Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
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이 작품은 미국 국립 보건원 NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM1115371뿐만 아니라 몬태나 주립 대학 농업 실험 스테이션의 기금, 머독 자선 신탁의 장비 보조금에 의해 지원되었습니다. .

건강한 기증자로부터 분리 된 정맥 혈액은 몬태나 주립 대학의 인간 과목에 대한 기관 검토 위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수집되었습니다. 모든 기부자는 이 연구에 참여하기 위해 서면 동의를 제공했습니다.
1. 인간 다형성 핵 백혈구의 정화 및 인간 혈청의 분리
참고: 모든 시약은 시판되는 내독소 검출 키트를 사용하여 내독소의 존재를 정기적으로 확인해야 하며 PMN의 원치 않는 프라이밍을 방지하기 위해 <25.0 pg/mL 내독소가 포함되어야 합니다.
<ol><li>50 mL의 3% dextran-0.9% NaCl (w/v), 35 mL 의 0.9% NaCl (w/v), 20 mL 의 1.8% NaCl (w/v), 12 mL의 1.077 g/mL 밀도 그라데이션 솔루션, 그리고 20 mL의 주입-관개-실내 온도 온도.</li>
	<li>인간 혈청을 분리하기 위해, 37°C에서 항응고제 없이 30분 동안 15 mL 유리 관에서 갓 뽑은 인간 혈액의 4 mL을 배양하였다. 배양 후, 원심분리기 샘플을 실온에서 10분 동안 2,000-3,000 × g로 시료합니다. 상부 혈청 층을 신선한 15 mL 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>25 mL의 갓 그려진 헤파린화 (1000 단위 / mL) 전체 인간의 혈액과 실온 3 % dextran-0.9 % NaCl (1 : 1 비율)을 두 개의 복제 50 mL 원추 형 원심 분리튜브 (튜브 당 총 부피 50 mL)에 결합하십시오. 각 50 mL 원두 튜브를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 실온에서 30 분 동안 방치하십시오.</li>
	<li>실온에서 배양 한 후 두 개의 별도의 층이 나타납니다. 각 덱스란-혈액 혼합물의 최상층을 새로운 50mL 원추형 튜브와 원심분리기를 450 x g에서 10분 동안 저온 또는 무브레이크로 실온에서 옮깁니다.</li>
	<li>조심스럽게 두 상피제를 흡인하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 폐기하십시오. 실온 0.9% NaCl의 2 mL에서 각 세포 펠릿을 부드럽게 재중단하고, 단일 50 mL 원엽 튜브에 재부유 된 펠릿을 결합한 다음 나머지 0.9 % NaCl (최종 부피 35 mL)을 추가하십시오.</li>
	<li>핸드 파이펫을 사용하여 셀 현탁액 아래에 1.077 g/mL 밀도 그라데이션 용액의 실온 10 mL을 조심스럽게 언더레이합니다. 브레이크가 낮거나 없는 실온에서 450 x g에서 30분 동안 회전합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상류를 부드럽게 흡인합니다. 상급제는 앞서 설명한 바와 같이 수집될 수 있는 말초 혈액 단핵 세포를 함유할 것이다14.</li>
	<li>실온의 20 mL에서 세포 펠릿을 재중단하여 적혈구를 용해시. 튜브를 30s로 흔들어 부드럽게 섞습니다. 적혈구의 포만은 탁도의 뚜렷한 감소를 동반할 것입니다.</li>
	<li>즉시 실온에서 10 분 동안 450 × g에서 1.8 % NaCl (실온 [RT])의 20 mL를 추가하고 원심 분리기 샘플을 추가하십시오. 참고: PMN 수율을 최대화하고 PMN 용해 및/또는 활성화를 방지하기 위해 적혈구 용해 후 PMN이 물에 만 남는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 상류를 흡인. RT RPMI 1640 배지의 2 mL에서 세포 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단하고 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 얼음으로 차가운 RPMI로 1 x 107 셀/mL의 농도로 정제된 PMN을 다시 일시 중단하고 얼음위에 보관하십시오.</li>
	<li>100 μL의 정제된 PMN(1 x 106 세포)과 300 μL의 얼음 차가운 덜베코의 인산 완충 식염수(DPBS)를 결합하여 2개의 복제 유동 세포 분석 튜브에 1 μL의 프로피듐 요오드하드 얼룩을 함유합니다. 플라즈마 멤브레인 손상에 대한 긍정적 인 제어를 위해, 0.5 % 트리톤 X-100 용액의 40 μL을 유세포 분석 튜브 중 하나에 넣고 철저히 혼합하십시오.</li>
	<li>유세포분석기를 사용하여 정제된 세포의 순방향 산란, 측면 산란 및 프로피듐 요오드화 염색(535/617 nm에서 여기/방출 최대값)을측정합니다(그림 1). 참고 : 전방 및 측면 산란 분석은 림프구와 단핵구의 원치 않는 인구를 식별합니다. 프로피듐 요오드화는 손상된 혈장 막과 프로피듐 요오드화 양성 세포의 발음 인구를 가지고 정제 된 PMN으로 만 얼룩세포를 사용해서는 안됩니다. 이러한 연구에서, 정제된 PMN은 정제된 세포의 >98%와 프로피듐 요오드화에 대해 5% 염색된 양성으로 구성된 경우에만 사용되었습니다.</li>
