Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health Grants NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 samt midler fra Montana State University landbruk Experiment Station, og et utstyr stipend fra Murdock veldedige Trust .

Heparinisert venøs blod fra friske donorer ble samlet i samsvar med protokollen godkjent av institusjonelle Review Board for Human ved Montana State University. Alle givere gitt skriftlig samtykke til å delta i denne studien.
1. rensing av humant polymorfonukleære leukocytter og isolering av humant serum
Merk: alle reagenser bør rutinemessig sjekkes for tilstedeværelsen av endotoksin ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig endotoksin gjenkjennings sett og bør inneholde < 25.0 PG/mL endotoksin for å hindre uønsket priming av PMN.
<ol><li>Bring 50 mL på 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 mL 0,9% NaCl (w/v), 20 mL 1,8% NaCl (w/v), 12 mL 1,077 g/mL tetthet gradient løsning, og 20 mL injeksjon-eller vanning-grade vann til romtemperatur.</li>
	<li>For å isolere humant serum, ruge 4 mL ferskt trukket humant blod uten anti-koagulere ved 37 ° c i et 15 mL glass rør i 30 min. Etter inkubasjons, sentrifuge prøve ved 2000 – 3000 × g i 10 min ved romtemperatur. Overfør det øvre serum laget inn i et friskt 15 mL konisk sentrifugerør og plasser på is.</li>
	<li>Kombiner 25 mL ferskt trukket heparinisert (1000 enheter/mL) hele menneskeblod med 25 mL romtemperatur 3% dextran-0,9% NaCl (1:1 ratio) i to replikere 50 mL koniske sentrifugerør (50 mL totalt volum per rør). Bland ved å forsiktig rocking hver 50 mL konisk rør og la stå ved romtemperatur i 30 min.</li>
	<li>Etter inkubasjons ved romtemperatur, vil to separate lag vises. Overfør det øverste laget av hver dextran-blandingen til nye 50 mL koniske rør og sentrifuger ved 450 x g i 10 min ved romtemperatur med lav eller ingen bremser.</li>
	<li>Nøye aspirer både supernatanter og forkaste uten å forstyrre celle pellets. Resuspend forsiktig hver celle pellet i 2 mL romtemperatur 0,9% NaCl, kombinere resuspendert pellets i en enkelt 50 mL konisk rør, legg deretter til de resterende 0,9% NaCl (endelig volum på 35 mL).</li>
	<li>Forsiktig underlag 10 mL romtemperatur på 1,077 g/mL tetthet gradient løsning under celle suspensjonen ved hjelp av en hånd pipette. Spin på 450 x g i 30 min ved romtemperatur med lav eller ingen bremser. Aspirer forsiktig supernatanten uten å forstyrre celle pellet. Supernatanten vil inneholde perifere blod mononukleære celler som kan samles som tidligere beskrevet14.</li>
	<li>Lyse opp de røde blodcellene ved å blanding celle pellet i 20 mL romtemperatur vann. Bland forsiktig ved å gynge røret for 30 s. Den lyse av røde blodlegemer vil bli ledsaget av en tydelig nedgang i turbiditet.</li>
	<li>Tilsett umiddelbart 20 mL 1,8% NaCl (ved romtemperatur [RT]) og sentrifuger prøve ved 450 × g i 10 min ved romtemperatur. Merk: det er viktig å minimere tiden at PMN er igjen i vann alene etter røde blodlegemer lyse for å maksimere PMN yield og forhindre PMN lyse og/eller aktivering.</li>
	<li>Forsiktig aspirer supernatanten uten å forstyrre celle pellet. Resuspend forsiktig celle pellet i 2 mL RT RPMI 1640 medium og plasser på isen.</li>
	<li>Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Resuspend renset PMN ved en konsentrasjon på 1 x 107 celler/ml med iskald RPMI og holde på isen.</li>
	<li>Kombiner 100 μL av renset PMN (1 x 106 celler) med 300 μL av iskald Dulbecco saltvann (DPBS) inneholdende 1 μL propidium iodide beis i to replikere flowcytometri rør. For en positiv kontroll for skade på plasma membran, tilsett 40 μL av 0,5% Triton X-100 løsning i en av flyten flowcytometri rør og bland godt.</li>
	<li>Bruk strømnings flowcytometri til å måle frem spredningen, side spredningen og propidium iodide farging (eksitasjon/emisjon Maxima ved 535/617 NM) av renset celler (figur 1). Merk: Forward og side scatter analyse vil identifisere uønskede populasjoner av lymfocytter og monocytter. Propidium iodide vil bare beis celler med en kompromittert plasma membran og renset PMN som har uttalt bestander av Propidium iodide positive celler bør ikke brukes. For disse studiene ble renset PMN bare brukt hvis de omfattet > 98% av renset celler og < 5% farget positiv for propidium iodide.</li>
