Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
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इस काम को अमेरिका के स्वास्थ्य अनुदान एनआईएच के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था-1R56AI 135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 के साथ ही मोंटाना राज्य विश्वविद्यालय कृषि प्रयोग स्टेशन से धन, और मुर्डॉक चैरिटेबल ट्रस्ट से एक उपकरण अनुदान .

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	<li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., H&#246;&#246;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+invasion+and+evasion:+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus.">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li><li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses.">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+toxins.">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li><li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epic+Immune+Battles+of+History:+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus.">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li><li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytes.">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li><li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis.">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li><li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR/S+Dependent.">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+SaeR/S-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production.">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li><li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR/S-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus.">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li><li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence.">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).</li><li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocidins:+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors.">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li><li>B&#248;yum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils.">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

यह प्रोटोकॉल मानव रक्त से पीएमएन की शुद्धि और दो अलग-अलग परखों का वर्णन करता है जो इन महत्वपूर्ण जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के खिलाफ एस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिसिटी की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करते हैं। इन प्रक्रियाओं की सफलता शुद्ध पीएमएनएस की गुणवत्ता और इस रोगजनक द्वारा उत्पादित एस ऑरियस और बाह्य प्रोटीन की उचित तैयारी पर निर्भर करेगी। पीएमएनएस के अलगाव के लिए, एंडोटॉक्सिन संदूषण से मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करके, कोशिका तैयारियों का धीरे-धीरे इलाज करके और कोशिकाओं को उचित तापमान पर रखकर शुद्धिकरण के दौरान और बाद में पीएमएन सक्रियण को कम करना महत्वपूर्ण है। पीएमएन की सक्रियता का संकेत देने वाले संकेतों में शुद्धिकरण के दौरान कोशिकाओं का झुरमुट शामिल है और जब 5% से अधिक अलग कोशिकाएं प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए सकारात्मक दाग देती हैं। पीएमएन के अपेक्षाकृत कम जीवन काल के कारण, इन कोशिकाओं को मानव रक्त से अलग किया जाना चाहिए और उसी दिन परीक्षण किया जाना चाहिए। पीएमएनएस शुद्धि के बाद 3 घंटे से अधिक समय तक बर्फ पर छोड़ दिया जाए तो सहज एपोप्टोसिस के लक्षण प्रदर्शित करना शुरू कर देंगे। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि हर पीएमएन तैयारी का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाता है, जो आगे और साइड स्कैटर के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के साथ-साथ अलग कोशिकाओं की शुद्धता और अखंडता सुनिश्चित करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला है।
एस ऑरियस द्वारा द्वि-घटक ल्यूकोसाइडिन की अभिव्यक्ति इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख ों का उपयोग करके देखी जाने वाली समझौता पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के बहुमत के लिए जिम्मेदार है। इन विषाक्त पदार्थों और अन्य पोर बनाने वाले पेप्टाइड्स की अभिव्यक्ति में भिन्नता, जैसे कि फिनॉल-घुलनशील मॉड्यूलिन, एस ऑरियस के उपभेदों के बीच मानव पीएमएनएस के खिलाफ साइटोटॉक्सिकिटी में अंतर पैदा करेगा। एस ऑरियस उपभेदों के बीच इन विट्रो विकास के दौरान महत्वपूर्ण विचलन भी पोर बनाने वाले विषाक्त पदार्थों और बाद में साइटोटॉक्सिकिटी की अभिव्यक्ति को प्रभावित करेगा। इसके अलावा, phagocytosis परख में पीएमएनएस के लिए एस ऑरियस के अनुपात बाद में PMN प्लाज्मा झिल्ली सामर्यता(चित्रा 3ए)पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है और इन प्रयोगों के मध्य घातीय विकास चरण में परीक्षण प्रत्येक एस ऑरियस तनाव के समान सांद्रता की लगातार फसल की आवश्यकता है उपसंस्कृति बैक्टीरिया के ओडी६०० का उपयोग कर । इन बातों को देखते हुए, सभी उपभेदों के लिए विकास घटता को परिभाषित करना बहुत महत्वपूर्ण है, जिनकी साइटोटॉक्सिकिटी परख शुरू करने से पहले जांच की जाएगी। हम इन तरीकों का विश्लेषण करने के लिए इन तरीकों की सिफारिश नहीं करते हैं जो विट्रो में महत्वपूर्ण विकास अंतर प्रदर्शित करने वाले उपभेदों के साथ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिसिटी का विश्लेषण करते हैं।
USA300 एक उग्र MRSA अलग है कि मानव पीएमएनएस15 के खिलाफ अत्यधिक साइटोटॉक्सिक होने के लिए जाना जाता है और इस तनाव में SaeR/S के नुकसान नाटकीय रूप से कई द्वि-घटक ल्यूकोसाइडिन ्स के प्रतिलेखन को कम कर देता है जो मानव पीएमएन6,12को लक्षित करते हैं, जिससे इन उपभेदों को वर्णित साइटोटॉक्सकी की तुलना करने के लिए आदर्श मॉडल बनाते हैं। हालांकि, विभिन्न एस ऑरियस अलग-अलग के बीच व्यापक आनुवंशिक भिन्नता है और इन प्रोटोकॉलों में विस्तृत मापदंडों के परिणामस्वरूप अन्य एस ऑरियस उपभेदों का परीक्षण करते समय मानव पीएमएनएस के खिलाफ साइटोटॉक्सिकिटी में पर्याप्त परिवर्तन नहीं हो सकते हैं। विकास की स्थिति को सिलाई करना, सुपरनेटेंट की मात्रा, या पीएमएनएस में बैक्टीरिया का अनुपात एस ऑरियसके अन्य उपभेदों का उपयोग करके इन तरीकों के साथ सफलता के लिए आवश्यक हो सकता है।

