Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי U.S. המכונים הלאומיים של מענקי בריאות NIH-1R56AI135039-01A1, 1R56AI135039-01, U54GM115371 כמו גם כספים מתחנת החקלאות של אוניברסיטת מונטנה של המדינה, ומענק הציוד מ מרדוק אמון צדקה .

דם הורידים של heparinized מתורמים בריאים נאסף בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית לנושאים אנושיים באוניברסיטת מונטנה. כל התורמים סיפקו הסכמה בכתב להשתתף במחקר זה.
1. טיהור הפולימלוציטים האנושיות והבידוד של הנסיוב האנושי
הערה: כל הריאגנטים צריך להיבדק באופן שגרתי עבור הנוכחות של אנדוטוקסין באמצעות ערכת זיהוי אנדוטוקסין זמין מסחרית צריך להכיל < 25.0 pg/mL אנדוטוקסין כדי למנוע הטרמה לא רצויה של PMNs.
<ol><li>הביאי 50 mL של 3% dextran-0.9% כלים (w/v), 35 mL של 0.9% (w/v), 20 מ ל של 1.8% היום (w/v), 12 מ ל בצפיפות מעבר הצבע g/mL, ו -20 מ ל של מים הזרקה או השקיה בכיתה לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כדי לבודד את הנסיוב האנושי, הדגירה 4 מ ל של דם אנושי שצויר מבלי נגד מקריש ב 37 ° c בצינור זכוכית של 15 מ ל 30 דקות. לאחר דגירה, דגימת צנטריפוגה בשנת 2000 – 3000 × g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את שכבת הסרום העליון לתוך צינור חדש 15 מ"ל של צנטריפוגה ו מקום על הקרח.</li>
	<li>שילוב 25 מ ל של heparinized טריים (1000 יחידות/mL) דם אנושי שלם עם 25 מ ל של טמפרטורת החדר 3% dextran-0.9% נקול (1:1 יחס) בשני שכפול 50 מנורות צנטריפוגה מ ל (50 mL). מערבבים על ידי נדנדה בעדינות כל 50 מ"ל שפופרת חרוט ולאחר מכן לתת לעמוד בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר, יופיעו שתי שכבות נפרדות. העבר את השכבה העליונה של כל התערובת דם dextran לתוך חדש 50 mL שפופרות חרוט ו צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר עם נמוך או ללא בלמים.</li>
	<li>מתיף בזהירות את הסופרנטנים ומתעלם מבלי להפריע את כדורי התא. השעיית מחדש בעדינות כל גלולה תא ב-2 מ ל של טמפרטורת החדר 0.9%, לשלב את כדורי מחדש ב-1 50 mL בשפופרת חרוט, ולאחר מכן להוסיף את הנותרים 0.9% כמות (הנפח הסופי של 35 mL).</li>
	<li>בזהירות לאנדרליי 10 mL של טמפרטורת החדר של 1.077 g/mL צפיפות מעבר הצבע מתחת ההשעיה התא באמצעות פיפטה יד. ספין ב 450 x g עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נמוך או ללא בלמים. מבלי להפריע. לגלולה הסלולרית הסופרנטאנט יכיל תאי דם היקפיים שניתן לאסוף כמתואר בעבר14.</li>
	<li>לאחר כדוריות הדם האדומות על ידי השעיית מחדש את הגלולה בתא 20 מ ל של מים בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה הצינור עבור 30 s. הליזה של כדוריות הדם האדומות ילוו בירידה ברורה בעכירות.</li>
	<li>מיד להוסיף 20 מ ל של 1.8% הנאגל (בטמפרטורת החדר [RT]) ו מדגם צנטריפוגה ב 450 × g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: חשוב למזער את הזמן שPMNs נותרו במים לבדו בעקבות הפירוק של תא דם אדום כדי למקסם את התשואה של PMN ולמנוע הליזה PMN ו/או הפעלה.</li>
	<li>מבלי להפריע. לגלולה הסלולרית בעדינות להשעות מחדש את הגלולה התא 2 מ ל של RT RPMI 1640 בינוני ומקום על הקרח.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות הומוציטומטר. השהה מחדש PMNs מטוהרים בריכוז של 1 x 107 תאים/ML עם RPMI קרח קר ולשמור על קרח.</li>
	<li>לשלב 100 μL של PMNs מטוהרים (1 x 106 תאים) עם 300 μl של מלוחים באגירה של הקרח הקפוא של Dulbecco (dpbs) המכיל 1 μl של כתם propidium יודיד בשני צינורות שכפול זרימה cy, try. עבור שליטה חיובית נזק קרום הפלזמה, להוסיף 40 μL של 0.5% טריטון X-100 פתרון לתוך אחד הצינורות cy, לנסות לערבב ביסודיות.</li>
	<li>השתמש cy, למדוד את פיזור הקדמי, הצד פיזור, ו propidium יודיד צביעת (עירור/פליטה מקסימה ב 535/617 nm) של תאים מטוהרים (איור 1). הערה: ניתוח פיזור לפנים ולצדדים יזהה אוכלוסיות לא רצויות של לימפוציטים ומונוציטים. Propidium יודידה יהיה רק להכתים תאים עם קרום פלזמה פרוצים ומטוהרים PMNs כי יש בולטת אוכלוסיות של Propidium התאים החיוביים ביותר לא צריך לשמש. עבור מחקרים אלה, PMNs מטוהרים היו בשימוש רק אם הם מורכבים > 98% של תאים מטוהרים ו < 5% מוכתם חיובי עבור propidium יודיד.</li>