	<li>Forbered en 96 brønn plate for PMN cytotoksisitet analyser ved å dekke individuelle brønner som skal brukes i denne analysen med 100 μL 20% isolert humant serum som er fortynnet med DPBS. Merk: plating PMN direkte på plast eller glass vil føre til aktivering av cellene. Sørg for å inkludere minst én negativ kontroll godt som bare vil motta Media og minst én positiv kontroll godt som vil motta 0,05% Triton X-100.</li>
	<li>Ruge platen ved 37 ° c i 30 min. Etter inkubasjons, vask de belagte brønnene to ganger med iskald DPBS for å fjerne overflødig serum. Trykk forsiktig på platen opp ned for å fjerne eventuelle gjenværende DPBS og plasser på isen.</li>
	<li>Tilsett forsiktig 100 μL av renset humant PMN ved 1 x 107 celler/ml til hver belagt brønn (1 x 106 PMN/brønn). Tillat PMN å bosette seg i brønner ved incubating platen på isen i minst 5 min. Hold platen nivå for å tillate jevn fordeling av celler i hver brønn og la på isen for å unngå uønsket aktivering av PMN.</li>
</ol>2. cytotoksisitet analysen av S. aureus ekstracellulære proteiner mot humant polymorfonukleære leukocytter
<ol><li>Kultur S. aureus overnight i tryptic soya BULJONG (TSB) ved hjelp av en risting inkubator satt ved 37 ° c. For disse studiene ble 20 mL av TSB i separate 150 mL Erlenmeyer flasker inokulert med frosne kulturer av S. aureus stammer USA300 eller USA300ΔsaeR/S og vokst for ca 14 timer med risting ved 250 RPM.</li>
	<li>Under kultur S. aureus ved å utføre en 1:100 fortynning av overnight bakteriell kultur med ferske medier. Ruge ved 37 ° c med risting til bakteriene nå tidlig stasjonær vekstfase. Merk: for disse eksperimentene, 20 mL tryptic soya buljong i 150 mL Erlenmeyer flasker ble inokulert med 200 μL av overnight kultivert USA300 eller USA300ΔsaeR/S og inkubert ved 37 ° c med risting ved 250 RPM for 5 t.</li>
	<li>Når bakteriene har nådd tidlig stasjonær vekstfase, overføring 1 mL subcultured S. aureus i en 1,5 ml mikrosentrifugen rør og sentrifuger ved 5 000 × g i 5 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Etter sentrifugering, Overfør supernatanten til en 3 mL sprøyte. Pass supernatanter gjennom et 0,22 μm filter og inn i et nytt 1,5 mL mikrosentrifugen rør på isen.</li>
	<li>Utfør seriell fortynninger av supernatanter med iskald Media brukes til kultur S. aureus. Merk: for eksperimentene som vises, supernatanter fra USA300 og USA300ΔsaeR/S gjennomgikk fire påfølgende 1/2 Logg fortynninger med iskald tsb.</li>
	<li>Forsiktig legge supernatanten prøver eller Media alene (for negative og positive kontroller) til individuelle brønner på 96-brønn plate som inneholder PMN på isen fra trinn 1,15. For disse eksperimentene ble 10 μL av USA300 eller USA300ΔsaeR/S supernatanten prøver lagt til hver brønn. Forsiktig rock plate for å fordele supernatanter i brønner og ruge ved 37 ° c.</li>
	<li>Til ønsket tid, fjerne platen fra inkubator og plass på isen. Legg 40 μL av 0,5% Triton X-100 til positiv kontroll godt.</li>
	<li>Pipette prøvene forsiktig opp og ned i hver brønn for å helt trekke av alle PMN levd opp til plate, og deretter overføre prøvene å flyte flowcytometri rør på is som inneholder 300 μL av iskald DPBS med 1 μL av propidium iodide.</li>
	<li>Mål andelen propidium iodide-positive PMN ved hjelp av strømnings flowcytometri (figur 2A). Når bundet til DNA, propidium iodide har eksitasjon/utslipp ved 535/617 NM.</li>
</ol>3. S. aureus cytotoksisitet analysen mot menneskelige polymorfonukleære leukocytter etter fagocytose
Merk: vekst kurver definert av den optiske tettheten ved 600 NM (OD600) og konsentrasjonen av bakterier må fastsettes empirisk for S. aureus stammer som skal testes før du starter denne analysen. Suksessen til disse eksperimentene krever konsekvent høsting av like konsentrasjoner av hver S. aureus- stamme testet i midten av eksponentiell vekstfase ved hjelp av OD600 av sub-kultivert bakterier.