	<li>DPBS로 희석된 20% 절연 인간 혈청의 100 μL로 이 분석에서 사용될 개별 우물을 코팅하여 PMN 세포 독성 분석술에 대한 96 웰 플레이트를 준비합니다. 참고: 플라스틱이나 유리에 직접 PMN을 도금하면 세포가 활성화됩니다. 0.05% Triton X-100을 수신할 미디어와 적어도 하나의 포지티브 컨트롤웰만 수신하는 적어도 하나의 네거티브 컨트롤을 포함해야 합니다.</li>
	<li>37 °C에서 30 분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 코팅된 우물을 얼음으로 차가운 DPBS로 두 번 씻어 여분의 혈청을 제거합니다. 접시를 거꾸로 가볍게 두드려 잔여 DPBS를 제거하고 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>1 x 107 셀/mL에서 정제된 인간 PMN 100 μL을 코팅된 각 코팅(1 x 106 PMN/well)에 부드럽게 추가합니다. PMN이 적어도 5 분 동안 얼음에 접시를 배양하여 우물에 정착 할 수 있도록. 각 우물에서 세포의 균일 한 분포를 허용하고 PMN의 원치 않는 활성화를 방지하기 위해 얼음에 두고 플레이트 수준을 유지합니다.</li>
</ol>2. 인간 다형성 핵 백혈구에 대한 S. 아우레우스 세포 외 단백질의 세포 독성 분석
<ol><li>배양 S. 아우레우스를 37°C에서 설정된 교반 인큐베이터를 사용하여 트립틱 콩 국물(TSB)에서 하룻밤 동안. 이러한 연구를 위해, 별도의 150 mL Erlenmeyer 플라스크에서 TSB의 20 mL은 S. 아우레우스 균주 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S의 냉동 배양물로 접종하고 250 rpm에서 흔들림으로 약 14시간 동안 성장시켰다.</li>
	<li>하위 배양 S. 아우레우스는 신선한 배지로 하룻밤 세균 배양의 1:100 희석을 수행함으로써. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달할 때까지 37°C에서 배양합니다. 참고: 이러한 실험의 경우, 150 mL 에를렌마이어 플라스크에서 20 mL의 트립틱 대두 국물을 200 μL의 하룻밤 배양 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S로 접종하고 37°C에서 5시간 동안 250 rpm에서 흔들면서 배양하였다.</li>
	<li>박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달하면, 1mL의 배양 된 S. 아우레우스를 실온에서 5 분 동안 5,000 × g에서 1.5 mL 미세 원심 분리튜브 및 원심 분리지로 옮긴다.</li>
	<li>원심 분리 후, 상급체를 3 mL 주사기로 옮긴다. 0.22 μm 필터를 통해 얼음에 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 초자연자를 전달합니다.</li>
	<li>배양S아우레우스에사용되는 얼음 차가운 매체로 초월제의 연쇄 희석을 수행한다. 참고: 표시된 실험의 경우, USA300 및 USA300ΔsaeR/S의 초자연자는 얼음으로 차가운 TSB로 4회 연속 1/2 로그 희석을 거쳤습니다.</li>
	<li>1.15단계에서 얼음에 PMN이 함유된 96웰 플레이트의 개별 우물에 상수 샘플 또는 미디어만(음수 및 양성 대조군)을 부드럽게 추가합니다. 이러한 실험을 위해, USA300 또는 USA300ΔsaeR/S 상급 샘플의 10 μL을 각 웰에 첨가하였다. 부드럽게 바위 플레이트는 우물에 초자연적 인 물질을 분배하고 37 ° C에서 배양합니다.</li>
	<li>원하는 시간에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 얼음에 배치합니다. 40 μL의 0.5% 트리톤 X-100을 포지티브 컨트롤에 잘 추가합니다.</li>
	<li>시료를 각 우물에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 플레이트에 부착된 모든 PMN을 완전히 제거한 다음, 프로피듐 요오드화물 1 μL로 300 μL의 얼음 차가운 DPBS를 함유한 얼음에 세포 분석 튜브를 전달하기 위해 샘플을 이송합니다.</li>
	<li>유세포분석(그림2A)를사용하여 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 비율을 측정하였다. DNA에 결합하면, 프로피듐 요오드화물은 535/617 nm에서 여기 /방출이 있습니다.</li>
</ol>3. S. 식세포증 다음 인간 다형성 핵 백혈구에 대한 아우레우스 세포 독성 분석
참고: 600 nm (OD600)에서광학 밀도에 의해 정의된 성장 곡선 및 박테리아의 농도는 이 분석실험을 시작하기 전에 시험될 S. 아우레우스 균주에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이러한 실험의 성공은 하위 배양 박테리아의 OD600을 사용하여 중간 기하수성장 단계에서 시험된 각 S. 아우레우스 균주의 동일한 농도의 일관된 수확을 요구한다.
