Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health beviljar NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 samt medel från Montana State University Agriculture experiment Station, och en utrustning bidrag från Murdock välgörenhet Trust .

Heparinized venöst blod från friska donatorer samlades in i enlighet med protokoll som godkänts av den institutionella prövnings nämnden för mänskliga ämnen vid Montana State University. Alla givare gav skriftligt medgivande till att delta i denna studie.
1. rening av humana polymorfonukleära leukocyter och isolering av humant serum
Anmärkning: alla reagenser bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på förekomst av endotoxin med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt endotoxinhaltigt kit och bör innehålla < 25,0 pg/mL endotoxin för att förhindra oönskad priming av PMNs.
<ol><li>Ta 50 mL 3% dextran-0,9% NaCl (w/v), 35 mL av 0,9% NaCl (w/v), 20 mL 1,8% NaCl (w/v), 12 mL av 1,077 g/mL densitet gradient lösning, och 20 mL av injektion-eller bevattning-grade vatten till rumstemperatur.</li>
	<li>För att isolera humant serum, inkubera 4 mL nydraget humant blod utan antikoagulantia vid 37 ° c i ett 15 mL glasrör i 30 min. Efter inkubering, Centrifugera provet vid 2000 – 3000 × g för 10 min vid rumstemperatur. Överför det övre serum skiktet till ett nytt 15 mL koniskt centrifugerör och placera på isen.</li>
	<li>Kombinera 25 mL nydragen hepariniserad (1000 enheter/mL) hela humanblod med 25 mL rumstemperatur 3% dextran-0,9% NaCl (1:1 ratio) i två replikat 50 mL koniska centrifugrör (50 mL total volym per tub). Blanda genom att försiktigt gunga varje 50 mL koniskt rör och låt stå i rumstemperatur i 30 min.</li>
	<li>Efter inkubering vid rumstemperatur visas två separata skikt. Överför det översta lagret av varje dextran-blodblandning till nya 50 mL koniska rör och centrifugera vid 450 x g i 10 min vid rumstemperatur med låga eller inga bromsar.</li>
	<li>Försiktigt aspirera både samman supernatanterna och kassera utan att störa cell pellets. Försiktigt Omsuspendera varje cell pellet i 2 mL rumstemperatur 0,9% NaCl, kombinera de återställd pellets i en enda 50 mL koniskt rör, tillsätt sedan resterande 0,9% NaCl (slutlig volym av 35 mL).</li>
	<li>Lägg försiktigt till 10 mL rumstemperatur på 1,077 g/mL densitet gradient lösning under cellsuspensionen med hjälp av en handpipett. Snurra på 450 x g i 30 min vid rumstemperatur med låga eller inga bromsar. Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelleten. Supernatanten kommer att innehålla perifert blod mononukleära celler som kan samlas in som tidigare beskrivits14.</li>
	<li>Lysera de röda blodkropparna genom att omlägga cellpelleten i 20 mL rumstemperatur vatten. Blanda försiktigt genom att gunga röret i 30 s. Lys av röda blodkroppar kommer att åtföljas av en tydlig minskning av grumlighet.</li>
	<li>Tillsätt omedelbart 20 mL 1,8% NaCl (vid rumstemperatur [RT]) och centrifugera provet på 450 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Obs: det är viktigt att minimera den tid som PMNs lämnas i vatten ensamt efter röda blodkroppar Lys för att maximera PMN avkastning och förhindra PMN Lys och/eller aktivering.</li>
	<li>Aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelleten. Omsuspendera cellpelleten försiktigt i 2 mL RT RPMI 1640 medium och placera den på isen.</li>
	<li>Räkna celler med hjälp av en hemocytometer. Resuspend renas PMNs vid en koncentration av 1 x 107 celler/ml med ISKALLA RPMI och hålla på is.</li>
	<li>Kombinera 100 μL renade PMNs (1 x 106 celler) med 300 μl av iskalla Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (dpbs) innehållande 1 μl propidiumjodid jodid i två replikerande flödescytometerrör. För en positiv kontroll för plasmamembran skador, tillsätt 40 μL av 0,5% Triton X-100 lösning i en av flödescytometri rören och blanda grundligt.</li>
	<li>Använd flödescytometri för att mäta de renade cellernas framåtriktade spridnings-, sido spridnings-och propidiumjodid jodid-färgning (excitation/emission Maxima vid 535/617 nm) (figur 1). Anmärkning: framåt och sida scatter-analys kommer att identifiera oönskade populationer av lymfocyter och monocyter. Propidiumjodid jodid kommer endast att fläcka celler med ett komprometterat plasmamembran och renade PMNs som har uttalad population av propidiumjodid jodid positiva celler bör inte användas. För dessa studier användes renade PMNs endast om de bestod > 98% av renade celler och < 5% färgade positiva för propidiumjodid jodid.</li>