<ol><li>Start over natten kulturer av S. aureus stammer og under kultur bakterier som beskrevet i trinn 2.1.1 og 2.1.2.</li>
	<li>Harvest subcultured S. aureus når den har nådd middels eksponentiell vekst ved å overføre 1 ml kultivert bakterier til en 1,5 ml mikrosentrifugen rør og sentrifugering ved 5 000 × g i 5 min ved romtemperatur. Merk: under våre vekstforhold, USA300 og USA300ΔsaeR/S nådde midt-eksponentiell vekstfase etter ca 135 min av inkubasjons6.</li>
	<li>Vask S. aureus etter sentrifugering ved aspirating supernatanten, blanding pelleted bakterier i 1 ml DPBS, virvlingen prøven for 30 S, og sentrifugering ved 5 000 × g i 5 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Opsonize S. aureus ved blanding av bakterie pellet i 1 ml 20% humant serum FORTYNNET med DPBS og incubating ved 37 ° c med omrøring i 15 min.</li>
	<li>Sentrifuger opsoniserte bakterier ved 5 000 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Vask S. aureus etter sentrifugering ved aspirating supernatanten, blanding de pelleted bakteriene i 1 ml DPBS, deretter Vortex prøven til bakteriell pellet er helt ødelagt fra hverandre pluss ytterligere 30 sekunder. Sentrifuger bakterier ved 5 000 × g i 5 min ved romtemperatur.</li>
	<li>Resuspend opsoniserte S. aureus stammer i 1 ml RPMI, Vortex prøven til bakteriell pellet er helt ødelagt fra hverandre, og deretter for ytterligere 30 S. Legg bakterier på isen.</li>
	<li>Fortynne opsoniserte S. aureus stammer til ønsket konsentrasjon med iskald RPMI. Vortex for 30 s og plass på isen.</li>
	<li>Bekreft konsentrasjonen av opsoniserte S. aureus av plating 1:10 seriell fortynninger av bakterier på tryptic soya agar. Merk: fordi forskjeller i konsentrasjonen av bakterier som brukes i denne analysen kan ha en stor innvirkning på påfølgende PMN plasma membran permeabilitet (Figur 3a), er det svært viktig at konsentrasjonen av hver belastning testet er bestemt for hvert eksperiment og er ekvivalent mellom stammer.</li>
	<li>Forsiktig legge 100 μL/brønn av hver S. aureus STAMME eller RPMI (for positive og negative kontroller) til pmn i 96-brønn plate på is fra trinn 1,14. Forsiktig rock plate for å fordele S. aureus i brønner.</li>
	<li>Synkroniser fagocytose ved å sentrifugering platen ved 500 × g i 8 min ved 4 ° c15. Ruge plate ved 37 ° c umiddelbart etter sentrifugering (T = 0).</li>
	<li>Til ønsket tid, fjerne plate fra inkubator og plass på isen. Legg 40 μL av 0,5% Triton X-100 til positiv kontroll godt.</li>
	<li>Pipette prøvene forsiktig opp og ned i hver brønn for å helt trekke av alle PMN levd opp til plate, og deretter overføre prøvene å flyte flowcytometri rør på isen som inneholder 200 μL av iskald DPBS med 1 μL av propidium iodide.</li>
	<li>Analyser prøver for propidium iodide farging ved hjelp av strømnings flowcytometri som beskrevet i trinn 2,9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., H&#246;&#246;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+invasion+and+evasion:+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus.">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li><li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses.">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+toxins.">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li><li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epic+Immune+Battles+of+History:+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus.">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li><li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytes.">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li><li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis.">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li><li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR/S+Dependent.">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+SaeR/S-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production.">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li><li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR/S-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus.">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li><li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence.">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).</li><li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocidins:+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors.">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li><li>B&#248;yum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils.">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne protokollen beskriver rensing av PMN fra humant blod og to distinkte analyser som bruker propidium iodide for kvantifisere den cytotoksisitet av S. aureus mot disse viktige medfødte immunceller. Suksessen til disse prosedyrene vil avhenge av kvaliteten på renset PMN og riktig utarbeidelse av S. aureus og ekstracellulære proteiner produsert av denne patogen. For isolering av PMN, er det viktig å minimere PMN aktivering under og etter rensing ved hjelp av reagenser fri for endotoksin forurensning, behandling av celle preparater forsiktig, og holde cellene i riktig temperatur. Tegn som indikerer aktivering av PMN inkluderer klumper av celler under rensing og når mer enn 5% av isolerte celler flekken positiv for propidium iodide. På grunn av den relativt korte levetiden til PMN, må disse cellene isoleres fra humant blod og testes på samme dag. PMN vil begynne å vise tegn på spontan apoptose hvis igjen på isen for mer enn 3 h etter rensing. Som nevnt tidligere, er det svært viktig at hver PMN forberedelse er nøye vurdert ved hjelp av Flow flowcytometri analyse av fremover og side scatter samt propidium iodide flekker for å sikre renhet og integritet av isolerte celler.