	<li>להכין צלחת 96-הבאר עבור PMN הרעילות ציטומה על ידי ציפוי בארות בודדות שישמשו בתוך שיטת הפעולה עם 100 μL של 20% סרום אנושי בודד כי כבר מדולל עם DPBS. הערה: ציפוי PMNs ישירות על פלסטיק או זכוכית יגרום הפעלת התאים. הקפד לכלול לפחות שלילי אחד היטב כי יהיה רק לקבל מדיה לפחות שליטה חיובית אחת היטב כי יקבל 0.05% טריטון X-100.</li>
	<li>מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 30 דקות. בעקבות דגירה, לשטוף את הבארות מצופה פעמיים עם DPBS קר קרח כדי להסיר את כל הסרום עודף. הקש בעדינות את הצלחת הפוך כדי להסיר DPBS שיורית ומקום על הקרח.</li>
	<li>בעדינות להוסיף 100 μL של PMNs אנושי מטוהרים ב 1 x 107 תאים/mL לכל מצופה היטב (1 x 106 PMNs/טוב). אפשר PMNs להתיישב בבארות על ידי הפצת הצלחת על הקרח לפחות 5 דקות. לשמור על רמת הצלחת לאפשר אפילו הפצה של תאים בכל באר ולהשאיר על הקרח כדי למנוע הפעלה לא רצויה של PMNs.</li>
</ol>2. הסדר של הרעלת ציטוזה של S. האוראוס חלבונים נגד פולימלוציטים ברורים האדם
<ol><li>תרבות שנות הלילה בציר סויה טריפטי (TSB) באמצעות אינקובטור רועד הממוקם ב37 ° c. עבור מחקרים אלה, 20 מ ל של TSB בנפרד 150 mL Erlenmeyer מבחנות היו מחוסן עם תרבויות קפואות של S. האוראוס זנים USA300 או USA300ΔSaer/S וגדל עבור כ 14 h עם טלטול ב 250 סל ד.</li>
	<li>תת-תרבות S. האורלנו על-ידי ביצוע דילול של 1:100 בתרבית חיידקית של לילה עם מדיה טרייה. מודטה ב 37 ° c עם טלטול עד החיידקים להגיע שלב מוקדם הצמיחה נייח. הערה: עבור ניסויים אלה, 20 מ ל של ציר סויה טריפטי ב 150 mL Erlenmeyer מבחנות היו מחוסן עם 200 μL של לילה תרבותי USA300 או USA300ΔSaer/S ו-מודחלת ב 37 ° צ' עם טלטול ב 250 סל ד עבור 5 h.</li>
	<li>כאשר החיידקים הגיעו שלב מוקדם הצמיחה נייח, להעביר 1 מ ל של תת תרבותי S. האורלנו לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ו צנטריפוגה ב 5,000 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, להעביר את הסופר לתוך מזרק 3 מ ל. להעביר supernatants באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר לתוך צינור חדש 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה על הקרח.</li>
	<li>בצעו דידקות סדרתיות של סופרנטנים עם מדיה קרה בקרח המשמש לתרבות ס. האוראוס. הערה: עבור הניסויים המוצגים, סופרנטנים מ USA300 ו USA300ΔSaer/S עברו ארבעה רציפים 1/2 ברציפות יומן עם TSB קר קרח.</li>
	<li>בעדינות להוסיף דגימות supernatant או מדיה בלבד (עבור פקדים שליליים וחיוביים) על בארות בודדות של 96-צלחת לוחית המכילה PMNs על קרח משלב 1.15. עבור ניסויים אלה, 10 μL של USA300 או USA300ΔSaer/S סופר דגימות נוספו כל טוב. צלחת סלע בעדינות כדי להפיץ סופרנטנים בבארות ובדגירה ב 37 ° c.</li>
	<li>בזמנים הרצויים, להסיר את הצלחת מן החממה ומקום על הקרח. הוסף 40 μL של 0.5% טריטון X-100 לבקרה חיובית היטב.</li>
	<li>בעדינות פיפטה את הדגימות למעלה ולמטה בכל באר כדי למשוך לחלוטין את כל PMNs דבקה לצלחת, לאחר מכן להעביר את דגימות כדי להזרים cy, צינורות בקרח המכילים 300 μL של DPBS קרח קר עם 1 μL של propidium יודיד.</li>
	<li>למדוד את הפרופורציה של propidium יודידה חיובי PMNs באמצעות הזרימה cy try (איור 2א). כאשר מאוגד ל-DNA, propidium יודיד יש עירור/פליטה ב 535/617 nm.</li>
</ol>3. S. בעלי הרעלת ציטוזה כנגד פולימלוציטים האדם ברור בעקבות פאיגוציטוזה
הערה: עקומות גדילה שהוגדרו על ידי צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) וריכוז של חיידקים חייב להיקבע בדרך הכלל עבור זנים S. האורלנו להיבדק לפני תחילת הקביעה. הצלחה של ניסויים אלה דורש את הקציר עקבית של ריכוזים שווים של כל S. הרוב הנבג נבדק בשלב באמצע הצמיחה מעריכית באמצעות OD600 של חיידקים תת-תרבותית.