	<li>Förbered en 96-brunn plattan för PMN cytotoxicitet analyser genom beläggning enskilda brunnar som kommer att användas i denna analys med 100 μL av 20% isolerat humant serum som har späts med DPBS. Obs: bordläggningen PMNs direkt på plast eller glas kommer att orsaka aktivering av cellerna. Var noga med att inkludera minst en negativ kontroll väl som bara kommer att ta emot media och minst en positiv kontroll väl som kommer att få 0,05% Triton X-100.</li>
	<li>Inkubera plattan vid 37 ° c i 30 min. Efter inkubering tvättar du de belagda brunnarna två gånger med iskalla DPBS för att avlägsna eventuellt överskott av serum. Knacka försiktigt plattan upp och ner för att ta bort eventuella kvarvarande DPBS och placera på is.</li>
	<li>Tillsätt försiktigt 100 μL renad Human PMNs vid 1 x 107 celler/ml till varje belagd brunn (1 x 106 PMNs/well). Tillåt PMNs att bosätta sig i brunnar genom att ruinera plattan på isen i minst 5 min. Håll plattnivån för att möjliggöra jämn fördelning av celler i varje brunn och lämna på isen för att undvika oönskad aktivering av PMNs.</li>
</ol>2. cytotoxicitetstest av S. aureus extracellulära proteiner mot humana polymorfonukleära leukocyter
<ol><li>Kultur S. aureus över natten i Tryptic soy buljong (TSB) med hjälp av en skakning inkubator inställd på 37 ° c. För dessa studier inokulerades 20 mL TSB i separata 150 mL Erlenmeyer-kolvar med frysta kulturer av S. aureus -stammar USA300 eller USA300ΔSaer/s och odlas under cirka 14 timmar med skakning vid 250 RPM.</li>
	<li>Subculture S. aureus genom att utföra en 1:100 utspädning av natten bakteriell kultur med färska medier. Inkubera vid 37 ° c med skakning tills bakterierna når tidig stationär tillväxtfas. Anmärkning: för dessa experiment, 20 mL tryptic soja buljong i 150 mL Erlenmeyer flaskor inokulerades med 200 μL av natten odlade USA300 eller USA300ΔSaer/S och inkuberades vid 37 ° c med skakning vid 250 RPM för 5 h.</li>
	<li>När bakterierna har nått tidig stationär tillväxtfas, överför 1 mL av subodlade S. aureus till ett 1,5 ml microcentrifugerör och centrifugera vid 5 000 × g i 5 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Överför supernatanten till en 3 mL spruta efter centrifugering. Passera samman supernatanterna genom ett 0,22 μm filter och till en ny 1,5 ml microcentrifug rör på is.</li>
	<li>Utför seriella utspädningar av samman supernatanterna med iskallt material som används för att odla S. aureus. Anmärkning: för de experiment som visas, samman supernatanterna från USA300 och USA300ΔSaer/S genomgick fyra på varandra följande 1/2 log spädningar med iskalla TSB.</li>
	<li>Tillsätt försiktigt supernatanten prover eller media ensamt (för negativa och positiva kontroller) till enskilda brunnar i 96-brunn plattan som innehåller PMNs på is från steg 1,15. För dessa experiment lades 10 μL av USA300 eller USA300ΔSaer/S supernatanten prover till varje brunn. Försiktigt vagga plattan för att fördela samman supernatanterna i brunnar och inkubera vid 37 ° c.</li>
	<li>Vid önskade tidpunkter, ta bort plattan från inkubator och placera på isen. Tillsätt 40 μL 0,5% Triton X-100 till den positiva kontroll brunnen.</li>
	<li>Pipettera försiktigt proverna uppåt och nedåt i varje brunn för att helt dra av alla PMNs som sitter fast på plattan och överför sedan proverna till flödescytometerrör på is som innehåller 300 μL iskalla DPBS med 1 μL propidiumjodid iodide.</li>
	<li>Mät andelen propidiumjodid iodide-positiva PMNs med flödescytometri (figur 2A). När bunden till DNA, propidiumjodid jodid har excitation/emission vid 535/617 nm.</li>
</ol>3. S. aureus cytotoxicitetstest mot humana polymorfonukleära leukocyter efter fagocytos
Anm: tillväxtkurvor som definieras av den optiska densiteten vid 600 Nm (OD600) och koncentrationen av bakterier måste bestämmas empiriskt för de S. aureus -stammar som ska testas innan denna analys påbörjas. Framgången för dessa experiment kräver konsekvent skörd av lika koncentrationer av varje S. aureus stam testas vid mitten av exponentiell tillväxtfas med hjälp av OD600 av sub-odlade bakterier.
