze bestonden uit > 98% gezuiverde cellen en < 5% bevlekt positief voor propidium jodide.</li>
	<li>Bereid een 96-boorput voor PMN cytotoxiciteit-assays door individuele putjes te coaten die in deze test zullen worden gebruikt met 100 μL van 20% geïsoleerd humaan serum dat is verdund met DPBS. Opmerking: het bekleden van Pmn's direct op plastic of glas zal leiden tot activering van de cellen. Zorg ervoor dat u ten minste één negatieve controle goed die alleen media ontvangt en ten minste één positieve controle goed die zal ontvangen 0,05% Triton X-100.</li>
	<li>Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 30 minuten. Na incubatie, was de gecoate putjes tweemaal met ijskoude DPBS om overtollig serum te verwijderen. Tik zachtjes op de plaat ondersteboven om eventuele resterende DPB'S te verwijderen en op ijs te plaatsen.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 100 μL gezuiverde humane Pmn's toe bij 1 x 107 cellen/ml voor elk goed gecoat (1 x 106 pmns/well). Laat de PMNs zich in putten vestigen door de plaat op ijs gedurende ten minste 5 min te inbroed. Houd het niveau van de plaat zodat zelfs de verdeling van cellen in elk putje en laat op ijs om ongewenste activering van PMNs te voorkomen.</li>
</ol>2. cytotoxiciteits test van S. aureus extracellulaire eiwitten tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten
<ol><li>Culture S. aureus 's nachts in tryptische soja Bouillon (TSB) met behulp van een schudden incubator ingesteld op 37 ° c. Voor deze studies werden 20 mL TSB in afzonderlijke Erlenmeyerkolven van 150 mL geënt met bevroren culturen van s. aureus stammen USA300 of USA300ΔSaer/S en gekweekt voor ongeveer 14 uur met schudden bij 250 rpm.</li>
	<li>Subculture S. aureus door het uitvoeren van een 1:100 verdunning van nachtelijke bacteriële cultuur met verse media. Inbroed bij 37 °C met schudden totdat de bacteriën de vroege stationaire groeifase bereiken. Opmerking: voor deze experimenten werden 20 mL tryptische soja Bouillon in 150 mL erlenmeyer geënt met 200 μL 's nachts gekweekte USA300 of USA300ΔSaer/S en geïncubeerd bij 37 °c met schudden bij 250 rpm gedurende 5 uur.</li>
	<li>Wanneer bacteriën de vroege stationaire groeifase hebben bereikt, breng dan 1 mL van de ondergekweekte S. aureus over in een micro centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 5.000 × g .</li>
	<li>Na centrifugeren, breng supernatant over in een doseerspuit van 3 mL. Geef supernatanten door een 0,22 μm filter en in een nieuwe 1,5 ml microcentrifuge buis op ijs.</li>
	<li>Voer seriële verdunningen van supernatanten uit met ijskoude media die worden gebruikt om S. aureuste kweken. Opmerking: voor de getoonde experimenten, supernatanten van USA300 en USA300ΔSaer/S onderging vier opeenvolgende 1/2 log verdunningen met ijskoude TSB.</li>
	<li>Voeg voorzichtig supernatant monsters of media alleen (voor negatieve en positieve controles) toe aan afzonderlijke putjes van 96-boorput met Pmn's op ijs uit stap 1,15. Voor deze experimenten werden aan elk goed 10 μL van USA300 of USA300ΔSaer/S supernatant monsters toegevoegd. Zachtjes rotsplaat om supernatanten in Wells te verdelen en te inbroed bij 37 °c.</li>
	<li>Op de gewenste tijden, verwijder de plaat uit de incubator en plaats op ijs. Voeg 40 μL 0,5% Triton X-100 toe aan de positieve controle goed.</li>
	<li>Pipetteer de monsters voorzichtig op en neer in elke put om alle PMNs die aan de plaat zijn gehecht volledig uit te trekken en breng de monsters vervolgens over naar flow cytometrie buisjes op ijs met 300 μL ijskoude DPBS met 1 μL propidium jodide.</li>
	<li>Meet het aandeel propidium iodide-positieve Pmn's met behulp van Flowcytometrie (Figuur 2A). Bij gebonden aan DNA heeft propidium jodide excitatie/emissie bij 535/617 nm.</li>
</ol>3. S. aureus cytotoxiciteits test tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten na fagocytose
Opmerking: groeicurves gedefinieerd door de extinctie bij 600 nm (OD600) en de concentratie van bacteriën moeten empirisch worden bepaald voor de te onderzoeken S. aureus -stammen voordat deze test begint. Succes van deze experimenten vereist de consistente oogst van gelijke concentraties van elke S. aureus stam getest in de mid-exponentiële groeifase met behulp van de OD600 van subgekweekte bacteriën.