<ol><li>단계 2.1.1 및 2.1.2에 기재된 바와 같이 S. 아우레우스 균주 및 하위 배양 박테리아의 하룻밤 배양을 시작한다.</li>
	<li>수확 하위 배양 S. 아우레우스는 1mL의 배양 박테리아를 1.5 mL 의 미세원원지 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 5분 동안 5분 동안 원심분리를 하여 중간 기하급수적 성장에 도달하였다. 참고 : 우리의 성장 조건하에서, USA300 및 USA300ΔsaeR /S는 약 135 분 의 인큐베이션6후 중간 기하급수적 성장 단계에 도달했습니다.</li>
	<li>상급자를 흡입하고, DPBS 의 1 mL에서 펠릿 박테리아를 재중단하고, 30초 동안 샘플을 소용돌이치며, 실온에서 5분 동안 5,000 ×g에서 원심분리를 하여 원심분리를 세척합니다.</li>
	<li>DPBS로 희석한 20% 인간 혈청의 1 mL에서 세균 펠릿을 재중단하고 37°C에서 교반하여 15분 동안 배양함으로써 S. 아우레우스를 Opsonize.</li>
	<li>원심분리기는 실온에서 5분 동안 5,000 x g에서 박테리아를 불협화시켰다. 상급자를 흡입하여 원심 분리 후 S. 아우레우스를 세척하고, 1 mL DPBS에서 펠릿 박테리아를 다시 일시 중단한 다음, 세균 펠릿이 완전히 분해될 때까지 샘플을 소용돌이치며 추가 30초가 추가로 추가로 증빙합니다. 실온에서 5 분 동안 5,000 × g의 원심 분리기 박테리아.</li>
	<li>1 mL RPMI에서 opsonized S. 아우레우스 균주를 다시 일시 중단하고, 세균 펠릿이 완전히 분해 될 때까지 샘플을 소용돌이치며, 추가로 30 초를 얼음에 박테리아를 놓습니다.</li>
	<li>얼음 차가운 RPMI로 원하는 농도로 opsonized S. 아우레우스 균주를 희석. 30 초 동안 소용돌이와 얼음에 배치합니다.</li>
	<li>트립틱 콩 한천에 박테리아의 1:10 직렬 희석을 도금하여 opsonized S. 아우레우스의 농도를 확인합니다. 참고: 이 분석실험에 사용된 박테리아의 농도 차이는 후속 PMN 혈장 막 투과성에 큰 영향을 미칠 수 있기때문에(그림 3A),테스트된 각 균주의 농도가 모든 실험에 대해 결정되고 균주 간에 동등한 것이 매우 중요합니다.</li>
	<li>1.14단계에서 얼음 위에 있는 96웰 플레이트의 PMN에 각 S. 아우레우스 균주 또는 RPMI(양성 및 음성 대조물)의 100 μL/well을 부드럽게 추가합니다. 부드럽게 바위 판은 우물에 S. 아우레우스를 배포합니다.</li>
	<li>4 °C15에서8 분 동안 500 × g에서 플레이트를 원심 분리하여 식세포증을 동기화합니다. 원심분리 직후 37°C에서 배양 플레이트(T = 0).</li>
	<li>원하는 시간에 인큐베이터에서 접시를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 40 μL의 0.5% 트리톤 X-100을 포지티브 컨트롤에 잘 추가합니다.</li>
	<li>샘플을 각 우물에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 플레이트에 부착된 모든 PMN을 완전히 제거한 다음, 프로피듐 요오드화물 1 μL로 200 μL의 얼음 차가운 DPBS를 함유한 얼음에 세포 분석 튜브를 전달하기 위해 샘플을 이송합니다.</li>
	<li>2.9단계에서 설명한 바와 같이 유세포분석을 사용하여 프로피듐 요오드화물 염색시 샘플을 분석합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 인간 혈액에서 PMN의 정제를 설명하고 이러한 중요한 선천적 면역 세포에 대한 S. 아우레우스의 세포 독성을 정량화하기 위해 프로피듐 요오드화물을 사용하는 두 가지 뚜렷한 분석. 이 절차의 성공은 정제된 PMN의 질 및 이 병원체에 의해 생성된 S. 아우레우스 및 세포외 단백질의 적당한 준비에 달려 있습니다. PMN의 격리를 위해, 내독소 오염이 없는 시약을 사용하고, 세포 제제를 부드럽게 치료하고, 세포를 적절한 온도로 유지함으로써 정화 중 및 정화 후 PMN 활성화를 최소화하는 것이 중요합니다. PMN의 활성화를 나타내는 표시는 정화 도중 세포의 응집 및 때 5% 이상 은엽모화물을 위한 단송된 세포의 얼룩을 포함합니다. PMN의 상대적으로 짧은 수명 때문에, 이 세포는 인간적인 혈액에서 격리되고 같은 날에 시험되어야 합니다. PMN은 정화 후 3 시간 이상 얼음에 방치하면 자발적인 사멸의 징후를 나타내기 시작합니다. 앞서 언급했듯이, 모든 PMN 제제는 분리된 세포의 순도와 무결성을 보장하기 위해 전방 및 측면 산란뿐만 아니라 프로피듐 요오드화물 염색의 유세포 분석 분석을 사용하여 신중하게 평가되는 것이 매우 중요합니다.
S. 아우레우스에 의한 이중 성분 류코시딘의 발현은 이 프로토콜에 기재된 분석방법을 사용하여 관찰되는 손상된 PMN 혈장 막 무결성의 대부분에 대한 책임이 있다. 이러한 독 소와 다른 기공 형성 펩 티 드의 발현의 변화, 페놀 수용성 모듈 린 등, S. 아우레우스의 균주 사이 인간 PMN에 대 한 세포 독성에 차이 생산할 것 이다. S. 아우레우스 균주 사이 생체 외 성장 중 상당한 편차 또한 pore 형성 독 소와 후속 세포 독성의 발현에 영향을 미칠 것 이다. 또한, 식세포분석에서 S. 아우레우스와 PMN의 비율은 후속 PMN 혈장막 투과성에 큰 영향을 미치며(도3A)이러한 실험은 하위 배양 박테리아의 OD600을 사용하여 중간 기하급수성장 단계에서 시험된 각 S. 아우레우스 균주의 동일한 농도의 일관된 수확을 필요로 한다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 세포 독성 검사를 시작하기 전에 검사 될 모든 균주에 대한 성장 곡선을 정의하는 것이 매우 중요합니다. 우리는 시험관에서 중요한 성장 차이를 나타내는 균주를 가진 S. 아우레우스 세포 독성을 분석하기위한 이 방법을 추천하지 않습니다.