<ol><li>Börja över natten kulturer av S. aureus stammar och subkulturer bakterier som beskrivs i steg 2.1.1 och 2.1.2.</li>
	<li>Harvest subkultiverade S. aureus när den har nått mitten av exponentiell tillväxt genom att överföra 1 ml odlade bakterier till en 1,5 ml microcentrifug röret och centrifugering vid 5 000 × g för 5 min vid rumstemperatur. Obs: under våra tillväxtförhållanden, USA300 och USA300ΔSaer/S nådde mitten av exponentiell tillväxtfas efter cirka 135 min av inkubering6.</li>
	<li>Tvätta S. aureus efter centrifugering genom att aspirera på supernatanten, resuspendera pelleterade bakterier i 1 ml dpbs, vortexa provet för 30 S, och centrifugering vid 5 000 × g för 5 min vid rumstemperatur.</li>
	<li>Opsonize S. aureus genom att reomera den bakteriella pelleten i 1 ml 20% humant serum späddes med dpbs och inkuberas vid 37 ° c med agitation i 15 min.</li>
	<li>Centrifugera verksamhet bakterier vid 5 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Tvätta S. aureus efter centrifugering genom aspirera på supernatanten, resuspendera pelleterade bakterier i 1 ml dpbs, sedan Vortex provet tills bakterien pelleten är helt bruten isär plus ytterligare 30 sekunder. Centrifugera bakterier vid 5 000 × g i 5 min vid rumstemperatur.</li>
	<li>Omsuspendera verksamhet S. aureus stammar i 1 ml RPMI, Vortex provet tills bakteriell pellet är helt bruten isär, och sedan för ytterligare 30 S. Placera bakterier på is.</li>
	<li>Späd verksamhet S. aureus stammar till önskad koncentration med iskall RPMI. Vortex för 30 s och plats på is.</li>
	<li>Bekräfta koncentrationen av verksamhet S. aureus genom plätering 1:10 seriella utspädningar av bakterier på tryptic soja agar. Anmärkning: eftersom skillnader i koncentrationen av bakterier som används i denna analys kan ha en stor inverkan på efterföljande PMN plasmamembran permeabilitet (figur 3a), det är mycket viktigt att koncentrationen av varje stam testas bestäms för varje experiment och är likvärdig mellan stammar.</li>
	<li>Tillsätt försiktigt 100 μL/brunn av varje S. aureus -stam eller RPMI (för positiva och negativa kontroller) till PMNs i 96-brunnen plattan på is från steg 1,14. Försiktigt vagga plattan för att fördela S. aureus i brunnar.</li>
	<li>Synkronisera fagocytos genom centrifugering plattan vid 500 × g för 8 min vid 4 ° c15. Inkubera plattan vid 37 ° c omedelbart efter centrifugering (T = 0).</li>
	<li>Vid önskade tidpunkter, ta bort plattan från inkubator och placera på isen. Tillsätt 40 μL 0,5% Triton X-100 till den positiva kontroll brunnen.</li>
	<li>Pipettera försiktigt proverna uppåt och nedåt i varje brunn för att helt dra av alla PMNs som sitter fast på plattan och överför sedan proverna till flödescytometerrör på is som innehåller 200 μL iskall DPBS med 1 μL propidiumjodid jodid.</li>
	<li>Analysera prover för färgning av propidiumjodid jodid med flödescytometri enligt beskrivningen i steg 2,9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., H&#246;&#246;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+invasion+and+evasion:+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus.">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li><li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses.">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+toxins.">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li><li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epic+Immune+Battles+of+History:+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus.">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li><li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytes.">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li><li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis.">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li><li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR/S+Dependent.">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+SaeR/S-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production.">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li><li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR/S-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus.">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li><li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence.">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).</li><li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocidins:+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors.">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li><li>B&#248;yum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils.">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Detta protokoll beskriver rening av PMNs från humant blod och två distinkta analyser som använder propidiumjodid jodid för att kvantifiera cytotoxiciteten hos S. aureus mot dessa viktiga medfödda immunceller. Framgången för dessa förfaranden kommer att bero på kvaliteten på renade PMNs och lämplig beredning av S. aureus och extracellulära proteiner som produceras av denna patogen. För isolering av PMNs, är det viktigt att minimera PMN aktivering under och efter rening genom att använda reagenser fria från endotoxin förorening, behandla cell preparat försiktigt, och hålla celler vid lämplig temperatur. Tecken som indikerar aktivering av PMNs inkluderar klumpar av celler under rening och när mer än 5% av isolerade celler fläcken positiv för propidiumjodid jodid. På grund av PMNs relativt korta livslängd måste dessa celler isoleras från mänskligt blod och testas samma dag. PMNs kommer att börja uppvisa tecken på spontan apoptos om de lämnas på is under mer än 3 h efter rening. Som tidigare nämnts, det är mycket viktigt att varje PMN beredning utvärderas noggrant med hjälp av flödescytometri analys av framåt och sida scatter samt propidiumjodid jodid färgning för att säkerställa renhet och integritet isolerade celler.