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Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

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Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

स्टेफिलोकोकस ऑरियस एक ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु है जो मनुष्यों में बीमारियों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम पैदा करता है। यह प्रमुख रोगजनक कई उग्रता कारक पैदा करता है जो संक्रमण के विभिन्न पहलुओं में योगदान देते हैं। इनमें सतह के अणु शामिल हैं जो एस ऑरियस को विभिन्न प्रकार के मेजबान ऊतक1,बाह्य प्रोटीन का पालन करने की अनुमति देते हैं जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया2में हस्तक्षेप करते हैं, और विभिन्न प्रकार की मेजबान कोशिकाओं को लक्षित करने वाले स्रावित विषाक्त पदार्थों की एक सरणी3। इस रिपोर्ट में, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स (पीएमएनएस या न्यूट्रोफिल), मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्राथमिक प्रभावक कोशिकाओं के खिलाफ एस ऑरियस द्वारा उत्पादित बाह्य प्रोटीन की साइटोटॉक्सिकिसिटी की मात्रा निर्धारित करती है।
पीएमएन स्तनधारियों में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं। इन परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तेजी से निवासी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित खतरे के संकेतों के जवाब में मेजबान ऊतक अपमान की साइट पर भर्ती कर रहे है या रोगाणुओं पर हमला करने के लिए अद्वितीय यौगिकों द्वारा । इन अणुओं से और एक्सट्रावेशन के दौरान सक्रिय निवासी मेजबान कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क से 4,5को भड़काने वाली प्रक्रिया में पीएमएन की सक्रियता की स्थिति में वृद्धि होती है । प्रिमेड पीएमएनएस जो व्यथित ऊतक तक पहुंच गए हैं, तब संक्रमण की स्थापना को रोकने के लिए डिज़ाइन की गई महत्वपूर्ण जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को निष्पादित करते हैं। इनमें सूक्ष्मजीवों पर हमला करने वाले बाध्यकारी और आंतरिककरण या फागोसाइटोसिस शामिल हैं, जो शक्तिशाली रोगाणुरोधी यौगिकों5की बैटरी द्वारा सूक्ष्मजीव विनाश में संचयी अंतरकोशिकीय घटनाओं के झरने को ट्रिगर करते हैं।
पीएमएनएस मनुष्यों को रोगजनकों पर हमला करने से बचाने के लिए एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं और एस ऑरियस संक्रमण को रोकने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, यह जीवाणु उग्रता जीन की एक विस्तृत श्रृंखला पैदा करता है जो विभिन्न पीएमएन कार्यों में बाधा उत्पन्न करता है। इनमें एक्सट्रासेलुलर प्रोटीन शामिल हैं जो संकेत अणुओं की पहचान को अवरुद्ध करते हैं, ऊतक ों की मेजबानी करने के लिए आसंजन को रोकते हैं, रोगाणुरोधी यौगिकों के उत्पादन को रोकते हैं, और प्लाज्मा झिल्ली अखंडता से समझौता करते हैं4। एस ऑरियस कई दो घटक संवेदी प्रणालियों से सामूहिक इनपुट के माध्यम से इन उग्रता जीन की लौकिक अभिव्यक्ति आर्केस्ट्रा है कि विशिष्ट पर्यावरण संकेतों को पहचानते हैं । SaeR/S दो घटक प्रणाली संक्रमण6,7,8,9,10, 11के दौरान एस ऑरियस उग्रता जीन प्रतिलेखन का एक प्रमुख अप-रेगुलेटर है । विशेष रूप से, इस दो घटक प्रणाली को द्वि-घटक ल्यूकोसाइडिन के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है जो विशेष रूप से मानव पीएमएनएस12को लक्षित करते हैं ।
यह प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग वर्गों में टूटा हुआ है। पहला खंड एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके घनत्व ढाल केंद्रीकरण का उपयोग करके मानव रक्त से पीएमएन की शुद्धि का वर्णन करता है जिसे बोयम13 और नौसीफ14द्वारा स्थापित तरीकों से अनुकूलित किया गया है । दूसरा और तीसरा वर्ग एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिटी की जांच करने के लिए दो अलग-अलग तकनीकों का विस्तार करता है; एक एस ऑरियस द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन के साथ पीएमएन को नशे में धुत करता है जबकि दूसरा फेगोसाइटोसिस के बाद पीएमएनएस को नुकसान पहुंचाने के लिए जीवित बैक्टीरिया की क्षमता की जांच करता है । ये प्रक्रियाएं एस ऑरियस पोर बनाने वाले विषाक्त पदार्थों के कारण पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के नुकसान को मापने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करती हैं। प्रोपिडियम आयोडाइड एक डीएनए-बाध्यकारी फ्लोरोफोर है जो सामान्य रूप से कोशिका झिल्ली अभेद्य है लेकिन प्लाज्मा झिल्ली को पार कर सकता है जो एस ऑरियस विषाक्त पदार्थों द्वारा बाधित किया गया है। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण प्रोपिडियम आयोडाइड-पॉजिटिव पीएमएनएस के तेजी से मात्राकरण को एस ऑरियस उपभेदों के सापेक्ष साइटोटॉक्सिकिटी को मापने की अनुमति देता है। मैथिकिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस (एमआरएसए) की पहचान स्पंदित-फील्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रकार USA300 और इस तनाव में saeR/S के एक आइसोजेनिक विलोपन उत्परिवर्ती (USA3001ss/S) मॉडल के रूप में किया गया है ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि ये प्रक्रियाएं मानव पीएमएनएस के खिलाफ स्यारस की साइटोटॉक्सिकिटी को कैसे निर्धारित कर सकती हैं ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