<ol><li>להתחיל תרבויות לילה של זנים האורלנו וחיידקים תת-תרבות כמתואר בשלבים 2.1.1 ו 2.1.2.</li>
	<li>הקציר משנה של תרבות S. האוראוס כאשר הגיע הצמיחה באמצע מעריכי על ידי העברת 1 מ ל של חיידקים מתורבתים 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת תפרידו ב 5,000 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: תחת תנאי הצמיחה שלנו, USA300 ו USA300ΔSaer/S הגיע שלב באמצע הצמיחה מעריכית לאחר כ 135 דקות של דגירה6.</li>
	<li>שטוף S. האורלנו בעקבות צנטריפוגה על ידי הפחתת הסופרנטאנט, השעיית מחדש את החיידקים הפלטאד ב 1 מ ל של dpbs, vortexing את המדגם עבור 30 S, ו תפרידו ב 5,000 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Opsonize S. האורלנו על ידי מחדש את הגלולה החיידקית ב 1 mL של 20% הנסיוב האנושי מדולל עם dpbs ו דגירה ב 37 ° c עם עצבנות עבור 15 דקות.</li>
	<li>בקטריה מונקרת צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף S. האורלנו בעקבות צנטריפוגה על ידי הפחתת הסופרנטאנט, השעיית מחדש את החיידקים הפלתד ב-1 ML dpbs, ואז מערבולת המדגם עד הגלולה חיידקי מתפרק לחלוטין ועוד 30 שניות נוספות. בקטריה צנטריפוגה ב 5,000 × g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השהה את opsonized S. האוראוס זנים ב 1 mL RPMI, מערבולת המדגם עד הגלולה בקטריאלי מתפרק לחלוטין, ולאחר מכן עבור 30 נוספים.. מניחים חיידקים על קרח</li>
	<li>לדלל את הזנים האוראוס לריכוז הרצוי עם RPMI קר קרח. . מערבולת לשלושים ומקום על הקרח</li>
	<li>לאשר את הריכוז של האורסונזציה של האוראוס על ידי ציפוי 1:10 מדלל את החיידקים על הטריטיק אגר סויה. הערה: מכיוון שהבדלים בריכוז החיידקים המשמשים באפשרות זו יכולה להיות השפעה מרכזית על חדירות PMN בעקבות הממברנה (איור 3a), חשוב מאוד כי הריכוז של כל זן נבדק נקבע עבור כל ניסוי והוא שווה בין זנים.</li>
	<li>בעדינות להוסיף 100 μL/ובכן של כל ס. הRPMI הזנים או מאמץ (עבור פקדים חיוביים ושליליים) כדי PMNs בצלחת 96-באר על הקרח משלב 1.14. לוחית הרוק בעדינות כדי לפזר את ס. האורלנו בבארות</li>
	<li>לסנכרן phagocyציטוזה על ידי תפרידו את הצלחת ב 500 × g עבור 8 דקות ב 4 ° c15. הצלחת דגירה ב 37 ° c מיד לאחר צנטריפוגה (T = 0).</li>
	<li>בזמנים הרצויים, להסיר צלחת מתוך החממה ומקום על הקרח. הוסף 40 μL של 0.5% טריטון X-100 לבקרה חיובית היטב.</li>
	<li>בעדינות פיפטה את הדגימות למעלה ולמטה בכל באר כדי למשוך לחלוטין את כל PMNs דבקה לצלחת, ולאחר מכן להעביר את דגימות כדי להזרים cy, צינורות על הקרח המכיל 200 μL של DPBS קרח קר עם 1 μL של propidium יודיד.</li>
	<li>לנתח דגימות עבור propidium יודיד באמצעות זרימה cy try כפי שמתואר בשלב 2.9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., H&#246;&#246;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+invasion+and+evasion:+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus.">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li><li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses.">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+toxins.">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li><li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epic+Immune+Battles+of+History:+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus.">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li><li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytes.">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li><li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis.">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li><li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR/S+Dependent.">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+SaeR/S-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production.">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li><li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR/S-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus.">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li><li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence.">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).</li><li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocidins:+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors.">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li><li>B&#248;yum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils.">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של PMNs מן הדם האנושי ושני מוסר שונות כי השימוש propidium יודיד עבור כימות הרעילות של S. האוראוס נגד אלה תאים חיסוניים מולדים חשובים. ההצלחה של הליכים אלה יהיה תלוי באיכות של PMNs מטוהרים ואת ההכנה המתאימה של S. האוראוס וחלבונים לחילוץ המיוצר על ידי פתוגן זה. לבידוד של PMNs, חשוב למזער את הפעלת PMN במהלך ולאחר הטיהור באמצעות ריאגנטים חינם של זיהום אנדוטוקסין, טיפול ההכנות לתא בעדינות, ושמירה על תאים בטמפרטורה המתאימה. סימנים המציינים הפעלה של PMNs כוללים מקלפת תאים במהלך טיהור וכאשר יותר מ 5% תאים מבודדים כתם חיובי עבור propidium יודיד. בגלל תוחלת החיים הקצרה יחסית של PMNs, תאים אלה חייבים להיות מבודדים דם אנושי נבדק באותו יום. PMNs יתחילו להפגין סימנים של אפופטוזיס ספונטנית אם שמאל על הקרח עבור יותר מ 3 h לאחר הטיהור. כפי שהוזכר קודם לכן, חשוב מאוד כי כל הכנה PMN הוא הוערך בקפידה באמצעות הניתוח cy, לנסות לעבור פיזור הקדמי והצד כמו גם propidium יודידה כתמים כדי להבטיח את הטוהר ואת היושרה של תאים מבודדים.