Uttrykket av bi-komponent leukocidins av S. aureus er ansvarlig for flertallet av kompromittert PMN plasma membran integritet som er observert ved hjelp av analysene som er beskrevet i denne protokollen. Variasjon i uttrykk for disse giftstoffene og andre pore-forming peptider, slik som fenol-løselig modulins, mellom stammer av S. aureus vil produsere forskjeller i cytotoksisitet mot menneskelig PMN. betydelige avvik under in vitro-veksten mellom S. aureus -stammer vil også påvirke uttrykk for giftstoffer som dannes pore og påfølgende cytotoksisitet. I tillegg er forholdet mellom s. aureus til PMN i fagocytose analysene har en stor innvirkning på påfølgende PMN plasma membran permeabilitet (Figur 3a) og disse eksperimentene krever konsekvent innhøsting av like konsentrasjoner av hver S. aureus- stamme testet i MIDTEN av eksponentiell vekstfase ved hjelp av OD600 av subcultured bakterier. Gitt disse hensyn, er det svært viktig å definere vekst kurver for alle stammer som vil bli undersøkt før du begynner cytotoksisitet analyser. Vi anbefaler ikke disse metodene for å analysere S. aureus cytotoksisitet med stammer som viser betydelige vekst forskjeller in vitro.
USA300 er en ondartet MRSA isolat som er kjent for å være svært cytotoksisk mot menneskelige PMN15 og tap av SaeR/S i denne belastningen dramatisk reduserer transkripsjon av mange bi-komponent leukocidins som mål menneskelige PMN6,12, noe som gjør disse belastninger ideelle modeller for å sammenligne cytotoksisitet bruker analysene beskrevet. Det er imidlertid omfattende genetisk variasjon mellom ulike s. aureus isolerer og parametrene beskrevet i disse protokollene kan ikke føre til vesentlige endringer i cytotoksisitet mot menneskelige PMN når testing andre S. aureus stammer. Skreddersy vekstforhold, volumer av supernatanter lagt til, eller forholdet mellom bakterier til PMN kan være nødvendig for å lykkes med disse metodene ved hjelp av andre stammer av S. aureus.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus er en gram-positiv bakterie som forårsaker et bredt spekter av sykdommer hos mennesker. Denne fremtredende patogen produserer mange virulens faktorer som bidrar til ulike aspekter av infeksjonen. Disse inkluderer overflate molekyler som tillater S. aureus å følge ulike typer verts vev1, ekstracellulære proteiner som forstyrrer verten immunrespons2, og en rekke utskilles giftstoffer som er rettet mot ulike typer vert celler3. I denne rapporten beskriver vi en metode som kvantifiserer cytotoksisitet av ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mot menneskelige polymorfonukleære leukocytter (PMN eller nøytrofile), primære Effektor celler av verten medfødt immunrespons.
PMN er de mest tallrike leukocytter i pattedyr. Disse sirkulerende immunceller er raskt rekruttert til området av verten vev fornærmelse som svar på faresignaler produsert av fastboende celler eller av forbindelser som er unike for invaderende mikrober. Den ekstracellulære innspill fra disse molekylene og fra direkte kontakter med aktiverte bosatt vert celler under Ekstravasasjon øke aktiverings tilstanden av PMN i en prosess som kalles priming4,5. Primet PMN som har nådd distressed vev deretter utføre viktige medfødte immunresponser utformet for å hindre etablering av smitte. Disse inkluderer bindende og internalisering, eller fagocytose, av invaderende mikroorganismer som utløser en kaskade av intracellulære hendelser cumulating i mikrobe ødeleggelse av et batteri av potente antimikrobielle forbindelser5.
PMN spiller en viktig rolle som beskytter mennesker fra invaderende patogener og er spesielt viktig for å forebygge S. aureus infeksjon4. Denne bakterien produserer imidlertid et bredt spekter av virulens gener som hindrer ulike PMN-funksjoner. Disse inkluderer ekstracellulære proteiner som blokkerer anerkjennelse av signalering molekyler, hindre vedheft til å være vert vev, hemme produksjon av antimikrobielle forbindelser, og kompromiss plasma membran integritet4. S. aureus appartefakter den timelige uttrykk for disse virulens gener gjennom den kollektive innspill fra flere to-komponent sensoriske systemer som gjenkjenner spesifikke miljømessige signaler. Den SaeR/S to-komponent system er en stor opp-regulator av S. aureus virulens gen transkripsjon under smitte6,7,8,9,10,11. Spesielt er dette to-komponent-systemet vist å være avgjørende for produksjon av bi-komponent leukocidins som spesifikt mål menneskelige PMN12.