Uttrycket av BI-komponent leukocidins av S. aureus är ansvarig för majoriteten av äventyras PMN plasmamembran integritet som observeras med hjälp av analyser som beskrivs i detta protokoll. Variation i uttrycket av dessa toxiner och andra Porbildande peptider, såsom fenollösliga Moduliner, mellan stammar av S. aureus kommer att producera skillnader i cytotoxicitet mot mänskliga PMNs. signifikanta avvikelser under in vitro-tillväxt mellan S. aureus stammar kommer också att påverka uttrycket av Porbildande toxiner och efterföljande cytotoxicitet. Dessutom, förhållandet mellan S. aureus till PMNs i fagocytos analyser har en stor inverkan på efterföljande PMN plasmamembran permeabilitet (figur 3a) och dessa experiment kräver konsekvent skörd av lika koncentrationer av varje S. aureus stam testas vid mitten av exponentiell tillväxtfas med hjälp av OD600 av subodlade bakterier. Med tanke på dessa överväganden, det är mycket viktigt att definiera tillväxtkurvor för alla stammar som kommer att undersökas innan du påbörjar cytotoxicitetsanalyser. Vi rekommenderar inte dessa metoder för att analysera S. aureus cytotoxicitet med stammar som uppvisar signifikanta tillväxtskillnader in vitro.
USA300 är ett virulent MRSA-isolat som är känt för att vara mycket cytotoxiskt mot humant PMNs15 och förlusten av Saer/S i denna stam minskar dramatiskt transkription av många bi-komponent leukocidins som riktar mänskliga PMNs6,12, vilket gör dessa stammar idealiska modeller för att jämföra cytotoxicitet med hjälp av de beskrivna analyserna. Emellertid, det finns omfattande genetisk variation mellan olika s. aureus isolat och de parametrar som beskrivs i dessa protokoll kan inte resultera i betydande förändringar i cytotoxicitet mot mänskliga PMNs när man testar andra S. aureus stammar. Att skräddarsy tillväxtförhållanden, volymer av supernatanter tillsätts eller förhållandet mellan bakterier till PMNs kan krävas för framgång med dessa metoder med hjälp av andra stammar av S. aureus.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus är en grampositiv bakterie som orsakar ett brett spektrum av sjukdomar hos människor. Denna framstående patogen producerar många virulensfaktorer som bidrar till olika aspekter av infektion. Dessa inkluderar ytan molekyler som gör att S. aureus att följa olika typer av värd vävnad1, extracellulära proteiner som stör värden immunsvar2, och en matris av utsöndras toxiner som riktar sig mot olika typer av värdceller3. I denna rapport beskriver vi en metod som kvantifierar cytotoxiciteten hos extracellulära proteiner som produceras av S. aureus mot humana polymorfonukleära leukocyter (PMNs eller neutrofiler), primära effektorceller i värdens medfödda immunsvar.
PMNs är de vanligast förekommande leukocyterna hos däggdjur. Dessa cirkulerande immunceller snabbt rekryteras till platsen för värd vävnad förolämpning som svar på varningssignaler som produceras av inhemska celler eller av föreningar som är unika för invaderande mikrober. Den extracellulära ingången från dessa molekyler och från direkta kontakter med aktiverade inhemska värdceller under extravasering ökar aktiveringstillståndet för PMNs i en process som kallas priming4,5. Primed PMNs som har nått nödställda vävnad sedan utföra viktiga medfödda immunsvar som utformats för att förhindra inrättandet av infektion. Dessa inkluderar bindning och internalisering, eller fagocytos, av invaderande mikroorganismer som utlöser en kaskad av intracellulära händelser kumulera i mikrobe förstörelse av ett batteri av potenta antimikrobiella föreningar5.
PMNs spelar en viktig roll som skyddar människor från invaderande patogener och är särskilt viktiga för att förebygga S. aureus infektion4. Denna bakterie producerar dock ett brett spektrum av virulensgener som hämmar olika PMN-funktioner. Dessa inkluderar extracellulära proteiner som blockerar erkännandet av signalmolekyler, förhindra vidhäftning till värd vävnad, hämma produktionen av antimikrobiella föreningar, och kompromiss plasmamembran integritet4. S. aureus iscengör det temporala uttrycket av dessa virulensgener genom den kollektiva ingången från flera sensoriska system med två komponenter som erkänner specifika Miljösignaler. Den Saer/S två-komponent-systemet är en större upp-regulator av S. aureus virulens gen transkription underinfektion 6,7,8,9,10,11. I synnerhet har detta två-komponent-system visat sig vara avgörande för produktionen av BI-komponent leukocidins som specifikt riktar sig till Human PMNs12.