<ol><li>Start 's nachts culturen van S. aureus stammen en subcultuur bacteriën zoals beschreven in de stappen 2.1.1 en 2.1.2.</li>
	<li>Oogst ondergekweekte S. aureus wanneer het een mid-exponentiële groei heeft bereikt door 1 ml gekweekte bacteriën over te brengen naar een micro centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeren bij 5.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. NB: onder onze groeiomstandigheden bereikten USA300 en USA300ΔSaer/S een mid-exponentiële groeifase na ongeveer 135 minuten incubatie6.</li>
	<li>Was S. aureus na centrifugeren door het supernatant te opzuigen, de gepelleteerde bacteriën in 1 ml dpbs te resuspenderen, het monster gedurende 30 sec. te centrifugeren en bij kamertemperatuur op 5.000 × g gedurende 5 minuten te centrifuge teren.</li>
	<li>Opsonize S. aureus door het resuspeniseren van de bacteriële pellet in 1 ml 20% humaan serum verdund met dpbs en incuberen bij 37 ° c met opwinding gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer opsonized bacteriën bij 5.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was S. aureus na centrifugeren door het supernatant te zuigen, de gepelleteerde bacteriën opnieuw op te schorten in 1 ml dpbs, en vervolgens het monster te Vortex totdat de bacteriële pellet volledig gebroken is plus een extra 30 seconden. Centrifugeer bacteriën bij 5.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Respenderen opsonized S. aureus stammen in 1 ml rpmi, Vortex het monster totdat bacteriële pellet volledig uiteen is gebroken, en vervolgens voor een extra 30 S. plaats bacteriën op ijs.</li>
	<li>Verdun opsonized S. aureus stammen tot de gewenste concentratie met IJSKOUDE rpmi. Vortex voor 30 s en plaats op ijs.</li>
	<li>Bevestig de concentratie van opsonized S. aureus door plating 1:10 seriële verdunningen van bacteriën op tryptische soja agar. Opmerking: omdat de verschillen in de concentratie van bacteriën die in deze test worden gebruikt een grote invloed kunnen hebben op de daaropvolgende permeabiliteit van de PMN-plasma membraan (Figuur 3a), is het zeer belangrijk dat de concentratie van elke geteste stam wordt bepaald voor elk experiment en gelijkwaardig is aan de stammen.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 100 μL/goed van elke S. aureus stam of rpmi (voor positieve en negatieve controles) toe aan PMNs in de 96-put plaat op ijs uit stap 1,14. Zachtjes rotsplaat om S. aureus in Wells te verdelen.</li>
	<li>Synchroniseer fagocytose door de plaat te centrifugeren bij 500 × g gedurende 8 minuten bij 4 °c15. Incuberen van de plaat bij 37 °C onmiddellijk na het centrifugeren (T = 0).</li>
	<li>Op de gewenste tijden, verwijder de plaat van de incubator en plaats op ijs. Voeg 40 μL 0,5% Triton X-100 toe aan de positieve controle goed.</li>
	<li>Pipetteer de monsters voorzichtig op en neer in elke put om alle PMNs die aan de plaat zijn gehecht volledig uit te trekken en breng de monsters vervolgens over naar flow cytometrie buisjes op ijs met 200 μL ijskoude DPB'S met 1 μL propidium jodide.</li>
	<li>Analyseer monsters voor propidium jodide-kleuring met behulp van flow-cytometrie zoals beschreven in stap 2,9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., H&#246;&#246;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+invasion+and+evasion:+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus.">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li><li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses.">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+toxins.">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li><li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epic+Immune+Battles+of+History:+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus.">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li><li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytes.">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li><li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis.">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li><li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR/S+Dependent.">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+SaeR/S-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production.">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li><li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR/S-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus.">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li><li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence.">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).</li><li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocidins:+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors.">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li><li>B&#248;yum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils.">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft de zuivering van Pmn's uit menselijk bloed en twee verschillende assays die propidium jodide gebruiken voor het kwantificeren van de cytotoxiciteit van S. aureus tegen deze belangrijke aangeboren immuuncellen. Het succes van deze procedures zal afhangen van de kwaliteit van gezuiverde Pmn's en de juiste bereiding van S. aureus en extracellulaire eiwitten die door dit pathogeen worden geproduceerd. Voor de isolatie van Pmn's is het belangrijk om de PMN-activering tijdens en na de zuivering te minimaliseren door gebruik te maken van reagentia die vrij zijn van endotoxine verontreiniging, celpreparaten zachtjes te behandelen en cellen op de juiste temperatuur te houden. Verschijnselen die duiden op activering van pmn's zijn klonteren van cellen tijdens zuivering en wanneer meer dan 5% van de geïsoleerde cellen positief voor propidium jodide vlek. Vanwege de relatief korte levensduur van Pmn's, moeten deze cellen worden geïsoleerd van menselijk bloed en op dezelfde dag worden getest. PMNs zal beginnen te vertonen tekenen van spontane apoptosis indien achtergelaten op ijs voor meer dan 3 h na zuivering. Zoals eerder vermeld, is het zeer belangrijk dat elke PMN-bereiding zorgvuldig wordt geëvalueerd met behulp van Flowcytometrie analyse van voorwaartse en zijverstrooiing, evenals propidium jodide-kleuring om de zuiverheid en integriteit van geïsoleerde cellen te waarborgen.