Denne protokollen er delt inn i tre forskjellige seksjoner. Den første delen beskriver rensing av PMN fra humant blod ved hjelp av tetthet gradient sentrifugering ved hjelp av en protokoll som er tilpasset fra metoder etablert av Bøyum13 og Nauseef14. Den andre og tredje delen detalj to forskjellige teknikker for å undersøke S. aureus cytotoksisitet; en forgifter sjelen PMN med ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mens den andre undersøker evnen til levende bakterier for å skade PMN følgende fagocytose. Disse prosedyrene bruker propidium iodide for å måle tapet av PMN plasma membran integritet forårsaket av S. aureus pore-forming giftstoffer. Propidium iodide er en DNA-bindende fluoroforen som normalt er celle membran ugjennomtrengelig men kan krysse plasma membraner som har blitt forstyrret av S. aureus giftstoffer. Flow flowcytometri analyse tillater rask kvantifisering av propidium iodide-positive PMN å måle den relative cytotoksisitet av S. aureus stammer. Meticillinresistente S. aureus (MRSA) identifisert som pulserende-feltet gel ELEKTROFORESE type USA300 og en isogenic sletting mutant av saeR/S i denne belastningen (USA300ΔsaeR/s) har blitt brukt som modeller for å demonstrere hvordan disse prosedyrene kan kvantifisere cytotoksisitet av S. aureus mot menneskelig PMN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

Staphylococcus aureus er i stand til å sekresjon et bredt spekter av leukocidins som mål og forstyrrer membranen integriteten til polymorfonukleære leukocytter (PMN eller nøytrofile). Denne protokollen beskriver både rensing av menneskelig PMN og kvantifisering av S. aureus cytotoksisitet mot PMN i tre forskjellige seksjoner. § 1 detaljer isolering av PMN og serum fra humant blod ved hjelp av tetthet sentrifugering. § 2 tester cytotoksisitet av ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus mot disse renset menneskelige PMN. § 3 måler cytotoksisitet mot menneskelige PMN etter fagocytose av Live S. aureus. Disse prosedyrene måle forstyrrelse av PMN plasma membran integritet av S. aureus leukocidins bruke Flow flowcytometri analyse av PMN behandlet med propidium iodide, en DNA bindende fluoroforen som er celle membran ugjennomtrengelig. Kollektivt, disse metodene har fordelen av hurtigtesting S. aureus cytotoksisitet mot primære menneskelige PMN og kan lett tilpasses til å studere andre aspekter av Host-patogen interaksjoner.

Vi har demonstrert hvordan prosedyrene beskrevet ovenfor kan brukes til å relativt kvantifisere cytotoksisitet av S. aureus mot menneskelige PMN bruker MRSA PFGE-type USA300 og en isogenic sletting mutant av saeR/S i denne belastningen (USA300ΔsaeR/s) generert i tidligere studier6. PMN isolert ved hjelp av prosedyrene beskrevet i del 1 av denne protokollen ble farget med propidium iodide og undersøkt ved hjelp av flyt flowcytometri. Forward og side scatter tomter ble brukt for å illustrere forurensning av renset PMN av monocytter eller lymfocytter (figur 1A, B) og PMN integritet ble bestemt ved hjelp Propidium iodide farging (figur 1C). Den beskrevne metoden for menneskelig PMN rensing kan konsekvent gi 0,5 x 107 til 1 x 108 PMN som er > 98% Pure og er > 95% propidium iodide negative.
Cytotoksisitet av ekstracellulære proteiner produsert av USA300 og USA300ΔsaeR/S ble testet mot renset PMN (figur 2) etter prosedyrene beskrevet i punkt 2 i denne protokollen. Disse eksperimentene viser en konsentrasjon avhengig økning i propidium iodide farging av renset PMN følgende 30 min av forgiftning med ekstracellulære proteiner produsert av USA300 (figur 2B). Tidligere studier har vist at SaeR/S to-komponent-systemet er viktig for uttrykk for mange bi-komponent leukocidins som mål Human PMN6,10,11,16. Sammenfallende med disse tidligere funn, svært få propidium iodide-positive PMN ble oppdaget følgende eksponering for ekstracellulære proteiner produsert av USA300ΔsaeR/S (figur 2B). Ytterligere eksperimenter viste en jevn økning i andelen lysert PMN etter forgiftning av USA300 ekstracellulære proteiner som plateaued etter ca 30 min (figur 2C). Minimal lyse av menneskelig PMN ble notert på alle tidspunkter etter eksponering for ekstracellulære proteiner produsert av USA300ΔsaeR/S. Disse resultatene illustrerer nytten av denne analysen for den relative kvantifisering av cytotoksisitet av ekstracellulære S. aureus proteiner mot menneskelig PMN.