Detta protokoll är uppdelat i tre olika sektioner. I det första avsnittet beskrivs rening av PMNs från humant blod med hjälp av densitetsgradientcentrifugering med hjälp av ett protokoll som har anpassats från de metoder som fastställts av Bøyum13 och Nauseef14. Den andra och tredje avsnitt detalj två olika tekniker för att undersöka S. aureus cytotoxicitet; en berusar PMNs med extracellulära proteiner som produceras av S. aureus medan den andra undersöker förmågan hos levande bakterier att skada PMNs efter fagocytos. Dessa förfaranden använder propidiumjodid jodid att mäta förlusten av PMN plasmamembran integritet orsakad av S. aureus pore-Forming toxiner. Propidium jodid är en DNA-bindande fluorophore som normalt är cellmembranet ogenomtränglig men kan korsa plasmamembran som har störts av S. aureus toxiner. Flödescytometrianalys gör det möjligt att snabbt kvantifiera propidiumjodid iodide-positiva PMNs för att mäta den relativa cytotoxiciteten hos S. aureus -stammar. Meticillinresistenta S. aureus (MRSA) identifierats som pulsad-fält gel elektrofores typ USA300 och en ISOGEN radering Mutant av Saer/s i denna stam (USA300ΔSaer/s) har använts som modeller för att visa hur dessa förfaranden kan kvantifiera cytotoxicitet av S. aureus mot mänskliga PMNs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

Staphylococcus aureus kan utsöndrande ett brett spektrum av leukocidins att rikta och störa membranet integritet polymorfonukleära leukocyter (PMNs eller neutrofiler). Detta protokoll beskriver både rening av mänskliga PMNs och kvantifiering av S. aureus cytotoxicitet mot PMNs i tre olika sektioner. Avsnitt 1 specificerar isoleringen av PMNs och serum från humant blod med hjälp av densitetscentrifugering. Avsnitt 2 testar cytotoxiciteten av extracellulära proteiner som produceras av S. aureus mot dessa renade humana PMNs. avsnitt 3 mäter cytotoxiciteten mot humana PMNs efter fagocytos av levande S. aureus. Dessa förfaranden mäta störningar av PMN plasmamembran integritet av S. aureus leukocidins använder flödescytometri analys av PMNs behandlas med propidiumjodid jodid, en DNA-bindning fluorofore som är cellmembranet ogenomtränglig. Kollektivt, dessa metoder har fördelen av att snabbt testa S. aureus cytotoxicitet mot primära mänskliga PMNs och kan lätt anpassas för att studera andra aspekter av Host-patogen interaktioner.

Vi har visat hur de förfaranden som beskrivs ovan kan användas för att relativt kvantifiera cytotoxicitet av S. aureus mot mänskliga PMNs med MRSA PFGE-typ USA300 och en ISOGEN radering Mutant av Saer/s i denna stam (USA300ΔSaer/s) som genereras i tidigare studier6. PMNs som isolerats med de förfaranden som beskrivs i avsnitt 1 i detta protokoll färgas med propidiumjodid jodid och undersöktes med flödescytometri. Fram-och sido spridningsdiagram användes för att illustrera kontaminering av renade PMNs med monocyter eller lymfocyter (figur 1A, B) och PMN-integritet fastställdes med hjälp av propidiumjodid jodid-färgning (figur 1C). Den beskrivna metoden för mänsklig PMN rening kan konsekvent ge 0,5 x 107 till 1 x 108 PMNs som är > 98% ren och är > 95% propidiumjodid jodid negativ.
Den cytotoxicitet av extracellulära proteiner som produceras av USA300 och USA300ΔSaer/S testades mot renade PMNs (figur 2) enligt de förfaranden som beskrivs i avsnitt 2 i detta protokoll. Dessa experiment visar en koncentrationsberoende ökning av färgning av propidiumjodid jodid av renade PMNs efter 30 min av berusning med extracellulära proteiner som produceras av USA300 (figur 2B). Tidigare studier har visat att Saer/S Tvåkomponentsystem är viktigt för uttryck av många bi-komponent leukocidins som riktar sig till mänskliga PMNs6,10,11,16. Congruent med dessa tidigare fynd, mycket få propidiumjodid iodide-positiva PMNs upptäcktes efter exponering för extracellulära proteiner som produceras av USA300ΔSaer/S (figur 2B). Ytterligare experiment visade en stadig ökning av andelen lyserade PMNs efter förgiftning av USA300 extracellulära proteiner som nått sitt tak efter cirka 30 min (figur 2C). Minimal lys av humana PMNs noterades vid alla tidpunkter efter exponering för extracellulära proteiner som produceras av USA300ΔSaer/S. Dessa resultat illustrerar nyttan av denna analys för den relativa kvantifiering av cytotoxicitet av extracellulära S. aureus proteiner mot mänskliga PMNs.