De uitdrukking van bi-component leukocidinen door S. aureus is verantwoordelijk voor de meerderheid van de GECOMPROMITTEERDE PMN plasma membraan integriteit, die wordt waargenomen met behulp van de in dit protocol beschreven assays. Variatie in de expressie van deze toxines en andere Pore-vormende peptiden, zoals fenol-oplosbare modulinen, tussen stammen van S. aureus zal verschillen in cytotoxiciteit te produceren tegen menselijke PMNs. significante afwijkingen tijdens in vitro groei tussen S. aureus stammen zullen ook invloed hebben op de expressie van porie vormende toxines en daaropvolgende cytotoxiciteit. Daarnaast heeft de ratio van S. aureus naar PMNs in fagocytose assays een grote invloed op de daaropvolgende permeabiliteit van de PMN plasma membraan(figuur 3a) en deze experimenten vereisen de consistente oogst van gelijke concentraties van elke S. aureus stam getest in de mid-exponentiële groeifase met behulp van de OD600 van ondergekweekte bacteriën. Gezien deze overwegingen is het zeer belangrijk om groeicurves te definiëren voor alle stammen die zullen worden onderzocht voordat de cytotoxiciteits testen beginnen. We raden deze methoden voor het analyseren van S. aureus cytotoxiciteit met stammen die significante groeiverschillen in vitro vertonen niet aan.
USA300 is een virulente MRSA-isolaat waarvan bekend is dat het zeer cytotoxisch is tegen humane pmns15 en het verlies van Saer/S in deze stam vermindert de transcriptie van talrijke bi-component leukocidins die gericht zijn op humane pmns6,12, waardoor deze stammen ideale modellen zijn voor het vergelijken van cytotoxiciteit met behulp van de beschreven assays. Er is echter uitgebreide genetische variatie tussen verschillende s. aureus isolaten en de parameters die in deze protocollen worden beschreven, mogen niet resulteren in substantiële veranderingen in de cytotoxiciteit tegen menselijke Pmn's bij het testen van andere s. aureus stammen. Het afstemmen van de groeiomstandigheden, volumes van supernatanten toegevoegd, of de verhouding van bacteriën aan pmns kan nodig zijn voor succes met deze methoden met behulp van andere stammen van S. aureus.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus is een gram-positieve bacterie die een breed spectrum van ziekten bij de mens veroorzaakt. Deze prominente pathogeen produceert talrijke virulentie factoren die bijdragen aan verschillende aspecten van infectie. Deze omvatten oppervlakte moleculen waardoor S. aureus zich aan verschillende soorten host-weefsel1kan houden, extracellulaire eiwitten die interfereren met de gastheer immuunrespons2, en een array van afgescheiden toxines die gericht zijn op verschillende soorten hostcellen3. In dit verslag beschrijven we een methode die de cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten, geproduceerd door S. aureus , kwantificeert tegen humane polymorfonucleaire leukocyten (PMNs of neutrofielen), primaire Effector cellen van de gastheer aangeboren immuunrespons.
PMNs zijn de meest voorkomende leukocyten in zoogdieren. Deze circulerende immuuncellen worden snel gerekruteerd op de plaats van gastheer weefsel belediging in reactie op gevaarsignalen geproduceerd door ingezeten cellen of door verbindingen die uniek zijn voor het binnenvallen van microben. De extracellulaire input van deze moleculen en van directe contacten met geactiveerde Resident gastheer cellen tijdens extravasatie verhogen de activeringsstatus van pmns in een proces dat bekend staat als priming4,5. Primed PMNs die noodlijdende weefsel hebben bereikt dan uitvoeren belangrijke aangeboren immuunresponsen ontworpen om te voorkomen dat de oprichting van infectie. Deze omvatten de binding en internalisatie, of fagocytose, van het binnenvallen van micro-organismen die een cascade van intracellulaire gebeurtenissen die cumuleren in microbe vernietiging veroorzaakt door een batterij van krachtige antimicrobiële verbindingen5.