Vi testet USA300 og USA300ΔsaeR/S ved hjelp av s. aureus cytotoksisitet analysen mot Human PMN følgende fagocytose som er beskrevet i punkt 3 i denne protokollen (Figur 3). En konsentrasjon avhengig økning i andelen av propidium iodide positive PMN ble observert 90 min etter fagocytose av USA300 (Figur 3A). En signifikant nedgang ble observert i andelen av PMN som var propidium iodide positive etter fagocytose av USA300ΔsaeR/s (Figur 3A), som støtter andre resultater som indikerer saeR/s to-komponent system er viktig for cytotoksisitet av S. aureus mot Human PMN (figur 2)7,11. Som tidligere nevnt og demonstrert i Figur 3A, forskjeller i S. aureus konsentrasjon har en uttalt effekt på PMN lyse Rings fagocytose. Opplisting av USA300 og USA300ΔsaeR/S inokulum brukes i hvert av disse eksperimentene viste at kontrasten i cytotoksisitet mellom disse stammene var ikke på grunn av forskjeller i konsentrasjonen av bakterier som brukes (Figur 3B). Disse funnene viser hvordan S. aureus cytotoksisitet analysen mot menneskelige PMN følgende fagocytose kan brukes til å vurdere evnen til ulike S. aureus stammer til kompromiss menneskelig PMN plasma membran integritet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> Figur 1: Flow flowcytometri analyse av renset PMN. Representative flyt flowcytometri prikk plott av (A) renset menneskelige PMN og (B) PMN som er med hensikt forurenset med perifert blod mononukleære celler. (C) representative flyt flowcytometri histogram som demonstrerer minimale propidium iodide farging (< 1%) av renset PMN (fargede grå) i forhold til PMN behandlet med 0,05% Triton X-100 (skyggelagt rød). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> Figur 2: Flow flowcytometri analyse av PMN beruset med ekstracellulære proteiner produsert av S. aureus. (A) representant flyt flowcytometri histogram av PMN beiset med propidium iodide etter 30 min av inkubasjons med Media kontroll (skyggelagt blå), filtrert USA300 supernatanten ved en endelig konsentrasjon av 1:110 (grå skygge), eller 0,05% Triton X-100 (skyggelagt rød). (B) andelen propidium iodide positive PMN etter 30 min av inkubasjons med ulike KONSENTRASJONER av USA300 eller USA300 ∆saeR/S supernatanter. (C) andelen propidium iodide positive PMN over tid etter INKUBASJONS med USA300 eller USA300 ∆saeR/S supernatanten ved en endelig konsentrasjon på 1:110. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM av minst 3 separate eksperimenter med * p ≤ 0,05 og * * p ≤ 0,005, som bestemt av den tosidige t-testen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> Figur 3: Flow flowcytometri analyse av PMN etter fagocytose av S. aureus. (A) andelen propidium iodide positive PMN 90 min etter fagocytose av ulike KONSENTRASJONER av USA300 eller USA300 ∆saeR/S. (B) konsentrasjon av opsoniserte S. aureus -belastninger som brukes for eksperimentene som vises i panel A. data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM av 4 separate eksperimenter med * p ≤ 0,01 som bestemt av tosidig t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Denne protokollen beskriver en metode for rensing av polymorfonukleære leukocytter fra hele menneskeblod og to distinkte analyser som kvantifisere cytotoksisitet av Staphylococcus aureus mot disse viktige medfødte immunceller.

Kvantifisere den cytotoksisitet av staphyloccus aureus mot Human polymorfonukleære leukocytter

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Staphylococcus aureus er en gram-positive bakterier som produserer et bredt spekter av virulensfaktorer som fremmer patogenese. Disse inkluderer bi-komponent leukotoksiner som forstyrrer membranintegriteten til polymorfotonukleleukocytter, også kalt PMN eller nøytrofiler. Denne videoen illustrerer isoleringen av PMN-er fra menneskelig fullblod og to forskjellige analyser for å kvantifisere S.aureus cytotoksisitet mot disse viktige medfødte immuncellene.Disse analysene kan alle oppnås med standard laboratorieutstyr og er lett tilpasningsdyktige for å undersøke andre aspekter ved vertspatogeninteraksjon. Disse eksperimentene vil bruke fullblod hentet fra menneskelige givere og vil kreve godkjenning fra riktig institusjonell komité eller gjennomgangstavle, samt en erklæring om at informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Det første trinnet i denne prosedyren er isolering av nøytrofiler gjennom bruk av sentrifugering og tetthetsgradienter.Først ta med 50 milliliter med 3% dextran 0,9% natriumklorid, 35 milliliter 0,9% natriumklorid, 20 milliliter 1,8% natriumklorid, 12 milliliter 1,077 gram per milliliter ficollløsning og 20 milliliter vann til romtemperatur. Overfør 25 milliliter nytrukket heparinisert hele menneskelig blod til to koniske sentrifugerør. Kombiner 25 milliliter nytrukket heparinisert fullblod med 25 milliliter tilsvarende volum av romtemperatur, 3% dextran, 0,9% natriumklorid i et en-til-en-forhold.Bland ved å gynge hver 50 milliliter konisk tube og la stå ved romtemperatur i 30 minutter. Etter inkubasjon ved romtemperatur vises to separate lag. Overfør det øverste laget av hver dextran blodblanding til nye 50 milliliter koniske rør.Sentrifuge ved 450 g i 10 minutter ved romtemperatur med lave eller ingen