הביטוי של לוקמיה של המרכיב הדו על ידי S. האוראוס אחראי על רוב בסכנה pmn פלזמה שלמות קרום כי הוא נצפתה באמצעות בחני המתואר בפרוטוקול זה. וריאציה על הביטוי של רעלים אלה והנקבוביות האחרות להרכיב פפטידים, כגון מודולים פנול-מסיסים, בין זנים של s. האורבאוס יפיק הבדלים רעילות ציטוטוקסינים נגד PMNs האדם. סטיות משמעותיות במהלך הצמיחה החוץ-גופית בין זנים s. האורבאוס יהיה גם להשפיע על ביטוי של הנקבוביות ויוצרים רעלים ו בנוסף, היחס של S. האורלנו ל PMNs ב phagocyציטוזה יש השפעה מרכזית על הבאים pmn פלזמה ממברנה חדירות (איור 3a) וניסויים אלה דורשים את הקציר עקבית של ריכוזי שווה של כל S. הזנים האבוניים נבדק בשלב הצמיחה מעריכי באמצעות OD600 של חיידקים תת-תרבותית. בהינתן שיקולים אלה, חשוב מאוד להגדיר עקומות גדילה עבור כל הזנים אשר ייבדקו לפני תחילת הרעילות ציטומה. אנחנו לא ממליצים על שיטות אלה לניתוח של הרעלת ציטוזה של האוראוס עם זנים המוצגים הבדלי צמיחה משמעותיים בתוך מבחנה.
USA300 הוא בודד MRSA מורעלים כי ידוע להיות מאוד ציטוטוקסיים נגד האדם PMNs15 ואובדן saer/S במתח זה מפחית באופן דרמטי שעתוק של רבים דו-component לוקמיה היעד האנושי PMNs6,12, מה שהופך אלה זנים אידיאליים מודלים עבור השוואת הרעילות ציטומי באמצעות בחני תיאר. עם זאת, יש וריאציה גנטית נרחבת בין שונים S. האוראוס מבודד את הפרמטרים המפורטים בפרוטוקולים אלה לא יכול לגרום לשינויים משמעותיים ב רעילות באופן משמעותי של האדם PMNs בעת בדיקת זנים S. האורארה אחרים. התאמת תנאי הגדילה, כרכים של סופרנטונים הוסיף, או יחס של חיידקים כדי PMNs עשוי להידרש להצלחה עם שיטות אלה באמצעות זנים אחרים של הברית.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

האורהקוקוס הוא חיידק גראם חיובי הגורם למגוון רחב של מחלות בבני אדם. הפתוגן הבולט הזה מייצר גורמים התקפה אלימה רבים שתורמים להיבטים שונים של זיהום. אלה כוללים מולקולות פני השטח המאפשרים S. האורלנו לדבוק סוגים שונים של רקמת מארח1, חלבונים מוליתיים המפריעים התגובה החיסונית מארח2, ומערך של רעלים מופרש היעד סוגים שונים של תאים מארחים3. בדו ח זה, אנו מתארים שיטה המכיל את הרעילות ציטוציטים של חלבונים המיוצרים על ידי S. האוראוס נגד האדם הPMNs ברורה וליוקוציט (או נויטרופילים), תאים העיקרי של אפקטור של הפונדקאי התגובה החיסונית מולדת.
PMNs הם הלוקוציטים. השופעים ביותר ביונקים אלה תאים חיסוניים מחזורי מגויס במהירות לאתר של עלבון רקמות מארח בתגובה אותות סכנה המיוצר על ידי תאים תושב או על ידי תרכובות ייחודיות הפולשים חיידקים. הקלט מהמולקולות הללו ומאנשי קשר ישירים עם תאים מארחים מופעלים שהופעלו במהלך extravasation להגדיל את מצב ההפעלה של PMNs בתהליך המכונה הטרמה4,5. מPMNs כי הגיעו רקמת מצוקה ולאחר מכן לבצע תגובות החיסונית מולדים חשובים שנועדו למנוע את הקמתה של זיהום. אלה כוללים את הכריכה הפנמה, או phagocyציטוזה, של פולשים מיקרואורגניזמים המפעיל מפל של אירועים תאיים cumulating בהרס חיידק על ידי סוללה של תרכובות מיקרוביאלית חזק5.
PMNs לשחק תפקיד חיוני הגנה על בני אדם מפני הפולשים פתוגנים והם חשובים במיוחד למניעת הזיהום S. האוראוס 4. עם זאת, חיידק זה מייצר מגוון רחב של גנים התקפה אלימה הפוגעים בפונקציות PMN שונים. אלה כוללים חלבונים לחילוץ לחסום את ההכרה של מולקולות איתות, למנוע הדבקה של רקמות מארח, לעכב את הייצור של תרכובות מיקרוביאלית, ולהתפשר על שלמות קרום הפלזמה4. שיעור הביטוי הזמני של הגנים הללו באמצעות הקלט הקולקטיבי ממערכות חישה מרובות של שני רכיבים המכירים ברמזים סביבתיים ספציפיים. Saer/S שני רכיבים מערכת היא הרגולטור העיקרי של S. הנקרא התקפה גנטית שעתוק גנים במהלךזיהום 6,7,8,9,10,11. בפרט, מערכת זו שני רכיבים הוכח להיות קריטי לייצור של לוקמיה דו קומפוננטי המיועד במיוחד לאדם PMNs12.
פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים שונים. הסעיף הראשון מתאר את הטיהור של PMNs מן הדם האנושי באמצעות הדרגתי צפיפות צנטריפוגה באמצעות פרוטוקול שהותאמה משיטות שנקבעו על ידי Bøyum13 ו Nauseef14. הסעיפים השני והשלישי מפרטים שתי טכניקות שונות כדי לבחון את הרעילות של אס. אחד מהרעיל את PMNs עם חלבונים מסחטות המיוצרים על ידי S. האוראוס בעוד השני בוחן את היכולת של חיידקים חיים לפגוע PMNs בעקבות phagocyציטוזה. הליכים אלה משתמשים propidium יודיד כדי למדוד את ההפסד של השלמות PMN פלזמה הממברנה שנגרמו על ידי S. האורלנו נקבובית-ויוצרים רעלים. Propidium יודיד הוא ה-DNA מחייב fluorophore כי הוא בדרך כלל ממברנה התא האטום אך יכול לחצות ממברנות פלזמה כי שובלו על ידי S. האוראוס רעלים. הניתוח cypropidium try זרימה מאפשר את הקוונפיקציה מהירה של יודידה חיובי PMNs למדוד את הרעילות היחסית של זנים S. האוראוס . סטפילוקוקוס-עמיד S. האוראוס (MRSA) מזוהה כגון אלקטרופורזה-שדות ג'ל סוג USA300 ו המוטציה מחיקה איזוגנית של saer/s במאמץ זה (USA300Δsaer/S) שימשו כמודלים כדי להדגים כיצד הליכים אלה יכולים לכמת את הרעילות של S. האורלנו נגד האדם PMNs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

האורהילוקוקוס הוא מסוגל הפרשה מגוון רחב של leukocidins כי המטרה ולשבש את שלמות הממברנה של פולימורקוציטים ברורה (PMNs או נויטרופילים). פרוטוקול זה מתאר הן את הטיהור של הPMNs האנושי והן את הקוונפיקציה של ה-"רעילות ציטוארה" נגד PMNs בשלושה חלקים שונים. סעיף 1 מפרט את הבידוד של PMNs וסרום מהדם האנושי באמצעות צנטריפוגה צפיפות. מדור 2 בדיקות ציטורעילות של חלבונים החילוץ המיוצר על ידי S. האורלנו נגד אלה PMNs האנושי מטוהרים. סעיף 3 מודד את הרעילות הציטומה נגד האדם PMNs בעקבות phagocyציטוזה של חי S. האוראוס. הליכים אלה למדוד את ההפרעה של פלזמה PMN שלמות קרום על ידי לוקמיה האורמית באמצעות שימוש בניתוח cyPMNs try של מטופלים עם propidium יודיד, כריכת ה-DNA fluorophore כי הוא ממברנה התא הממברנה. באופן קולקטיבי, שיטות אלה יש את היתרון של בדיקות במהירות S רעילות ציטויום של מPMNs האדם העיקרי והוא יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד היבטים אחרים של אינטראקציות מארח הפתוגן.

הדגמנו כיצד ההליכים המתוארים לעיל ניתן להשתמש כדי לכמת באופן יחסי את הרעילות של S. האוראוס נגד PMNs אנושי באמצעות MRSA pfge-סוג USA300 ו המוטציה מחיקה איזוגנית של saer/s בזן זה (USA300Δsaer/S) שנוצר במחקרים קודמים6. PMNs בודד באמצעות ההליכים המתוארים בסעיף 1 של פרוטוקול זה היו מוכתם propidium יודיד ונבדק באמצעות הזרימה cy, לנסות. מגרשים לפנים ולצד שימשו כדי להמחיש זיהום של PMNs מטוהרים על ידי מונוציטים או לימפוציטים (איור 1A, B) ו pmn היושרה נקבע באמצעות propidium יודיד כתמים (איור 1ג). השיטה המתוארת של האדם טיהור PMN יכול בעקביות להניב 0.5 x 107 אל 1 x 108 PMNs כי הם > 98% טהור הם > 95% propidium יודיד שלילי.
הרעלת ציטוזה של חלבונים מUSA300 שיוצרו על ידי USA300ΔSaer/S נבדקו נגד מטוהרים PMNs (איור 2) בעקבות ההליכים המתוארים בסעיף 2 של פרוטוקול זה. ניסויים אלה להפגין עלייה תלויה הריכוז propidium יודיד כתמים של מטוהרים PMNs בעקבות 30 דקות של שיכרון עם חלבונים מסחטות המיוצר על ידי USA300 (איור 2ב). מחקרים קודמים הוכיחו כי saer/S שני רכיבים מערכת חשוב ביטוי של מספר דו-מרכיבי לוקמיה רבים שהמטרה האנושית PMNs6,10,11,16. בעזרת הממצאים הקודמים האלה, מעט מאוד propidium יודידה-חיוביים PMNs זוהו לאחר החשיפה לחלבונים לחילוץ המיוצר על ידי USA300ΔSaer/S (איור 2ב). ניסויים נוספים הפגינו עלייה יציבה ביחס של PMNs lysed לאחר שיכרון על ידי חלבונים USA300 מסחטות כי plateaued לאחר כ 30 דקות (איור 2ג). הליזה מינימלית של האדם PMNs היה ציין בכל פעם נקודות לאחר החשיפה לחלבונים מסחטות המיוצר על ידי USA300ΔSaer/S. תוצאות אלה ממחישים את השירות של היישום הזה עבור הקוונפיקציה היחסית של רעילות ציטומה על ידי מסחטות החלבונים של האוראוס נגד PMNs אנושי.