Vi testade USA300 och USA300ΔSaer/s med hjälp av s. aureus Cytotoxicitetstest mot Human PMNs efter fagocytos som beskrivs i avsnitt 3 i detta protokoll (figur 3). En koncentrationsberoende ökning av andelen propidiumjodid jodid positiva PMNs observerades 90 min efter fagocytos av USA300 (figur 3A). En signifikant minskning observerades i andelen PMNs som var positiva för propidiumjodid jodid efter fagocytos av USA300ΔSaer/s (figur 3A), vilket stödde andra resultat som indikerar att Saer/s två-komponentsystem är viktigt för cytotoxiciteten av s. aureus mot humana PMNs (figur 2)7,11. Som tidigare nämnts och visat i figur 3A, skillnader i S. aureus koncentration har en uttalad inverkan på PMN Lys efter fagocytos. Uppräkning av USA300 och USA300ΔSaer/S inokulum som används i vart och ett av dessa experiment visade att kontrasten i cytotoxicitet mellan dessa stammar inte berodde på skillnader i koncentrationen av bakterier som används (figur 3B). Dessa fynd visar hur s. aureus cytotoxicitetstest mot humana PMNs efter fagocytos kan användas för att bedöma förmågan hos olika s. aureus stammar att äventyra människans PMN plasmamembran integritet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> Figur 1: flödescytometri analys av renade PMNs. Representativ flödescytometri dot tomter av (a) renade mänskliga PMNs och (B) PMNs som avsiktligt har kontaminerats med perifera mononukleära blodceller. (C) representativt flödescytometrihistogram som visar minimal färgning av propidiumjodid jodid (< 1%) av renade PMNs (skuggad grå) jämfört med PMNs som behandlats med 0,05% Triton X-100 (skuggad röd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> Figur 2: flödescytometri analys av PMNs berusade med extracellulära proteiner som produceras av S. aureus. (A) representativt flödescytometri histogram över PMNs färgas med propidiumjodid jodid efter 30 min av inkubering med Media kontroll (skuggad blå), filtrerad USA300 supernatanten vid en slutlig koncentration av 1:110 (skuggad grå), eller 0,05% Triton X-100 (skuggad röd). B) andelen positiva PMNs av propidiumjodid-jodid efter 30 min inkubation med olika koncentrationer av USA300 eller USA300 ∆Saer/S- supernatanter. C) andelen propidiumjodid jodid positiva PMNs med tiden efter inkubering med USA300 eller USA300 ∆Saer/S supernatanten vid en slutlig koncentration av 1:110. Data presenteras som medelvärde ± SEM av minst 3 separata experiment med * p ≤ 0,05 och * * p ≤ 0,005, som bestäms av tvåsidiga t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> Figur 3: flödescytometri analys av PMNs efter fagocytos av S. aureus. (A) andelen propidiumjodid jodid positiva PMNs 90 min efter fagocytos av olika koncentrationer av USA300 eller USA300 ∆Saer/S. B) koncentrationen av opsoniserade S. aureus -stammar som används för de experiment som visas i panel A. data presenteras som medelvärdet ± SEM av 4 separata experiment med * p ≤ 0,01, som bestäms av tvåsidiga t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Detta protokoll beskriver en metod för rening av polymorfonukleära leukocyter från hela humanblod och två distinkta analyser som kvantifierar cytotoxiciteten av Staphylococcus aureus mot dessa viktiga medfödda immunceller.

Kvantifiering av cytotoxiciteten hos staphyloccus aureus mot humana polymorfonukleära leukocyter

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Staphylococcus aureus är en grampositiv bakterie som producerar ett brett spektrum av virulensfaktorer som främjar patogenes. Dessa inkluderar bikomponent leukotoxiner som stör membranet integritet polymorfouklear leukocyter, även kallad PMNs eller neutrofiler. Denna video illustrerar isoleringen av PMNs från mänskliga helblod och två distinkta analyser för kvantifiera S.aureus cytotoxicitet mot dessa viktiga medfödda immunceller.Dessa analyser kan alla åstadkommas med standard laboratorieutrustning och är lätt anpassningsbara för att undersöka andra aspekter av värd patogen interaktion. Dessa experiment kommer att använda helblod från mänskliga givare och kommer att kräva godkännande från lämplig institutionell kommitté eller granskningsnämnd samt ett uttalande om att informerat samtycke erhölls från alla deltagare. Det första steget i detta förfarande är isolering av neutrofiler genom användning av centrifuger och densitet gradienter.För det första, ta med 50 milliliter av 3%dextran 0,9%natriumklorid, 35 milliliter 0,9%natriumklorid, 20 milliliter av 1,8%natriumklorid, 12 milliliter på 1,077 gram per milliliter ficoll-lösning och 20 milliliter vatten till rumstemperatur. Överför 25 milliliter av nyritat hepariniserat helmänskligt blod till två koniska centrifugrör. Kombinera 25 milliliter nyritat hepariniserat helblod med 25 milliliter motsvarande volym av rumstemperatur, 3%dextran, 0,9%natriumklorid i ett