USA300은 인간 PMN15에 대하여 매우 세포독성이 있는 것으로 알려져 있는 악성 MRSA 분리종소이며, 이 균주에서 SaeR/S의 손실은 인간 PMN6,12를표적으로 하는 수많은 이중 성분 백혈구의 전사를 극적으로 감소시키며, 이러한 균주는 세포독성을 비교하여 세포독성을 비교하는 이상적인 모델을 만드는 것으로 설명된다. 그러나, 다른 S. 아우레우스 격리 사이 광대한 유전 변이가 있고 이 프로토콜에 상세한 매개변수는 그밖 S. 아우레우스 긴장을 시험할 때 인간 PMN에 대하여 세포 독성에 있는 실질적인 변경 귀착되지 않을 수 있습니다. 성장 조건을 맞추는, 추가된 상피제의 부피, 또는 PMN에 박테리아의 비율은 S. 아우레우스의그밖 긴장을 사용하여 이 방법을 가진 성공을 위해 요구될 수 있습니다.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

황색포도상구균은 인간에 있는 질병의 넓은 스펙트럼을 일으키는 원인이 되는 그람 양성 박테리아입니다. 이 저명한 병원체는 감염의 다른 양상에 기여하는 수많은 독성 요인을 일으킵니다. 이들은 S. 아우레우스가 숙주 조직1의다른 모형에 고착하는 것을 허용하는 표면 분자, 호스트 면역 반응을 방해하는 세포외 단백질2,및 호스트 세포의 다른 모형을 표적으로 하는 분비된 독소의 배열3을포함합니다. 이 보고에서는, 우리는 인간 다형성 핵 백혈구 (PMN 또는 호중구)에 대하여 S. 아우레우스에 의해 생성된 세포외 단백질의 세포 독성을 정량화하는 방법을 기술합니다, 호스트 타고난 면역 반응의 1 차이펙터 세포.
PMN은 포유류에서 가장 풍부한 백혈구입니다. 이 순환하는 면역 세포는 상주 세포에 의해 또는 침입 하는 미생물에 고유한 화합물에 의해 생성 된 위험 신호에 대 한 응답에서 호스트 조직 모욕의 사이트에 신속 하 게 모집. 이러한 분자로부터의 세포외 입력은 외의 접촉에서 활성화된 상주 숙주 세포와의 직접적인 접촉에서4,5로알려진 공정에서 PMN의 활성화 상태를 증가시다. 고민 조직에 도달 한 Primed PMN 다음 감염의 설립을 방지 하도록 설계 된 중요 한 타고난 면역 반응을 실행. 이들은 강력한 항균 화합물의 배터리에 의해 미생물 파괴에서 누적되는 세포내 사건의 연속을 유발하는 침입 미생물의 결합 및 내화, 또는 식균증을 포함한다5.
PMN은 침입 병원균으로부터 인간을 보호하는 데 필수적인 역할을 하며 S. 아우레우스 감염 예방에 특히 중요합니다4. 그러나, 이 박테리아는 다른 PMN 기능을 방해 하는 독성 유전자의 넓은 범위를 생산. 이들은 신호 분자의 인식을 차단하는 세포외 단백질을 포함, 숙주 조직에 접착을 방지, 항균 화합물의 생산을 억제, 혈장 막 무결성을 손상4. S. 아우레우스는 특정 환경 단서를 인식하는 다중 2 성분 감각 시스템에서 집합적인 입력을 통해 이 독성 유전자의 시간적 표현을 조율합니다. SaeR/S 2-성분 시스템은 감염 시 S. 아우레우스 독성 유전자 전사의 주요 업 레귤레이터인6,7,8,9,10,11이다. 특히, 이러한 2성분 시스템은 인간 PMN12를특이하게 표적으로 하는 이중 성분 류코시딘의 생산에 중요한 것으로 나타났다.