Pmn's spelen een essentiële rol bij het beschermen van mensen tegen het binnenvallen van pathogenen en zijn vooral belangrijk voor het voorkomen van S. aureus infectie4. Echter, deze bacterie produceert een breed scala van virulentie genen die verschillende PMN functies belemmeren. Deze omvatten extracellulaire eiwitten die herkenning van signalering moleculen blokkeren, voorkomen hechting op gastheer weefsel, remmen de productie van antimicrobiële verbindingen, en compromitteren van het plasma membraan integriteit4. S. aureus organiseert de temporele uitdrukking van deze virulentie genen door middel van de collectieve inbreng van meerdere twee componenten sensorische systemen die specifieke omgevings aanwijzingen herkennen. De Saer/S twee-componenten systeem is een belangrijke up-regulator van S. aureus virulentie gentranscriptie tijdens infectie6,7,8,9,10,11. In het bijzonder is gebleken dat dit twee componenten systeem van cruciaal belang is voor de productie van bi-component leukocidinen die specifiek gericht zijn op humane PMNs12.
Dit protocol is onderverdeeld in drie verschillende secties. De eerste sectie beschrijft de zuivering van PMNs van menselijk bloed met behulp van dichtheidsgradiënt centrifugeren met behulp van een protocol dat is aangepast aan de methoden die zijn vastgesteld door Bøyum13 en Nauseef14. In de tweede en derde sectie worden twee verschillende technieken beschreven om S. aureus cytotoxiciteit te onderzoeken; een bedwelmt pmns met extracellulaire eiwitten geproduceerd door S. aureus terwijl de andere onderzoekt het vermogen van levende bacteriën te beschadigen pmns na fagocytose. Deze procedures gebruiken propidium jodide om het verlies van PMN-plasma membraan integriteit veroorzaakt door S. aureus porie vormende toxines te meten. Propidium jodide is een DNA-bindende de die normaal celmembraan ondoorlaat is, maar kan Cross plasma membranen die zijn verstoord door S. aureus toxines. Flow cytometrie analyse maakt de snelle kwantificering van propidium iodide-positieve Pmn's mogelijk om de relatieve cytotoxiciteit van S. aureus stammen te meten. Methicillaire-resistente S. aureus (MRSA) geïdentificeerd als gepulseerd veld gel elektroforese type USA300 en een isogene deletie van Saer/s in deze stam (USA300ΔSaer/s) zijn gebruikt als modellen om aan te tonen hoe deze procedures de cytotoxiciteit van S. aureus kunnen kwantificeren tegen menselijke pmns.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

Staphylococcus aureus is geschikt voor het afscheiden van een breed scala aan leukocidinen die de membraan integriteit van polymorfonucleaire leukocyten (PMNs of neutrofielen) targeten en verstoren. Dit protocol beschrijft zowel de zuivering van menselijke Pmn's en de kwantificering van S. aureus cytotoxiciteit tegen pmns in drie verschillende secties. Sectie 1 Details van de isolatie van PMNs en serum van menselijk bloed met behulp van dichtheid centrifugeren. In deel 2 wordt de cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten die door S. aureus worden geproduceerd, getest tegen deze gezuiverde humane Pmns. rubriek 3 meet de cytotoxiciteit tegen humane pmns na de fagocytose van levende S. aureus. Deze procedures meten verstoring van de PMN-plasma membraan integriteit door S. aureus leukocidins met behulp van Flowcytometrie analyse van pmn's behandeld met propidium jodide, een DNA-bindende de dat celmembraan ondoorstroombaar is. Collectief, deze methoden hebben het voordeel van snel testen S. aureus cytotoxiciteit tegen primaire menselijke PMNs en kan gemakkelijk worden aangepast aan het bestuderen van andere aspecten van gastheer-pathogen interacties.

We hebben laten zien hoe de hierboven beschreven procedures kunnen worden gebruikt om de cytotoxiciteit van s. aureus te kwantificeren tegen menselijke PMNs met behulp van MRSA PFGE-type USA300 en een isogene deletie Mutant van Saer/s in deze stam (USA300ΔSaer/s) gegenereerd in eerdere studies6. PMNs geïsoleerd volgens de procedures beschreven in sectie 1 van dit protocol werden gekleurd met propidium jodide en onderzocht met behulp van Flowcytometrie. Voorwaarts-en zijspreidings plots werden gebruikt om de verontreiniging van gezuiverde pmns door monocyten of lymfocyten (Figuur 1A, B) en PMN-integriteit te illustreren met behulp van propidium jodide-kleuring (Figuur 1C). De beschreven methode van humane PMN-zuivering kan consequent 0,5 x 107 tot 1 x 108 pmns opleveren die > 98% zuiver zijn en > 95% propidium jodide negatief zijn.
De cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300 en USA300ΔSaer/S werd getest tegen gezuiverde PMNs (Figuur 2) volgens de procedures beschreven in punt 2 van dit protocol. Deze experimenten tonen een concentratieafhankelijke toename in de kleuring van propidium jodide van gezuiverde PMNs na 30 minuten intoxicatie met extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300 (Figuur 2B). Eerdere studies hebben aangetoond dat de Saer/S twee-componenten systeem is belangrijk voor de expressie van talrijke bi-component leukocidinen die gericht zijn op menselijke pmns6,10,11,16. Congruent met deze eerdere bevindingen werden zeer weinig propidium iodide-positieve PMNs gedetecteerd na blootstelling aan extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300ΔSaer/S (Figuur 2B). Verdere experimenten toonden een gestage toename van het aandeel van gelyseerd PMNs na intoxicatie door USA300 extracellulaire eiwitten die na ongeveer 30 minuten (Figuur 2C). Minimale Lysis van humane Pmn's werd opgemerkt op alle tijdpunten na blootstelling aan extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300ΔSaer/S. Deze resultaten illustreren het nut van deze test voor de relatieve kwantificering van cytotoxiciteit door extracellulaire S. aureus eiwitten tegen menselijke PMNs.
We testten USA300 en USA300ΔSaer/s met behulp van de S. aureus cytotoxiciteits test tegen humane pmns na fagocytose dat wordt beschreven in rubriek 3 van dit Protocol (Figuur 3). Een concentratieafhankelijke toename van het aandeel propidium jodide positieve pmns werd waargenomen 90 min na de fagocytose van USA300 (Figuur 3A). Een significante afname werd waargenomen in het aandeel van pmns dat propidium jodide positief was na de fagocytose van USA300ΔSaer/s (Figuur 3A), waarbij andere resultaten werden ondersteund die aangeven dat het Saer/S twee componenten systeembelang rijk is voor de cytotoxiciteit van S. aureus tegen humane pmns (Figuur 2)7,11 Zoals eerder vermeld en aangetoond in Figuur 3A, hebben verschillen in de concentratie S. aureus een uitgesproken effect op de PMN-lysis na fagocytose. Opsomming van de USA300 en USA300ΔSaer/S entmateriaal gebruikt in elk van deze experimenten aangetoond dat het contrast in de cytotoxiciteit tussen deze stammen niet te wijten aan verschillen in de concentratie van bacteriën gebruikt (Figuur 3B). Deze bevindingen laten zien hoe de s. aureus cytotoxiciteits test tegen humane PMNs na fagocytose kan worden gebruikt om het vermogen van verschillende S. aureus stammen te beoordelen om de integriteit van de humane PMN plasma membraan te compromitteren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> Figuur 1: Flowcytometrie analyse van gezuiverde PMNs. Representatieve Flowcytometrie punten van (A) gezuiverde humane pmn's en (B) pmn's die opzettelijk zijn verontreinigd met perifere bloed mononucleaire cellen. C) representatief Flowcytometrie histogram dat een minimale kleuring van propidium jodide aantoont (< 1%) van gezuiverde PMNs (gearceerd grijs) in vergelijking met PMNs behandeld met 0,05% Triton X-100 (gearceerd rood). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> Figuur 2: Flowcytometrie analyse van PMNs dronken met extracellulaire eiwitten geproduceerd door S. aureus. A) representatief Flowcytometrie histogram van PMNs gekleurd met propidium jodide na 30 minuten incubatie met media controle (gearceerd blauw), gefilterd USA300 supernatant bij een eindconcentratie van 1:110 (gearceerd grijs), of 0,05% Triton X-100 (gearceerd rood). B) het aandeel propidium jodide-positieve pmns na 30 minuten incubatie met verschillende concentraties van USA300 of USA300 ∆Saer/S -supernatants. C) het aandeel propidium jodide-positieve pmn's na de tijd na incubatie met USA300 of USA300 ∆Saer/S supernatant bij een eindconcentratie van 1:110. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van ten minste 3 afzonderlijke experimenten met * p ≤ 0,05 en * * p ≤ 0,005 zoals bepaald door een tweezijdige t-toets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> Figuur 3: Flowcytometrie analyse van PMNs na fagocytose van S. aureus. A) het aandeel propidium jodide positieve pmns 90 min na de fagocytose van verschillende concentraties van USA300 of USA300 ∆Saer/S. B) concentratie van opsonized S. aureus stammen die worden gebruikt voor de in panel A. gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van 4 afzonderlijke experimenten met * p ≤ 0,01, zoals bepaald door een tweezijdige t-toets. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Dit protocol beschrijft een methode voor de zuivering van polymorfonucleaire leukocyten uit het hele menselijke bloed en twee verschillende assays die de cytotoxiciteit van Staphylococcus aureus kwantificeren tegen deze belangrijke aangeboren immuuncellen.