ett-till-ett-förhållande.Blanda genom att försiktigt gunga varje 50 milliliter koniskt rör och låt sedan stå i rumstemperatur i 30 minuter. Efter inkubation vid rumstemperatur kommer två separata lager att visas. Överför det översta lagret av varje dextran blodblandning i nya 50 milliliter koniska rör.Centrifugera vid 450 g i 10 minuter vid rumstemperatur med låga eller inga pauser. Aspirera försiktigt både supernatanter och kassera utan att störa cellpelletsen. Försiktigt återanvänd varje cell pellet i två milliliter av 0,9%natriumklorid.Kombinera återanvända pellets i en enda, 50 milliliter konisk tillsätt sedan de återstående 0,9%natriumklorid till en slutlig volym på 35 milliliter. Lägg försiktigt 10 milliliter på 1,077 gram per milliliter ficoll-lösning under cellfjädringen med hjälp av en handpipett. Efter spinning på 450 g i 30 minuter vid rumstemperatur, med låga eller inga pauser, försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpelletsen, som tidigare visats.Lysa de röda blodkropparna genom att resuspending cell pelleten i 20 milliliter av rumstemperatur vatten. Blanda försiktigt genom att gunga i 30 sekunder. Tillsätt omedelbart 20 milliliter av 1,8%natriumklorid och centrifugprov vid 450 g i 10 minuter vid rumstemperatur.Aspirera försiktigt supernatant som visats tidigare. Försiktigt återanvänd cell pelleten i två milliliter rumstemperatur RPMI och placera på is. Räkna celler med hjälp av en hemacytometer.Resuspend renat PMNs vid en koncentration av en gång 10 till 7: e celler per milliliter med iskall RPMI och hålla på is. Kombinera 100 mikroliter av renade PMNs med 300 mikroliter av DPBS, innehållande en mikroliter av propidium iodidfläck i två replikat flödescytometrirör. För en positiv kontroll, tillsätt 40 mikroliter av 0,5%Triton X-100 lösning i en av flödescytometrirören och blanda noggrant.Använd flödescytometri för att mäta framåtspridd, sidospridning och propidium-iodidfärgning för att bestämma renhet och integritet hos isolerade PMNs. Endast PMN-preparat som ligger över 98%ren och över 95%propidium iodidenegativa skall användas. För protokollet som beskriver isoleringen av normalt humant serum, hänvisa till det fullständiga manuskriptet.Förbered en 96-brunnsplatta för PMN cytotoxicitetsanalyser genom att tillsätta 100 mikroliter av 20%isolerade humant serum utspädd med DPBS till enskilda brunnar som kommer att användas i denna analys. Var noga med att inkludera minst en negativ kontroll väl som bara kommer att få media och minst en positiv kontroll väl som kommer att få 0,05%Triton X.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Efter inkubationen, tvätta kodade brunnar två gånger med 100 mikroliter av iskall DPBS och placera plattan på is.Ta bort eventuella kvarvarande DPBS från plåt brunnar och försiktigt lägga 100 mikroliter av renad mänskliga PMNs på en gång 10 till 7: e celler per milliliter till varje kodade väl. Låt pläterade neutrofiler bosätta sig genom att lämna dem på is i minst fem minuter före användning i följande cytotoxicitetsanalyser. Detta avsnitt beskriver en analys som kvantifierar cytotoxiciteten hos extracellulära proteiner som produceras av staph aureus mot mänskliga PMNs.Kultur S.aureus över natten i lämpliga medier med hjälp av en skakande inkubator inställd på 37 grader Celsius dagen före experimentet. Subkultur S.aureus genom att utföra en en till 100 utspädning av natten bakterier kulturer med färska medier. Inkubera vid 37 grader Celsius med skakningar tills bakterier når tidig stationär tillväxtfas.Efter fem timmars tillväxt, överför en milliliter subkultur S.aureus till en 1,5 milliliter microcentrifug rör och centrifug vid 5, 000 g i fem minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugeringen, aspirera supernatanter. Passera aspirerade supernatanter genom ett 0,22 mikronsprutfilter till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och placera på is.Utför serieutspädningar av supernatanter med iskall media som används för att odla Staph aureus. Tillsätt försiktigt supernatant prover eller media lånas ut för negativa och positiva kontroller till enskilda brunnar av en 96-brunnsplatta som innehåller PMNs på is, som beskrivits tidigare. Försiktigt bergplatta för att fördela supernatanter i brunnar och inkubera i 37 grader Celsius.Vid önskade tidpunkter, ta bort plåt från inkubatorn och placera på is. Tillsätt 300 mikroliter av iskall DPBS som innehåller en mikroliter av propidium iodide till varje flödescytometrirör. Överför proverna till flödescytometrirör på is.För den positiva kontroll väl, tillsätt 20 mikroliter av 10%Triton X till provet före överföring till ett flöde cytometri rör. Analysera propidium iodid färgning av berusade PMNs med hjälp av flödescytometri. Detta avsnitt beskriver en analys som kvantifierar cytotoxicitet av S.aureus efter fagocytos