이 프로토콜은 세 가지 섹션으로 나뉩니다. 제 1 항은 Bøyum13 및 Nauseef14에의해 확립된 방법으로부터 적응된 프로토콜을 사용하여 밀도 구배 원심분리를 사용하여 인간의 혈액으로부터 PMN의 정제를 설명한다. 두 번째와 세 번째 섹션은 S. 아우레우스 세포 독성을 검사하는 두 가지 다른 기술을 자세히 설명합니다. 하나는 S. 아우레우스에 의해 생성 된 세포 외 단백질PMN을 취하게하고 다른 하나는 식세포증 다음 PMN을 손상시키는 살아있는 박테리아의 능력을 검사합니다. 이 절차는 S. 아우레우스 기공 형성 독소에 기인한 PMN 혈장 막 무결성의 손실을 측정하기 위하여 프로피듐 요오드화물을 이용합니다. 프로피듐 요오드화물은 일반적으로 세포막 불투과성이지만 S. 아우레우스 독소에 의해 중단 된 혈장 막을 교차 할 수있는 DNA 결합 형광파입니다. 유세포 분석 분석은 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 신속한 정량화를 통해 S. 아우레우스 균주의 상대적인 세포 독성을 측정할 수 있게 한다. 맥박필드 겔 전기영동유형 USA300 및 saeR/S의 이원성 결실 돌연변이체로 확인된 메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA)는 이러한 시술이 인간에 대한 세포독성을 정량화하는 방법을 입증하는 모델로 사용되어 왔다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

황색포도상구균은 다형성 핵 백혈구 (PMN 또는 호중구)의 막 무결성을 표적으로 하고 방해하는 백혈구의 넓은 범위를 은닉할 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 PMN의 정제와 세 가지 다른 섹션에서 PMN에 대한 S. 아우레우스 세포 독성의 정량화를 모두 설명합니다. 섹션 1은 밀도 원심분리를 사용하여 인간의 혈액으로부터 PMN과 혈청의 분리를 자세히 설명합니다. 섹션 2는 S. 아우레우스가 정제된 인간 PMN에 대해 생산한 세포외 단백질의 세포 독성을 시험합니다. 섹션 3은 살아있는 S. 아우레우스의식균증에 따라 인간 PMN에 대한 세포 독성을 측정합니다. 이러한 절차는 세포막 불투과성 인 프로피듐 요오드화물로 처리 된 PMN의 유세포 분석 분석을 사용하여 S. 아우레우스 류코시딘에 의한 PMN 혈장 막 무결성의 중단을 측정합니다. 집합적으로, 이들 방법은 1차 인간 PMN에 대하여 S. 아우레우스 세포 독성을 빠르게 테스트하는 장점이 있으며 호스트 병원체 상호작용의 다른 측면을 연구하기 위해 용이하게 적응될 수 있다.

우리는 상기서술한 절차가 MRSA PFGE 형 USA300 및 이 균주에서 saeR/S의 이소원성 결실 돌연변이를 사용하여 인간 PMN에 대한 S. 아우레우스의 세포독성을 상대적으로 정량화하는 데 사용될 수 있는 방법을 입증하였다(USA300ΔsaeR/S)는이전 연구에서 생성된6. 이 프로토콜의 섹션 1에 기재된 절차를 사용하여 단리된 PMN은 프로피듐 요오드화물로 염색하고 유세포측정을 사용하여 검사했다. 전진 및 측 산란플롯은 단핵구 또는 림프구에 의한 정제된 PMN의 오염을 예시하기 위해 사용되었고(도1A, B)및 PMN 무결성은 프로피듐 요오드화 염색을 사용하여 결정하였다(도1C). 인간 PMN 정제의 설명된 방법은 일관되게 0.5 x 107 내지 1 x 108 PMN을 생성할 수 있으며 이는 >98% 순수하고 >95% 프로피듐 요오드화물 음성이다.
USA300 및 USA300ΔsaeR/S에 의해 생성된 세포외 단백질의 세포독성은 이 프로토콜의 섹션 2에 기재된 절차에 따라 정제된 PMN에 대해 시험되었다(그림2). 이러한 실험은 USA300에 의해 생성된 세포외 단백질을 30분 간 취한 후 정제된 PMN의 프로피듐 요오드화물 염색의 농도 의존적 증가를 입증한다(도2B). 이전 연구는 SaeR/S 2 성분 시스템이 인간 PMN6,10,11,16을대상으로 하는 수많은 이중 성분 류코시딘의 발현에 중요하다는 것을 입증했다. 이러한 이전 발견과 일치, 아주 소수의 프로피듐 요오드화 양성 PMNUSA300ΔsaeR/S에 의해 생성 된 세포 외 단백질에 노출 다음 검출 되었다(그림 2B). 추가 실험은 약 30 분 후에 고원 된 USA300 세포 외 단백질에 의한 중독 다음 lysed PMN의 비율이 꾸준히 증가한다는 것을 입증했습니다(그림 2C). 인간 PMN의 최소 용해는 USA300ΔsaeR/S에의해 생성된 세포외 단백질에 노출된 후 모든 시점에서 지적되었다. 이러한 결과는 인간 PMN에 대한 세포외 S. 아우레우스 단백질에 의한 세포독성의 상대적 정량화에 대한 이 분석의 유용성을 보여준다.