pauser. Aspirer forsiktig både supernatanter og kast uten å forstyrre cellepellets. Forsiktig resuspend hver celle pellet i to milliliter på 0,9% natriumklorid.Kombiner de resuspended pellets i en enkelt, 50 milliliter konisk deretter legge de resterende 0,9% natriumklorid til et endelig volum på 35 milliliter. Legg forsiktig 10 milliliter på 1,077 gram per milliliter ficollløsning under cellefjæringen ved hjelp av en håndpipette. Etter å ha snurret på 450 g i 30 minutter ved romtemperatur, med lave eller ingen pauser, aspirer forsiktig det overnaturante uten å forstyrre cellepelleten, som tidligere vist.Lyse de røde blodlegemene ved å gjenopplive cellepellet i 20 milliliter romtemperatur vann. Bland forsiktig ved å gynge i 30 sekunder. Tilsett umiddelbart 20 milliliter med 1,8% natriumklorid og sentrifugeprøve ved 450 g i 10 minutter ved romtemperatur.Aspirer forsiktig overnaturant som vist før. Forsiktig resuspend cellen pellet i to milliliter romtemperatur RPMI og plasser på is. Telle celler ved hjelp av et hemacytometer.Resuspend renset PMN med en konsentrasjon på en ganger 10 til 7th celler per milliliter med iskald rPMI og holde på isen. Kombiner 100 mikroliter rensede PMN-er med 300 mikroliter DPBS, som inneholder ett mikroliter propidiumjodidflekk i to replikere strømningscytometrirør. For en positiv kontroll, legg til 40 mikroliter med 0,5% Triton X-100-løsning i et av strømningscytometrirørene og bland godt.Bruk strømningscytometri til å måle spredning av forover, sidesprang og propidiumjodidfarging for å bestemme renheten og integriteten til isolerte PMN-er. Bare PMN-preparater som er over 98 % rene og over 95 % propidiumjodidnegative bør brukes. For protokollen som beskriver isolering av normalt menneskelig serum, se hele manuskriptet.Forbered en 96-brønnsplate for PMN-cytotoksisitetsanalyser ved å tilsette 100 mikroliter av 20 % isolert humant serum fortynnet med DPBS til individuelle brønner som skal brukes i denne analysen. Pass på å inkludere minst en negativ kontrollbrønn som bare vil motta media og minst en positiv kontrollbrønn som vil motta 0,05% Triton X.Inkubere platen ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Etter inkubasjonen vasker du de kodede brønnene to ganger med 100 mikroliter iskalde DPBS og legger platen på isen.Fjern eventuelle gjenværende DPBS fra platebrønner og tilsett forsiktig 100 mikroliter rensede menneskelige PMN-er på en gang 10 til de 7. La belagte nøytrofiler bosette seg ved å la dem være på is i minst fem minutter før bruk i følgende cytoktoksisitetsanalyser. Denne delen beskriver en analyse som kvantifiserer cytotoksisiteten av ekstracellulære proteiner produsert av staph aureus mot menneskelige PMN.Kultur S.aureus over natten i passende medier ved hjelp av en risting inkubator satt til 37 grader Celsius dagen før eksperimentet. Subkultur S.aureus ved å utføre en til 100 fortynning av natten bakterier kulturer med friske medier. Inkuber ved 37 grader Celsius med risting til bakterier når tidlig stasjonær vekstfase.Etter fem timers vekst, overføre en milliliter subkultur S.aureus til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og sentrifuge på 5, 000 g i fem minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering, aspirere supernatanter. Send aspirerte supernativa gjennom et 0,22 mikron sprøytefilter inn i et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og legg på is.Utfør seriefortynninger av supernatanter med iskalde medier som brukes til å dyrke Staph aureus. Tilsett forsiktig overnaturlige prøver eller medier lånt for negative og positive kontroller til individuelle brønner av en 96-brønnsplate som inneholder PMN-er på is, som beskrevet tidligere. Forsiktig steinplate for å distribuere supernatanter i brønner og inkubere ved 37 grader Celsius.Til ønsket tid, fjern platen fra inkubatoren og legg på is. Tilsett 300 mikroliter iskalde DPBS som inneholder ett mikroliter propidiumjodid til hvert strømningscytometrirør. Overfør prøvene til å flyte cytometrirør på is.For den positive kontrollbrønnen, legg til 20 mikroliter på 10% Triton X i prøven før du overfører til et strømningscytometrirør. Analyser propidiumjodidfarging av beruset PMN ved hjelp av strømningscytometri. Denne delen beskriver en analyse som kvantifiserer cytoktoksisiteten til S.aureus etter fagocytose av humane PMN-er.Vekstkurver definert av den optiske tettheten ved 600 nanometer og konsentrasjonen av bakterier må bestemmes for de relevante Staph aureusstammene før bruk i denne analysen. Start over natten kulturer av S.aureus stammer og subkultur bakterier, som beskrevet tidligere. Når subkulturert Staph aureus har nådd midten eksponentiell vekst, overføre en milliliter kulturbakterier til 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og sentrifuge på 5000 g i fem minutter ved romtemperatur.Vask S.aureus ved å aspirere sin supernatant uten å forstyrre pellet og gjenbruke pelleted bakterier på en milliliter DPBS. Vortex prøvene i 30 sekunder. Sentrifuger prøvene ved 5.000 g i fem minutter ved romtemperatur.For å oksenisere Staph aureus, må du først bruke bakteriepellet i en milliliter på 20 % humant serum. Deretter inkubere prøver ved 37 grader Celsius med agitasjon