Kwantificeren van de cytotoxiciteit van Staphyloccus aureus tegen menselijke polymorfonucleaire leukocyten

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Staphylococcus aureus is een gram-positieve bacterie die een breed scala van virulentie factoren die pathogenese bevorderen produceert. Deze omvatten bi-component leukotoxinen die de membraanintegriteit van polymororische leukocyten verstoren, ook wel PMNs of neutrofielen genoemd. Deze video illustreert de isolatie van PMN's van menselijk volbloed en twee verschillende tests voor het kwantificeren van S.aureus cytotoxiciteit tegen deze belangrijke aangeboren immuuncellen.Deze tests kunnen allemaal worden bereikt met standaard laboratoriumapparatuur en zijn gemakkelijk aanpasbaar om andere aspecten van de interactie met gastheerpathogen te onderzoeken. Deze experimenten zullen gebruik maken van volbloed afkomstig van menselijke donoren en zal goedkeuring van de bevoegde institutionele commissie of beoordelingscommissie, evenals een verklaring dat geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers. De eerste stap van deze procedure is de isolatie van neutrofielen door het gebruik van centrifugatie en dichtheidgradiënten.Breng eerst 50 milliliter van 3%dextran 0,9%natriumchloride, 35 milliliter natriumchloride, 20 milliliter natriumchloride, 20 milliliter natriumchloride van 1,8%, 12 milliliter van 1,077 gram per milliliter ficoll-oplossing en 20 milliliter water op kamertemperatuur. Breng 25 milliliter vers getrokken heparinized hele menselijke bloed in twee conische centrifuge buizen. Combineer 25 milliliter vers getrokken gehepariniseerd volbloed met 25 milliliter equivalent volume van kamertemperatuur, 3%dextran, 0,9% natriumchloride in een één-op-één verhouding.Meng door zachtjes schommelen elke 50 milliliter conische buis en laat staan op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na incubatie bij kamertemperatuur verschijnen er twee afzonderlijke lagen. Breng de bovenste laag van elk dextran bloedmengsel over in nieuwe 50 milliliter conische buizen.Centrifuge op 450 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met lage of geen pauzes. Zorgvuldig aanzuigen zowel supernatants en weggooien zonder verstoring van de cel pellets. Voorzichtig resuspend elke cel pellet in twee milliliter van 0,9% natriumchloride.Combineer de geresuspended pellets in een enkele, 50 milliliter conicale voeg de resterende 0,9% natriumchloride aan een uiteindelijk volume van 35 milliliter. Voorzichtig onderlay 10 milliliter van 1.077 gram per milliliter ficoll oplossing onder de cel suspensie met behulp van een handpipet. Na het draaien op 450 g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, met lage of geen pauzes, zachtjes aspirate de supernatant zonder verstoring van de cel pellet, zoals eerder getoond.Lyse de rode bloedcellen door resuspending de cel pellet in 20 milliliter kamertemperatuur water. Meng zachtjes door te rocken gedurende 30 seconden. Voeg onmiddellijk 20 milliliter natriumchloride van 1,8% en centrifugemonster toe bij 450 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Zorgvuldig aanzuigen supernatant zoals eerder getoond. Voorzichtig resuspend de cel pellet in twee milliliter kamertemperatuur RPMI en plaats op ijs. Tel cellen met behulp van een hemacytometer.Resuspend gezuiverde PMN's met een concentratie van één keer 10 tot de 7e cel per milliliter met ijskoude RPMI en houd op ijs. Combineer 100 microliter gezuiverde PMN's met 300 microliter DPBS, met één microliter propidium jodidevlek in twee replicerende stroomcytometriebuizen. Voor een positieve controle, voeg 40 microliters van 0,5%Triton X-100 oplossing in een van de stroom cytometrie buizen en meng grondig.Gebruik stroomcytometrie om de voorwaartse spreiding, zijverstrooiing en propidium jodide-kleuring te meten om de zuiverheid en integriteit van geïsoleerde PMN's te bepalen. Alleen PMN-preparaten die meer dan 98% zuiver en meer dan 95% propidiumjodide negatief zijn, mogen worden gebruikt. Voor het protocol waarin de isolatie van normale menselijke serum, verwijzen naar het volledige manuscript.Bereid een 96-put plaat voor PMN cytotoxiciteit testen door het toevoegen van 100 microliter van 20% geïsoleerd menselijk