우리는 이 프로토콜의 섹션 3에 기재된 식세포증 다음의 인간 PMN에 대한 S. 아우레우스 세포 독성 분석실험을 사용하여 USA300 및 USA300ΔsaeR/S를 시험하였다(그림3). 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 농도 의존적 증가는 USA300의 식세포증 후 90분 후에 관찰되었다(도3A). USA300ΔsaeR/S의 식세포증에 이어 요오드화 양성으로 프로피듐 요오드화 양성이었던 PMN의 비율이 현저한 감소로 관찰되었으며, SaeR/S 2 성분 시스템을 나타내는 다른 결과를 뒷받침하는 것은 인간 PMN에 대한 S. 아우레우스의 세포독성에중요하다(도2)7,11. 앞서 언급하고 그림 3A에서입증된 바와 같이, S. 아우레우스 농도의 차이는 식세포증 다음 PMN 용해에 뚜렷한 영향을 미친다. 이러한 각 실험에서 사용된 USA300 및 USA300ΔsaeR/S 접종의 열거는 이들 균주 들 사이의 세포독성의 대조가 사용된 박테리아의 농도차이 에 기인하지 않음을 입증하였다(도3B). 이 사실 인정은 식세포증 다음 인간 PMN에 대하여 S. 아우레우스 세포독성 분석이 어떻게 인간 PMN 혈장 막 무결성을 타협하기 위하여 다른 S. 아우레우스 긴장의 능력을 평가하기 위하여 이용될 수 있는지 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> 그림 1: 정제된 PMN의 유세포 분석. 대표적인 유세포측정도도(A)정제된 인간 PMN 및(B)PMN은 말초 혈액 단핵세포로 의도적으로 오염되었다. (C)대표적인 유동 세포분석 히스토그램 [최소 프로피듐 요오드화 염색](<1%) 0.05% 트리톤 X-100(음영처리된 빨간색)으로 처리된 PMN과 비교하여 정제된 PMN(음영 회색)을 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> 그림 2: S. 아우레우스에의해 생성된 세포외 단백질로 취한 PMN의 유세포 분석 분석. (A)PMN의 대표적인 유동 세포분석 히스토그램은 30분 후 인큐베이션 후 프로피듐 요오드화물로 염색되고, 최종 농도에서 USA300 상급자를 1:110(음영 회색) 또는 0.05% 트리톤 X-100(음영 적색)으로 여과하였다. (B)프로피듐 요오드화 양성 PMN의 비율은 30분 후 인큐베이션 후 USA300 또는 USA300의 상이한 농도로saeR/S 주산제의 상이한 농도를 가진. (C)1:110의 최종 농도에서 USA300 또는 USA300의saeR/S 상층과 함께 인큐베이션후 시간이 지남에 따라 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 비율. 데이터는 * p ≤ 0.05 및 ** p ≤ 0.005를 가진 적어도 3개의 개별 실험의 평균 ± SEM으로 제시된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> 그림 3: S. 아우레우스의식균증 다음 PMN의 유세포 분석. (a)프로피듐 양성 PMN의 비율은 90분 후 다른 농도의 식세포증 후 USA300 또는 USA300±saeR/S. (B)패널 A. 에 나타난 실험에 사용되는 opsonized S. 아우레우스 균주의 농도는 * p≤ 0.2로 결정된 4개의 개별 실험의 평균 ±SEM으로 제시된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

이 프로토콜은 이러한 중요한 선천적 면역 세포에 대한 황색포도상구균의 세포 독성을 정량화하는 전 인간 혈액및 2개의 명백한 분석법에서 다형성 핵 백혈구의 정제를 위한 방법을 기술한다.

인간의 다형성 핵 백혈구에 대한 황색포도상구균의 세포독성 정량화

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

황색포도상구균은 병인을 촉진하는 광범위한 독성 요인을 생성하는 그람 양성 박테리아입니다. 이들은 또한 PMNs 또는 호중구에게 불린 다형성 백혈구의 막 무결성을 방해하는 이중 성분 백혈구를 포함합니다. 이 비디오는 인간 전체 혈액에서 PMN의 격리와 이러한 중요한 타고난 면역 세포에 대한 S.aureus 세포 독성을 정량화하기위한 두 가지 뚜렷한 애약을 보여줍니다.이러한 소는 모두 표준 실험실 장비로 달성 될 수 있으며 숙주 병원체 상호 작용의 다른 측면을 검사하기 쉽습니다. 이 실험은 인간 기증자에게서 온 전혈을 사용하고 적당한 기관 위원회 또는 검토 위원회의 승인 뿐 아니라 통보된 동의가 모든 참가자에게서 얻은 진술을 요구할 것입니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 원심 분리 및 밀도 그라데이션을 사용하여 호중구를 분리하는 것입니다.먼저, 염화 나트륨 3.9% 나트륨 50밀리리터, 염화나트륨 0.9% 밀리리터 35밀리리터, 염화나트륨 1.8%, 밀리리터 1.077g, 실온에 20밀리리터를 제공합니다. 새로 그려진 25 밀리리터의 혈액을 두 개의 원심 분리 튜브로 옮기. 25 밀리리터의 갓 뽑은 헤파린화 전혈을 실온 25밀리리터, 3%dextran, 0.9%의 염화나트륨을 일대일 비율로 결합합니다.각 50 밀리리터 원모튜브를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 실온에서 30분 동안 방치합니다. 실온에서 인큐베이션 후 두 개의 별도의 레이어가 나타납니다. 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브로 각 dextran 혈액 혼합물의 상단 층을 전송합니다.450g의 원심분리기는 실온에서 10분 동안 낮거나 휴식이 없습니다. 