i 15 minutter. Vask oksenisert Staph aureus etter sentrifugering som vist tidligere.Fortynn okseniserte Staph aureus stammer til en ganger 10 til 8th kolonidannende enheter, CfUer per milliliter, med iskald RPMI. Vortex prøven i 30 sekunder og plasser på is. Bekreft konsentrasjonene av Staph aureus som brukes til disse analysene ved å plating en til 10 seriell fortynning av bakterier på agar.Tilsett forsiktig 100 mikroliter per brønn av hver Staph aureusstamme, eller RPMI for positive og negative kontroller, til PMN-er i en 96-brønns plate på is fra trinn 1.14. Forsiktig steinplate for å distribuere Staph aureus i brønner. Synkroniser fagocytose ved å sentrifugere plate ved 500 g i åtte minutter ved fire grader Celsius og inkubere plate ved 37 grader Celsius umiddelbart etter sentrifugering som tid null.På ønsket tidspunkt, legg platen på is og tilsett 200 mikroliter iskalde DPBS som inneholder en mikroliterpropidiumjodid til hvert strømningscytometrirør og overfører deretter prøver til deres tilsvarende rør. Analyser prøver for propidiumjodidfarging ved hjelp av strømningscytometri som beskrevet i 2,8 og 2,9. Transkripsjonen av bikomponentleukotoksiner som retter seg mot menneskelige PMN-er av Staph aureus, krever at SA- eller S2-komponentsystemet demonstrerer nytten av de beskrevne analysene for å kvantifisere Staph aureus cytotoksisitet mot menneskelige PMN-er.Disse eksperimentene ble utført med en klinisk relevant Staph aureus isolat identifisert som USA300 i en isologenic sletting mutant av SA eller S i denne stammen. Venstre panel viser rensede PMN-er, og det høyre panelet viser bevisst forurensede prøver som et eksempel. PMN isolert ved hjelp av prosedyrene beskrevet i del en av denne protokollen ble farget med propidiumjodid og undersøkt ved hjelp av strømningscytometri.Forover og side scatter tomter ble brukt til å oppdage forurensning av renset PMN av monocytter eller lymfocytter i år 1A og 1B PMN integritet ble bestemt ved hjelp av propidium iodide farging. Ved å bruke den beskrevne metoden for menneskelig PMN-rensing, kan vi konsekvent isolere fem ganger 10 til 7 til en ganger 10 til 8th PMN som er over 98% rene og er over 95% propidiumjodid negativ.Cytotoksisiteten av ekstracellulære proteiner produsert av USA300 og AsaeR/S mutert ble testet mot rensede PMN-er. Disse eksperimentene viser en konsentrasjonsavhengig økning i propidiumjodidfarging av rensede PMN etter 30 minutters forgiftning med ekstracellulære proteiner produsert av USA300, men ikke med AsaeR/S mutant. Videre eksperimenter viste en jevn økning i andelen propidiumjodidpositive PMN etter forgiftning av USA300 ekstracellulære proteiner som platået etter ca. 30 minutter.Minimal propidiumjodidfarging av humane PMN-er ble notert til enhver tid etter eksponering for ekstracellulære proteiner produsert av AsaeR/S mutert. Sist ble cytotoksisiteten til USA300 og AsaeR/S mutant mot PMN etter synkronisert fagocytose testet, en konsentrasjonsavhengig økning i andelen propidiumjodidpositive PMN ble observert 90 minutter etter at phagocytosis av USA300. Signifikant færre PMN var propidiumjodidpositive etter asaeR-mutertens fagocytose.Opplisting av USA300 og AsaeR/S mutert inoculum ble brukt i hvert av disse eksperimentene viste at kontrasten i cytotoksisitet mellom disse stammene ikke skyldtes forskjeller i konsentrasjonen av bakterier som brukes. Denne protokollen beskriver rensinger av PMN fra menneskelig blod i to forskjellige teknikker for å kvantifisere cytoktoksisiteten til S.aureus mot disse medfødte immuncellene. Suksessen til disse prosedyrene vil avhenge av kvaliteten på de rensede PMNene og riktig fremstilling av Staph aureusbakterier eller supernatanter.Vennligst se hele manuskriptet for viktige punkter å vurdere mens du utfører disse prosedyrene. USA300 er en virulent MRSA isolat og tap av AsaeR / S dramatisk reduserer transkripsjon av virulens faktorer som målretter menneskelige PMN, noe som gjør disse stammene ideelle modeller for å sammenligne cytotoksisitet ved hjelp av analysene beskrevet. Skreddersy vekstforhold, volumer av supernatants lagt, eller forholdet mellom bakterier og PMN kan være nødvendig når du bruker andre stammer av Staph aureus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Eksperimentell Endokarditt Modell av Meticillin Resistent<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) i Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Vekst med humant hemoglobin som en Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multipleks PCR-analyse for typing av stafylokokk Cassette Kromosom Mec Typer I til V i Meticillinresistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studerer Samhandling av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergi og Oksidativt Burst: Protokoller for isolering og evaluering av humane leukocytter og blodplater

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocytter fra Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Bruke Resazurin Basert Narkotika mottakelighet analyse

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotyping av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; av Ribosomalt Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...