serum verdund met DPBS aan individuele putten die zullen worden gebruikt in deze test. Zorg ervoor dat ten minste een negatieve controle goed die alleen media ontvangen en ten minste een positieve controle goed die 0,05% Triton X.Incubate de plaat op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten zal ontvangen. Na de incubatie, was de gecodeerde putten twee keer met 100 microliters van ijskoude DPBS en plaats plaat op ijs.Verwijder alle resterende DPBS uit de plaat putten en voorzichtig toe te voegen 100 microliter van gezuiverde menselijke PMN's op een keer 10 tot de 7e cellen per milliliter om elke gecodeerde goed. Laat vergulde neutrofielen zich vestigen door ze ten minste vijf minuten op ijs te laten liggen voordat ze in de volgende cytotoxiciteitstesten worden gebruikt. Deze sectie beschrijft een test die de cytotoxiciteit kwantificeert van extracellulaire eiwitten geproduceerd door staph aureus tegen menselijke PMNs.Cultuur S.aureus 's nachts in de juiste media met behulp van een schudden incubator ingesteld op 37 graden Celsius de dag voorafgaand aan het experiment. Subcultuur S.aureus door het uitvoeren van een een tot 100 verdunning van 's nachts bacteriën culturen met verse media. Incubeer bij 37 graden Celsius met schudden tot bacteriën vroege stationaire groeifase bereiken.Breng na vijf uur groei een milliliter subcultuur S.aureus over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifuge bij 5.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, aspirate supernatants. Pass opgezogen supernatants door een 0,22 micron spuitfilter in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis en plaats op ijs.Uitvoeren van seriële verdunningen van supernatants met ijskoude media gebruikt om de cultuur Staph aureus. Voeg voorzichtig supernatant monsters of media uitgeleend voor negatieve en positieve controles aan individuele putten van een 96-put plaat met PMN's op ijs, zoals eerder beschreven. Voorzichtig rock plaat te verdelen supernatants in putten en incubeer bij 37 graden Celsius.Verwijder op de gewenste tijdstippen de plaat uit de couveuse en plaats op ijs. Voeg 300 microliters ijskoude DPBS toe met één microliter propidiumjodide aan elke stroomcytometriebuis. Breng de monsters over om cytometriebuizen op ijs te laten stromen.Voor de positieve controle goed, voeg 20 microliter van 10%Triton X aan het monster voorafgaand aan de overdracht naar een stroom cytometrie buis. Analyseer propidium jodide kleuring van dronken PMN's met behulp van stroomcytometrie. Deze sectie beschrijft een test die de cytotoxiciteit van S.aureus na fagocytose door menselijke PMNs kwantificeert.Groeicurven gedefinieerd door de optische dichtheid op 600 nanometer en de concentratie van bacteriën moeten worden bepaald voor de relevante Staph aureus stammen voorafgaand aan het gebruik in deze test. Start 's nachts culturen van S.aureus stammen en subcultuur bacteriën, zoals eerder beschreven. Zodra subcultuur Staph aureus heeft bereikt mid-exponentiële groei, breng een milliliter van de cultuur bacteriën tot 1,5 milliliter microcentrifuge buis en centrifuge op 5,000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Was S.aureus door zijn supernatant te aspireren zonder de pellet te verstoren en de pelleted bacteriën opnieuw op te stellen bij één milliliter DPBS. Vortex de monsters voor 30 seconden. Centrifugeren de monsters op 5,000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Om Staph aureus te oxideren, wordt de bacteriële pellet eerst opnieuw opgetrokken in één milliliter van 20% menselijk serum. Dan incubeer monsters op 37 graden Celsius met agitatie gedurende 15 minuten. Was geoxideerde Staph aureus na centrifugatie zoals eerder getoond.Verdun geoxideerde Staph aureus stammen tot één keer 10 tot de 8e kolonievormende eenheden, CFUs per milliliter, met ijskoude RPMI. Vortex het monster voor 30 seconden en plaats op ijs. Bevestig de concentraties van Staph aureus gebruikt voor deze tests door plating een tot 10 seriële verdunningen van bacteriën op agar.Voeg voorzichtig 100 microliter per put van elke Staph aureus-stam, of RPMI voor positieve en negatieve controles, toe aan PMN's in een 96-putplaat op ijs vanaf stap 1.14. Voorzichtig rock plaat te verdelen