בדקנו את USA300 ו USA300ΔSaer/S באמצעות שיטת הרעילות של ה-ציטואוס נגד הPMNs האנושית בעקבות phagocyציטוזה המתוארת בסעיף 3 של פרוטוקול זה (איור 3). להגדיל תלוי ריכוז בפרופורציה של propidium יודיד חיובי PMNs נצפתה 90 דקות לאחר phagocyציטוזה של USA300 (איור 3A). ירידה משמעותית נצפתה ביחס של PMNs כי היו propidium יודיד חיוביבעקבותphagocyציטוזה של USA300Δsaer/s (איור 3A), תמיכה בתוצאות אחרות המציינות את מערכת השני רכיבים saer/s חשוב עבור רעילות ציטואס נגד האדם PMNs (איור 2)7,11. כפי שהוזכר קודם לכן והפגינו באיור 3A, הבדלים בריכוז S. האורארה יש השפעה מובהקת על הליזה pmn בעקבות phagocyציטוזה. ספירה של USA300 ו USA300ΔSaer/S המשמשים בכל הניסויים האלה הראו כי הניגודיות של רעילות ציטובין זנים אלה לא היה בשל הבדלים בריכוז של חיידקים בשימוש (איור 3ב). הממצאים הללו מראים כיצד מערכת הרעילות האורמית של האוראוס נגד האדם PMNs בעקבות phagocyציטוזה ניתן להשתמש כדי להעריך את היכולת של זנים שונים של האוראוס להתפשר על שלמות הקרום פלזמה pmn האדם.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> איור 1: הזרמת ציטונסה לניתוח של PMNs מטוהרים. זרימה הנציגה cy,לנסותמגרשים של (א) מטוהרים האדם PMNs ו (ב) PMNs כי כבר נגועים בכוונה עם דם היקפי תאים מוננובית. (ג) זרם מייצג cy, ההיסטוגרמה היסטוגרמה הדגמת propidium יודידה מינימלית (< 1%) PMNs מטוהרים (אפור מוצל) לעומת PMNs שטופלו עם 0.05% טריטון X-100 (אדום מוצלל). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> איור 2: הזרימה cyPMNs try הניתוח של שיכור עם חלבונים מסחטות המיוצר על ידי S. האוראוס. (א) זרם מייצגcy, היסטוגרמה של PMNs מוכתם עם propidium יודיד לאחר 30 דקות של דגירה עם בקרת מדיה (כחול מוצל), מסוננים USA300 supernatant בריכוז הסופי של 1:110 (אפור מוצל), או 0.05% טריטון X-100 (מוצל אדום). (ב) היחס של propidium יודיד חיובי PMNs לאחר 30 דקות של דגירה עם ריכוזים שונים של USA300 או USA300 ∆Saer/S supernatants. (ג) שיעור propidium יודידה חיובית PMNs לאורך זמן אחרי דגירה עם USA300 או USA300 ∆Saer/S supernatant בריכוז הסופי של 1:110. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של לפחות 3 ניסויים נפרדים עם * p ≤ 0.05 ו * * p ≤ 0.005 כפי שנקבע על ידי דו מבחן t-זנבית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> איור 3: הזרימה cyPMNs try ניתוח של הבאים בעקבות phagocytosis של ס. האוראוס. (א) היחס של propidium יודיד חיובי PMNs 90 דקות לאחר phagocyציטוזה של ריכוזים שונים של USA300 או USA300 ∆Saer/S. (ב) ריכוז של זנים האורתיים בשימוש עבור הניסויים המוצגים בלוח A. Data מוצגים כממוצע ± SEM של 4 ניסויים נפרדים עם * p ≤ 0.01 כפי שנקבע על ידי דו-זנבית מבחן t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור של פולימורציטים ברורות מהדם האנושי השלם ושני מוסר שונה כי לכמת את הרעילות של סטייהולוקוקוס האורלנו נגד אלה תאים חיסוניים מולדים חשובים.

ככמת את רעילות הציטוהילווקיוס האורמית נגד פולימורציטים אנושיות

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

סטפילוקוקוס אוראוס הוא חיידק גרם חיובי המייצר מגוון רחב של גורמי ארסיות המקדמים פתוגנזה. אלה כוללים לויקוטוקסינים דו-רכיבים המשבשים את שלמות הממברנה של לויקוציטים פולימורפונוקלאריים, הנקראים גם PMNs או נויטרופילים. סרטון זה ממחיש את הבידוד של PMNs מדם שלם אנושי ושתי בדיקות ברורות לכימות ציטוקסיות S.aureus נגד תאים חיסוניים המולדים החשובים האלה.ניתן לבצע בדיקות אלה עם ציוד מעבדה סטנדרטי והם ניתנים להתאמה בקלות כדי לבחון היבטים אחרים של אינטראקציה פתוגן המארח. ניסויים אלה ישתמשו בדם שלם הנמשך מתורמים אנושיים וידרשו אישור של הוועדה המוסדית המתאימה או ועדת הבדיקה, כמו גם הצהרה כי הושגה הסכמה מדעת מכל המשתתפים. הצעד הראשון של הליך זה הוא בידוד של נויטרופילים באמצעות שיפוע צנטריפוגה וצפיפות.ראשית, להביא 50 מיליליטר של 3%dextran 0.9% נתרן כלורי, 35 מיליליטר של 0.9% נתרן כלורי, 20 מיליליטר של 1.8% נתרן כלורי, 12 מיליליטר של 1.077 גרם לכל פתרון ficoll מיליליטר ו 20 מיליליטר של מים לטמפרטורת החדר. מעבירים 25 מיליליטר של דם אנושי שלם שנמשך טרי לשני צינורות צנטריפוגה חרוטיים. שלבו 25 מיליליטר של דם שלם טרי עם נפח שווה ערך של 25 מיליליטר לטמפרטורת החדר, 3%dextran, 0.9% נתרן כלורי ביחס של אחד לאחד.מערבבים על ידי נדנדה בעדינות כל צינור חרוט 50 מיליליטר ולאחר מכן לתת לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר, יופיעו שתי שכבות נפרדות. מעבירים את השכבה העליונה של כל תערובת דם דקסטרן לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר.צנטריפוגה ב 450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם הפסקות נמוכות או לא. בזהירות שאף הן על טבעי להשליך מבלי להפריע כדורי התא. בעדינות resuspend כל גלולת תא בשני מיליליטר של 0.9% נתרן כלורי.שלב את כדורי resuspended בחרוט יחיד, 50 מיליליטר ולאחר מכן להוסיף את הנותרים 0.9% נתרן כלורי לנפח הסופי של 35 מיליליטר. בזהירות underlay 10 מיליליטר של 1.077 גרם לכל פתרון ficoll מיליליטר מתחת מתלי התא באמצעות פיפטה יד. לאחר ספינינג של 450 גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם הפסקות נמוכות או ללא הפסקות, שאף בעדינות את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא, כפי שהוצג קודם לכן.Lyse תאי הדם האדומים על ידי שימוש חוזר את גלולת התא ב 20 מיליליטר של מים בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה במשך 30 שניות. מיד להוסיף 20 מיליליטר של 1.8% נתרן כלורי מדגם צנטריפוגה ב 450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.בזהירות שאף על טבעי כפי שמוצג קודם לכן. בעדינות resuspend גלולת התא בשתי מיליליטר טמפרטורת החדר RPMI ולהמקם על קרח. לספור תאים באמצעות מד hemacytometer.יש להשתמש מחדש ב-PMNs מטוהרים בריכוז של פי 10 עד 7 תאים למיליליטר עם RPMI קר כקרח ולשמור על קרח. שלב 100 מיקרוליטרים של PMNs מטוהרים עם 300 מיקרוליטרים של DPBS, המכיל מיקרוליטר אחד של כתם יודיד פרופיד בשני צינורות ציטומטריה זרימה משוכפלים. לשליטה חיובית, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של 0.5% פתרון טריטון X-100 לאחד מצינורות ציטומיית הזרימה וערבבו היטב.השתמש בציטומטריית זרימה כדי למדוד את פיזור קדימה, פיזור צד וכתמים יודיד פרופידיום כדי לקבוע את הטוהר והשמות של PMNs מבודדים. יש להשתמש רק בהכנות PMN מעל 98%pure ומעל 95%propidium iodide שלילי. לפרוטוקול המתאר את הבידוד של סרום אנושי רגיל, עיין בכתב היד המלא.הכינו צלחת של 96 בארות לתיקטוסיות PMN על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של סרום אנושי מבודד של 20% מדולל ב- DPBS ל בארות בודדות שישמשו בהסקה זו. הקפד לכלול לפחות אחד שלילי שליטה היטב כי יקבל רק מדיה לפחות אחד שליטה חיובית היטב כי יקבל 0.05% טריטון X.Incubate את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את הבארות מקודד פעמיים עם 100 microliters של קרח קר DPBS ולה מניחים צלחת על קרח.הסר את כל DPBS שיורית מ בארות צלחת בעדינות להוסיף 100 microliters של PMNs אנושיים מטוהרים באחת פעמים 10 לתאים 7 למיליליטר לכל היטב מקודד. אפשר נויטרופילים מצופים להתיישב על ידי השארת אותם על קרח לפחות חמש דקות לפני השימוש במסיונות cytotoxicity הבאים. סעיף זה מתאר התרעה כי מכמת את הציטוקסיקיות של חלבונים חוץ תאיים המיוצרים על ידי staph aureus נגד PMNs אנושיים.תרבות S.aureus לילה בתקשורת המתאימה באמצעות אינקובטור רועד להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס יום לפני הניסוי. תת תרבות S.aureus על ידי ביצוע דילול אחד עד 100 של תרבויות חיידקים לילה עם מדיה טרייה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עד חיידקים להגיע לשלב צמיחה נייח מוקדם.לאחר חמש שעות של צמיחה, להעביר מיליליטר אחד של תת תרבות S.aureus לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, שאף על-טבעיים. להעביר על-טבעיים שאפו דרך מסנן מזרק מיקרון 0.22 לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר ולמקום על קרח.בצע דילול סדרתי של על-טבעיים עם מדיה קרה כקרח המשמשת לתרבות אאוראוס סטף. הוסף בעדינות דגימות על-טבעיות או מדיה שהושאלו לפקדים שליליים וחיוביים ל בארות בודדות של צלחת של 96 בארות המכילה PMNs על קרח, כמתואר קודם לכן. בעדינות צלחת רוק להפיץ על טבעי בארות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.בזמנים הרצויים, להסיר צלחת מן החממה מניחים על קרח. הוסף 300 מיקרוליטרים של DPBS קר כקרח המכיל מיקרוליטר אחד של יודיד פרופידיום לכל צינור ציטומטריה זרימה. להעביר את הדגימות לזרום צינורות ציטומטריה על קרח.עבור באר הבקרה החיובית, הוסף 20 מיקרוליטרים של 10% טריטון X לדגימה לפני המעבר לצינור ציטומטריה של זרימה. נתח כתמי פרופידיום יודיד של PMNs שיכורים באמצעות ציטומטריית זרימה. סעיף זה מתאר תדהמה כי מכמת את הציטוקסיקיות של S.aureus בעקבות phagocytosis על ידי PMNs אנושיים.עקומות גדילה המוגדרות על ידי הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר ואת הריכוז של חיידקים חייב להיקבע עבור זני Aureus Staph הרלוונטי לפני השימוש ב- assay זה. התחל תרבויות לילה של זנים S.aureus וחיידקים תת תרבות, כמתואר קודם לכן. לאחר aureus Staph subcultured הגיע באמצע צמיחה אקספוננציאלית, להעביר מיליליטר אחד של חיידקי תרבות ל 1.5 צינור microcentrifuge מיליליטר צנטריפוגה ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לשטוף S.aureus על ידי שאפת supernatant שלה מבלי להפריע את גלולה מחדש את החיידקים גלולה ב DPBS מיליליטר אחד. מערבולת הדגימות במשך 30 שניות. צנטריפוגה הדגימות ב 5, 000 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.