조심스럽게 슈퍼 나티판을 흡인하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 폐기하십시오. 부드럽게 0.9 %의 나트륨 염화 나트륨의 두 밀리리터에 각 세포 펠릿을 다시 중단.재부유된 펠릿을 단일 50 밀리리터 원내로 결합한 다음 나머지 0.9%의 염화나트륨을 35밀리리터의 최종 부피에 추가합니다. 조심스럽게 손 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션 아래 밀리리터 ficoll 솔루션 당 1.077 그램의 10 밀리리터를 밑줄. 실온에서 30분 동안 450g으로 회전한 후, 낮은 또는 휴식 없이, 이전에 나타난 바와 같이 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네탄을 부드럽게 흡인시합니다.실온 수의 20 밀리리터에서 세포 펠릿을 재보습하여 적혈구를 lyse. 30초 동안 흔들어 부드럽게 섞으세요. 실온에서 10분 동안 염화나트륨 1.8% 나트륨과 원심분리기 샘플 20밀리리터를 450g에 즉시 추가합니다.전과 같이 신중하게 흡인 슈퍼 나일체. 2 밀리 리터 실온 RPMI에서 셀 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 얼음위에 놓습니다. 대마계를 사용하여 세포를 계산합니다.얼음 차가운 RPMI와 밀리리터 당 7 세포에 1 배 10의 농도에서 정제 된 PMN을 다시 중단하고 얼음에 유지. 정제된 PMN 100마이크로리터와 300마이크로리터의 DPBS를 결합하여 두 개의 복제 유동 세포측정 튜브에 프로디듐 요오드 얼룩 1개를 함유하고 있습니다. 양수 제어를 위해 0.5% Triton X-100 용액의 40 마이크로리터를 유동 세포측정 튜브 중 하나에 넣고 철저히 섞습니다.흐름 세포측정을 사용하여 전방 산란, 측면 산란 및 공화 요오드 스테닝을 측정하여 격리된 PMN의 순도와 무결성을 결정합니다. 98% 이상의 PMN 제제와 95% 이상의 공화요오드 네거티브만 사용해야 합니다. 정상적인 인간 혈청의 격리를 설명하는 프로토콜의 경우 전체 원고를 참조하십시오.이 분석에서 사용될 개별 우물에 DPBS로 희석된 20%의 격리된 인간 혈청의 100마이크로리터를 추가하여 PMN 세포 독성 분석약용 96웰 플레이트를 준비한다. 미디어만 받을 수 있는 최소 하나의 네거티브 컨트롤을 잘 포함하고 30분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 0.05%트리톤 X.Incubate로 받을 수 있는 긍정적인 컨트롤을 하나 이상 포함해야 합니다. 인큐베이션에 이어, 100 마이크로리터의 얼음 차가운 DPBS로 코딩된 우물을 두 번 씻고 접시를 얼음 위에 놓습니다.플레이트 우물에서 잔류 DPBS를 제거하고 100 마이크로리터의 정제된 인간 PMN을 밀리리터당 7번째 세포에 1회 100마이크로리터를 양소 코딩하여 양산합니다. 다음 세포 독성 에세이에서 사용하기 전에 적어도 5 분 동안 얼음에 두어 도금 된 호중구가 정착하도록 허용하십시오. 이 섹션에서는 인간 PMN에 대한 포도상 구균에 의해 생성 된 세포 외 단백질의 세포 독성을 정량화하는 분석서를 설명합니다.문화 S.aureus 는 실험 전날 섭씨 37도로 설정된 흔들리는 인큐베이터를 사용하여 적절한 매체에서 하룻밤 사이에. 서브컬쳐 S.aureus신선한 매체와 하룻밤 박테리아 문화의 1~100 희석을 수행 하 여. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달할 때까지 흔들리는 섭씨 37도에서 배양하십시오.5시간 의 성장 후, 1밀리리터의 서브컬쳐 S.aureus를 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기는 실온에서 5분 동안 5, 000g으로 옮긴다. 원심 분리, 흡인 슈퍼나티에 이어. 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 흡인 된 슈퍼나티를 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 전달하고 얼음 위에 놓습니다.스태프 아우레우스를 문화하는 데 사용되는 얼음 차가운 매체로 초월제의 연속 희석을 수행합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 얼음에 PMN이 들어 있는 96웰 플레이트의 개별 우물에 부정적이고 긍정적인 컨트롤을 위해 대여된 상피 샘플이나 미디어를 부드럽게 추가합니다. 부드럽게 바위 접시는 우물에 슈퍼 네이티퍼를 배포하고 섭씨 37도에서 배양합니다.원하는 시간에 인큐베이터에서 접시를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 각 유동 세포측정관에 프로피듐 요오드 1마이크로리터를 함유한 300마이크로리터의 얼음 냉온 DPBS를 추가합니다. 얼음에 세포측정 튜브를 흐르도록 샘플을 옮기.양포 제어를 잘 하려면 유동 세포측정 관으로 이송하기 전에 샘플에 10%트리톤 X의 20 마이크로리터를 추가합니다. 유동 세포측정을 사용하여 취한 PMN의 프로피듐 요오드 염색을 분석합니다. 이 섹션에서는 인간 PMN에 의한 식세포증에 따른 S.aureus의 세포 독성을 정량화하는 분석서를 설명합니다.600 나노미터에서 광학 밀도에 의해 정의된 성장 곡선과 박테리아의 농도는 이 분석에서 사용하기 전에 관련 포도상 구균 균주에 대해 결정되어야 한다. 이전에 설명한 바와 같이 S.aureus 균주와 하위 배양 박테리아의 하룻밤 문화를 시작합니다. 