स्टेफिलोकोकस ऑरियस ल्यूकोसिडिन की एक विस्तृत श्रृंखला को स्राव करने में सक्षम है जो बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स (पीएमएनएस या न्यूट्रोफिल) की झिल्ली अखंडता को लक्षित और बाधित करता है। यह प्रोटोकॉल मानव पीएमएनएस की शुद्धि और तीन विभिन्न वर्गों में पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिटी की मात्रा दोनों का वर्णन करता है। धारा 1 घनत्व केंद्रीकरण का उपयोग करमानव रक्त से पीएमएनएस और सीरम के अलगाव का विवरण देती है। धारा 2 इन शुद्ध मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस द्वारा उत्पादित बाह्य प्रोटीन की साइटोटॉक्सिकिसिटी का परीक्षण करती है। धारा 3 लाइव एस ऑरियसके फागोसाइटोसिस के बाद मानव पीएमएनएस के खिलाफ साइटोटॉक्सिकिटी को मापता है । ये प्रक्रियाएं प्रोपिडियम आयोडाइड, डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोफोर के साथ इलाज किए गए पीएमएनएस के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के व्यवधान को मापती हैं जो कोशिका झिल्ली अभेद्य है। सामूहिक रूप से, इन तरीकों को प्राथमिक मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिटी का तेजी से परीक्षण करने का लाभ होता है और मेजबान-रोगजनक बातचीत के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