כדי לחמצן את אוראוס Staph, תחילה תן שימוש חוזר את גלולת החיידקים במיליליטר אחד של 20% סרום אנושי. ואז דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה במשך 15 דקות. לשטוף שוורות Staph aureus בעקבות צנטריפוגה כפי שמוצג קודם לכן.מדולל זני Staph aureus oxenized לאחת פעמים 10 ליחידות יוצרות המושבה השמינית, CFUs למיליליטר, עם RPMI קר כקרח. Vortex המדגם במשך 30 שניות ומקום על קרח. אשר את הריכוזים של Aureus Staph המשמשים לתשקיף אלה על ידי ציפוי אחד עד 10 דילולים סדרתיים של חיידקים על אגר.הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטרים ל הבאר של כל זן Staph aureus, או RPMI לפקדים חיוביים ושליליים, ל-PMNs בצלחת של 96 באר על קרח החל מהשבב 1.14. צלחת סלע בעדינות להפיץ aureus סטף בארות. לסנכרן phagocytosis על ידי צלחת צנטריפוגה ב 500 גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס וצלחת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס מיד לאחר צנטריפוגה כמו זמן אפס.בנקודות הזמן הרצויות, לשים את הצלחת על הקרח ולהוסיף 200 microliters של קרח קר DPBS המכיל אחד microliter propidium יודיד לכל צינור cytometry זרימה ואז להעביר דגימות הצינור המתאים שלהם. נתח דגימות עבור כתמי פרופידיום יודיד באמצעות ציטומטריית זרימה כמתואר ב 2.8 ו 2.9. התמלול של לויקוטוקסינים דו-רכיביים שמכוונים ל-PMNs אנושיים על ידי Staph aureus דורש את מערכת הרכיבים SA או S2 כדי להדגים את התועלת של הראיה המתוארת לכימות ציטוקוקסיות של Staph aureus נגד PMNs אנושיים.ניסויים אלה בוצעו עם מבודד Staph aureus רלוונטי קלינית שזוהה כ- USA300 במוטנט מחיקה איסולוגניים של SA או S בזן זה. החלונית השמאלית מתארת PMNs מטוהרים והחלונית הימנית מתארת דגימות מזוהמות במכוון כדוגמה. PMNs מבודדים באמצעות ההליכים המתוארים בסעיף אחד של פרוטוקול זה היו מוכתמים יודיד פרופיד ונבדקו באמצעות ציטומטריה זרימה.חלקות פיזור קדימה וצד שימשו כדי לזהות זיהום של PMNs מטוהרים על ידי מונוציטים או לימפוציטים במשך שנים 1A ו 1B. שלמות PMN נקבע באמצעות כתמי יודיד פרופיד. באמצעות השיטה המתוארת של טיהור PMN אנושי, אנו יכולים לבודד באופן עקבי חמש פעמים 10 עד 7 עד 11 פעמים 10 כדי PMNs 8 כי הם מעל 98% טהור והם מעל 95%propidium יודיד שלילי.הציטוקסיות של חלבונים חוץ-תאיים המיוצרים על ידי USA300 והמוטנטים AsaeR/S נבדקו מול PMNs מטוהרים. ניסויים אלה מדגימים עלייה תלוית ריכוז בהכתמת פרופידיום יודיד של PMNs מטוהרים לאחר 30 דקות של שיכרון עם חלבונים חוץ תאיים המיוצרים על ידי USA300, אך לא עם מוטציית AsaeR /S. ניסויים נוספים הראו עלייה מתמדת בשיעור PMNs חיוביים פרופידיום יודיד בעקבות שיכרון על ידי ארה"ב300 חלבונים חוץ תאיים כי מישור לאחר כ 30 דקות.כתמי פרופידיום יודיד מינימליים של PMNs אנושיים צוינו בכל נקודות הזמן בעקבות חשיפה לחלבונים חוץ-תאיים המיוצרים על ידי מוטנט AsaeR/S. אחרון, ציטוקסיות של ארה"ב300 ו מוטציה AsaeR / S נגד PMNs בעקבות phagocytosis מסונכרן נבדק, עלייה תלויה בריכוז בשיעור של pmNs חיוביים פרופידיום יודיד נצפתה 90 דקות לאחר phagocytosis של ארה"ב300. באופן משמעותי פחות PMNs היו פרופידיום יודיד חיובי בעקבות phagocytosis של מוטציה AsaeR / S.ספירת ארה"ב300 ו AsaeR / S מוטציה inoculum שימש בכל אחד מהניסויים האלה הוכיחו כי הניגוד cytotoxicity בין זנים אלה לא נבע הבדלים בריכוז של חיידקים בשימוש. פרוטוקול זה מתאר את הטיהורים של PMNs מדם אנושי בשתי טכניקות נפרדות לכימות הציטוקסיות של S.aureus נגד תאים חיסוניים המולדים האלה. ההצלחה של הליכים אלה תהיה תלויה באיכות של PMNs מטוהרים ואת ההכנה המתאימה של חיידקים Staph aureus או supernatants.אנא התייעץ עם כתב היד המלא לקבלת נקודות חשובות שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הליכים אלה. USA300 הוא בידוד MRSA ארסי ואובדן AsaeR/S מפחית באופן דרמטי את שעתוק גורמי הארסיות שמכוונים ל-PMNs אנושיים, מה שהופך זנים אלה למודלים אידיאליים להשוואת ציטוקסיות באמצעות ההתמדה המתוארת. התאמת תנאי הגדילה, כמויות של על-טבעיים שנוספו, או יחס של חיידקים PMNs עשוי להידרש בעת שימוש זנים אחרים של Aureus Staph.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

אנדוקרדיטיס דגם ניסיוני של Methicillin עמיד<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) ב עכברוש

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...