서브컬쳐 스태프 아우레우스가 중간 기하급수적인 성장에 도달하면, 1밀리리터의 배양 박테리아를 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기는 실온에서 5분 동안 5분, 000g으로 옮긴다.펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 흡입하여 S.aureus를 씻고 1 밀리리터 DPBS에서 펠릿 박테리아를 다시 중단하십시오. 30초 동안 샘플을 소용돌이시다. 원심 분리는 실온에서 5 분 동안 5, 000g에서 샘플을 원심 분리합니다.Staph 아우레우스를 소싱하려면 먼저 20 %의 인간 혈청의 1 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단하십시오. 그런 다음 15 분 동안 동요와 섭씨 37도에서 샘플을 배양. 이전에 표시된 원심분리에 따라 소소스토프 아우레우스를 세척합니다.희석 소점 포도구균은 얼음 차가운 RPMI와 함께 밀리리터 당 8 식민지 형성 단위, CFU에 10에 10로 균주를 희석. 30초 동안 샘플을 소용돌이치며 얼음 위에 놓습니다. 한천에 박테리아의 1~10개의 연쇄 희석을 도금하여 이러한 아세약에 사용되는 Staph 아우레우스의 농도를 확인합니다.각 Staph aureus 균주 또는 RPMI의 웰당 100 마이크로리터를 1.14단계의 얼음 위에 96웰 플레이트에 PMN에 부드럽게 추가합니다. 부드럽게 바위 접시는 우물에 Staph 아우레우스를 배포합니다. 식세포증을 섭씨 4도에서 8분 동안 500g의 원심분리판으로 동기화하고 원심 분리 직후 섭씨 37도에서 플레이트를 인큐베이션합니다.원하는 시점에서, 얼음에 접시를 넣고 각 흐름 세포측정 관에 하나의 마이크로 리터 프로디듐 요오드를 포함하는 얼음 차가운 DPBS의 200 마이크로 리터를 추가 한 다음 해당 튜브에 샘플을 전송합니다. 2.8 및 2.9에 기술된 바와 같이 유동 세포측정을 사용하여 요오드 염색에 대한 샘플을 분석한다. Staph aureus에 의해 인간 PMN을 표적으로 하는 이중 성분 백혈병의 전사는 인간 PMN에 대하여 Staph aureus 세포 독성을 정량화하기 위한 기술된 약의 유용성을 보여주기 위하여 SA 또는 S2 분대 계통을 요구합니다.이러한 실험은 이 균주에 있는 SA 또는 S의 isologenic 삭제 돌연변이에서 USA300으로 확인된 임상적으로 관련있는 Staph aureus 격리로 수행되었다. 왼쪽 패널은 정제된 PMN을 묘사하고 오른쪽 패널은 의도적으로 오염된 샘플을 예로 묘사합니다. PMN은 이 프로토콜 중 하나에 설명된 절차를 사용하여 분리되어 프로피듐 요오드로 염색하고 유동 세포측정을 사용하여 검사했습니다.전방 및 측면 산란 플롯은 1년 동안 단백구 또는 림프구에 의한 정제된 PMN의 오염을 검출하는 데 사용되었다. 인간 PMN 정화의 설명된 방법을 사용하여, 우리는 지속적으로 98% 이상이고 95% 이상 인 8 PMN에 7번에서 1배에서 1배까지 5회 10번에서 1회까지 일관되게 분리할 수 있으며 95% 이상의 요오드네이다.USA300 및 AsaeR/S 돌연변이에 의해 생성된 세포 외 단백질의 세포 독성은 정제된 PMN에 대하여 시험되었습니다. 이러한 실험은 USA300에 의해 생성된 세포외 단백질로 30분 동안 중독된 후 정제된 PMN의 공화 요오드 염색에 대한 집중 의존적 증가를 보여 주지만, 아사에R/S 돌연변이체는 그렇지 않다. 추가 실험은 약 30분 후에 고원한 USA300 세포외 단백질에 의한 중독 에 따른 프로피듐 요오드 양성 PMN의 비율에서 꾸준한 증가를 입증하였다.인간 PMN의 최소 프로피듐 요오드 염색은 AsaeR/S 돌연변이체에 의해 생성된 세포외 단백질에 노출된 후 모든 시점에서 주목되었다. 마지막으로, 동기화된 식세포증에 따른 PMN에 대한 USA300 및 아사에R/S 돌연변이의 세포독성이 시험되었고, 미국300의 식세포증 후 90분 후 요오드 양성 PMN의 농도 의존성 증가가 관찰되었다. 상당히 적은 PMN은 아사에R/S 돌연변이의 phagocytosis 다음 프로피듐 요오드 양성이었다.USA300 및 AsaeR/S 돌연변이 접종의 열거는 이들 실험의 각각에 사용되었으며, 이러한 균주 들 사이의 세포 독성의 대조는 사용되는 박테리아의 농도의 차이 때문이 아니라는 것을 입증하였다. 이 프로토콜은 이러한 타고난 면역 세포에 대한 S.aureus의 세포 독성을 정량화하기위한 두 가지 뚜렷한 기술에서 인간의 혈액에서 PMN의 정제를 설명합니다. 이러한 절차의 성공은 정제 된 PMN의 품질과 Staph 아우레우스 박테리아 또는 초월제의 적절한 준비에 달려 있습니다.이러한 절차를 수행하는 동안 고려해야 할 중요한 사항은 전체 원고를 참조하십시오. USA300은 악성 MRSA 분리 및 AsaeR/S의 손실은 인간 PMN을 대상으로 하는 독성 요인의 전사를 극적으로 감소시켜, 이러한 균주가 설명된 에세이를 사용하여 세포 독성을 비교하기에 이상적인 모델을 만드는 것입니다. 포도상 구균의 다른 균주를 사용할 때 성장 조건, 추가된 수퍼나티의 부, 또는 PMN에 대한 박테리아의 비율을 조정하는 것이 필요할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

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에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석

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연구

면역학 및 감염병학

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