Staph aureus in putten. Synchroniseer fagocytose door middel van centrifuging plaat op 500 g gedurende acht minuten bij vier graden Celsius en incubeer plaat op 37 graden Celsius onmiddellijk na centrifugatie als tijd nul.Op de gewenste tijdstippen, zet de plaat op ijs en voeg 200 microliter ijs DPBS met een microliter propidium jodide aan elke stroom cytometrie buis dan de overdracht monsters naar hun overeenkomstige buis. Analyseer monsters voor propidium jodide kleuring met behulp van stroomcytometrie zoals beschreven in 2.8 en 2.9. De transcriptie van bi-component leukotoxinen die zich richten op menselijke PMN's door Staph aureus vereist dat het SA- of S2-componentensysteem het nut van de beschreven tests aantoont voor het kwantificeren van Staph aureus cytotoxiciteit tegen menselijke PMN's.Deze experimenten werden uitgevoerd met een klinisch relevant Staph aureus isolaat geïdentificeerd als USA300 in een isologenische verwijdering mutant van SA of S in deze stam. Het linkerpaneel toont gezuiverde PMN's en het rechterpaneel toont opzettelijk verontreinigde monsters als voorbeeld. PMN geïsoleerd met behulp van de procedures beschreven in sectie een van dit protocol werden bevlekt met propidium jodide en onderzocht met behulp van stroom cytometrie.Voorwaartse en zijverstrooiende percelen werden gebruikt om besmetting van gezuiverde PMN's door monocyten of lymfocyten jarenlang op te sporen 1A en 1B. De integriteit van PMN werd bepaald met behulp van propidium jodide-kleuring. Door gebruik te maken van de beschreven methode van menselijke PMN zuivering, kunnen we consequent isoleren vijf keer 10 tot de 7e tot een keer 10 tot de 8e PMN die meer dan 98% zuiver en zijn meer dan 95% propidium iodide negatief.De cytotoxiciteit van extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300 en de AsaeR/S mutant werden getest tegen gezuiverde PMN's. Deze experimenten tonen een concentratieafhankelijke toename aan van de propidium jodide kleuring van gezuiverde PMN's na 30 minuten intoxicatie met extracellulaire eiwitten geproduceerd door USA300, maar niet met de AsaeR/S mutant. Verdere experimenten toonden een gestage toename van het aandeel van propidium jodide positieve PMN's na intoxicatie door USA300 extracellulaire eiwitten die plateaued na ongeveer 30 minuten.Minimale propidium jodide kleuring van menselijke PMN's werd opgemerkt op alle tijdstippen na blootstelling aan extracellulaire eiwitten geproduceerd door de AsaeR / S mutant. Ten slotte werd de cytotoxiciteit van USA300 en AsaeR/S mutant tegen PMN's na gesynchroniseerde phagocytose getest, een concentratieafhankelijke toename van het aandeel propidium jodide positieve PMN's werd 90 minuten na de phagocytose van USA300 waargenomen. Aanzienlijk minder PMN's waren propidium jodide positief na de fagocytose van de AsaeR/S mutant.In elk van deze experimenten werd gebruik gemaakt van de opsomming van de VS300 en AsaeR/S mutanten enpoeculum dat het contrast in cytotoxiciteit tussen deze stammen niet te wijten was aan verschillen in de concentratie van gebruikte bacteriën. Dit protocol beschrijft de zuiveringen van PMN's uit menselijk bloed in twee verschillende technieken voor het kwantificeren van de cytotoxiciteit van S.aureus tegen deze aangeboren immuuncellen. Het succes van deze procedures zal afhangen van de kwaliteit van de gezuiverde PMN's en de juiste voorbereiding van Staph aureus bacteriën of supernatants.Raadpleeg het volledige manuscript voor belangrijke punten om te overwegen tijdens het uitvoeren van deze procedures. USA300 is een virulente MRSA isolaat en het verlies van AsaeR / S drastisch vermindert transcriptie van virulentie factoren die gericht zijn op menselijke PMN's, waardoor deze stammen ideale modellen voor het vergelijken van cytotoxiciteit met behulp van de beschreven assays. Het afstemmen van de groeiomstandigheden, de toegevoegde volumes van supernatants of de verhouding van bacteriën tot PMN's kan nodig zijn bij het gebruik van andere stammen van Staph aureus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimentele Endocarditis Model van Methicilline Resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studeren Interacties van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...