हमने यह प्रदशत किया है कि पिछलेअध्ययनोंमें उत्पन्न इस तनाव में एसएईआर/एस (USA30001s/S) द्वारा मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिसिटीको अपेक्षाकृत निर्धारित करने के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग कैसे किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल की धारा 1 में वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करके अलग-थलग पीएमएनएस को प्रोपिडियम आयोडाइड से दाग दिया गया और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके जांच की गई। आगे और साइड स्कैटर भूखंडों का उपयोग मोनोसाइट्स या लिम्फोसाइट्स(चित्र ा 1ए, बी)और पीएमएन अखंडता द्वारा शुद्ध पीएमएन के संदूषण को समझाने के लिए किया गया था, जो प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला(चित्रा 1सी)का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। मानव पीएमएन शुद्धिकरण की वर्णित विधि लगातार 0.5 x 107 से 1 x 108 पीएमएनएस प्राप्त कर सकती है जो और 98% शुद्ध हैं और और हैं >95% प्रोपिडियम आयोडाइड नकारात्मक।
USA300 और USA3001saeR/S द्वारा उत्पादित बाह्य प्रोटीन की साइटोटॉक्सिकिसिटी का परीक्षण इस प्रोटोकॉल की धारा 2 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद शुद्ध पीएमएनएस(चित्रा 2)के खिलाफ किया गया था । ये प्रयोग USA300(चित्रा 2बी)द्वारा उत्पादित अतिरिक्त प्रोटीन के साथ नशे के 30 न्यूनतम के बाद शुद्ध पीएमएनएस के प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला में एकाग्रता पर निर्भर वृद्धि को प्रदर्शित करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि SaeR/S दो घटक प्रणाली मानव पीएमएनएस6,10,11,16को लक्षित करने वाले कई द्वि-घटक ल्यूकोसाइडिन की अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है । इन पिछले निष्कर्षों के साथ अनुकूल, बहुत कम प्रोपिडियम आयोडाइड-सकारात्मक पीएमएनएस USA3000AsaeR/S (चित्रा 2बी)द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन के संपर्क के बाद पता चला । इसके अलावा प्रयोगों ने USA300 एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन द्वारा नशे के बाद lysed पीएमएनएस के अनुपात में लगातार वृद्धि का प्रदर्शन किया जो लगभग 30 मिन(चित्रा 2सी)के बाद पठार ी था । USA3000SAR/S द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन के संपर्क मेंआने के बाद मानव पीएमएनएस की न्यूनतम लिसिस को सभी समय पर नोट किया गया था । ये परिणाम मानव पीएमएनएस के खिलाफ एक्स्टोसेलर एस ऑरियस प्रोटीन द्वारा साइटोटॉक्सिकिसिटी के सापेक्ष मात्रा के लिए इस परख की उपयोगिता को दर्शाते हैं।
हमने इस प्रोटोकॉल की धारा 3(चित्रा 3)में वर्णित फैगोसाइटोसिस के बाद मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिपरी परख का उपयोग करके USA300 और USA3000ss/S का परीक्षण किया। प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक पीएमएनएस के अनुपात में एकाग्रता पर निर्भर वृद्धि USA300(चित्रा 3ए)के फागोसाइटोसिस के बाद 90 न्यूनतम देखी गई थी। पीएमएनएस के अनुपात में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई जो USA3001S/S(चित्रा 3ए)के फागोसाइटोसिस के बाद प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक थे, अन्य परिणामों का समर्थन करते हैं जो संकेत देते हैं कि SaeR/S दो घटक प्रणाली मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिसिटी के लिए महत्वपूर्ण है(चित्रा 2)7,11। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है और चित्रा 3एमें प्रदर्शित किया गया है, एस ऑरियस एकाग्रता में अंतर का phagocytosis के बाद पीएमएन lysis पर एक स्पष्ट प्रभाव पड़ता है। इन प्रयोगों में से प्रत्येक में इस्तेमाल USA300 और USA3001saeR/S inoculum की गणना से पता चला कि इन उपभेदों के बीच साइटोटॉक्सिकिटी में इसके विपरीत इस्तेमाल बैक्टीरिया की एकाग्रता में अंतर के कारण नहीं था(चित्रा 3बी)। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि कैसे phagocytosis के बाद मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिपरी परख का उपयोग मानव पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली अखंडता से समझौता करने के लिए विभिन्न एस ऑरियस उपभेदों की क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> चित्रा 1: शुद्ध पीएमएनएस का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री डॉट भूखंड(ए)शुद्ध मानव पीएमएनएस और(बी)पीएमएनएस जो जानबूझकर परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से दूषित हो गए हैं। (ग)प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम न्यूनतम प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला (<1%) 0.05% ट्राइटन एक्स-100 (छायांकित लाल) के साथ इलाज पीएमएनएस की तुलना में शुद्ध पीएमएनएस (छायांकित ग्रे) की। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> चित्रा 2: एस ऑरियसद्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन के साथ नशे में पीएमएनएस का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (क)मीडिया नियंत्रण (छायांकित नीला) के साथ ऊष्मायन के 30 मिन के बाद प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ दाग ित पीएमएनएस के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम, 1:110 (छायांकित ग्रे), या ०.०५% ट्राइटन एक्स-१०० (छायांकित लाल) की अंतिम एकाग्रता पर USA300 supernatant फ़िल्टर । (ख)USA300 या USA300,saeR/S supernatants की विभिन्न सांद्रता के साथ ऊष्मायन के 30 min के बाद प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक पीएमएनएस का अनुपात । (ग)यूएसए 300 या USA300 के साथ ऊष्मायन के बाद समय के साथ प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक पीएमएनएस का अनुपात 1:110 की अंतिम एकाग्रता परsaeR/S supernatant । डेटा को दो पूंछ वाले टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित * पी * 0.05 और ** पी के साथ कम से कम 3 अलग-अलग प्रयोगों के मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> चित्रा 3: एस ऑरियसके फागोसाइटोसिस के बाद पीएमएनएस का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (क)प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक पीएमएनएस 90 मिन का अनुपात USA300 या USA300 की विभिन्न सांद्रता के phagocytosis के बाद ,saeR/S. (B)पैनल ए में दिखाए गए प्रयोगों के लिए इस्तेमाल ऑपोनाइज्ड एस ऑरियस उपभेदों की एकाग्रता के रूप में प्रस्तुत किया जाता है * p =0.01 के साथ 4 अलग प्रयोगों के मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं * p <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

यह प्रोटोकॉल पूरे मानव रक्त और दो अलग-अलग परखों से पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स की शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन करता है जो इन महत्वपूर्ण जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के खिलाफ स्टेफिलोकोकस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिटी की मात्रा निर्धारित करता है।

मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स के खिलाफ स्टेफिलोकस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिटी का आकलन

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

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