av mänskliga PMNs.Tillväxtkurvor som definieras av den optiska densiteten vid 600 nanometer och koncentrationen av bakterier måste bestämmas för de relevanta Staph aureusstammarna före användning i denna analys. Börja över natten kulturer av S.aureus stammar och subkultur bakterier, som beskrivits tidigare. När subkulturerade Staph aureus har nått mitten av exponentiell tillväxt, överföra en milliliter av kultur bakterier till 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och centrifug vid 5, 000 g i fem minuter vid rumstemperatur.Tvätta S.aureus genom att aspirera dess supernatant utan att störa pelleten och resuspend de pelleterade bakterierna vid en milliliter DPBS. Vortexa proverna i 30 sekunder. Centrifugera proverna vid 5, 000 g i fem minuter vid rumstemperatur.Till oxenize Staph aureus, först resuspend den bakteriella pelleten i en milliliter av 20%humant serum. Inkubera sedan prover vid 37 grader Celsius med agitation i 15 minuter. Tvätta oxenized Staph aureus efter centrifugeringen som visat tidigare.Späd oxenized Staph aureus stammar till en gånger 10 till den 8: e kolonin-formande enheter, CFUs per milliliter, med iskall RPMI. Vortexa provet i 30 sekunder och placera på is. Bekräfta koncentrationerna av Staph aureus som används för dessa analyser genom att plätering en till 10 serieutspädningar av bakterier på agar.Tillsätt försiktigt 100 mikroliter per brunn av varje Staph aureus-stam, eller RPMI för positiva och negativa kontroller, till PMNs i en 96-brunnsplatta på is från steg 1,14. Försiktigt rockplatta för att fördela Staph aureus i brunnar. Synkronisera fagocytos genom centrifugering plattan vid 500 g i åtta minuter vid fyra grader Celsius och inkubera plattan vid 37 grader Celsius omedelbart efter centrifugering som tid noll.Vid de önskade tidpunkterna, lägg plattan på is och tillsätt 200 mikroliter av iskall DPBS som innehåller en mikroliter propidium iodide till varje flöde cytometri röret sedan överföra prover till deras motsvarande rör. Analysera prover för propidium iodidfärgning med hjälp av flödescytometri enligt beskrivningen i 2.8 och 2.9. Transkriptionen av bi-komponent leukotoxiner som riktar mänskliga PMNs av Staph aureus kräver att SA eller S2 komponentsystemet att visa nyttan av de beskrivna assays för kvantifierande Staph aureus cytotoxicitet mot mänskliga PMNs.Dessa experiment utfördes med en kliniskt relevant Staph aureus isolat identifieras som USA300 i en isologenic borttagning mutant av SA eller S i denna stam. Den vänstra panelen föreställer renade PMNs och den högra panelen avbildar avsiktligt förorenade prover som ett exempel. PMNs isolerade med hjälp av de förfaranden som beskrivs i avsnitt ett av detta protokoll var färgas med propidium iodide och undersökas med hjälp av flöde cytometry.Framåt och sida scatter tomter användes för att upptäcka kontaminering av renat PMNs av monocyter eller lymfocyter i år 1A och 1B. PMN integritet bestämdes med hjälp av propidium iodid färgning. Genom att använda den beskrivna metoden för mänskliga PMN rening, kan vi konsekvent isolera fem gånger 10 till den 7: e till en gånger 10 till den 8: e PMNs som är över 98%ren och är över 95%propidium iodide negativ.Cytotoxiciteten hos extracellulära proteiner som produceras av USA300 och AsaeR/S mutant testades mot renat PMNs. Dessa experiment visar en koncentration beroende ökning av propidium iodid färgning av renad PMNs efter 30 minuter av berusning med extracellulära proteiner som produceras av USA300, men inte med AsaeR /S mutant. Ytterligare experiment visade en stadig ökning av andelen propidium iodid positiva PMNs efter berusning av USA300 extracellulära proteiner som planade efter cirka 30 minuter.Minimal propidium iodid färgning av mänskliga PMNs noterades vid alla tidpunkter efter exponering för extracellulära proteiner som produceras av AsaeR/S mutant. Sist, cytotoxicitet av USA300 och AsaeR/S mutant mot PMNs efter synkroniserade fagocytos testades, en koncentration beroende ökning av andelen propidium iodide positiva PMNs observerades 90 minuter efter fagocytos av USA300. Betydligt färre PMNs var propidium iodide positiva efter fagocytos av AsaeR/S mutant.Uppräkning av USA300 och AsaeR/S mutant inokulat användes i vart och ett av dessa experiment visade att kontrasten i cytotoxicitet mellan dessa stammar inte berodde på skillnader i koncentrationen av bakterier som används. Detta protokoll beskriver rening av PMN från humant blod i två distinkta tekniker för kvantifiera cytotoxicitet S.aureus mot dessa medfödda immunceller. Framgången för dessa förfaranden kommer att bero på kvaliteten på de renade PMNs och lämplig beredning av Staph aureus bakterier eller supernatanter.Vänligen konsultera hela manuskriptet för viktiga punkter att överväga när du utför dessa förfaranden. USA300 är en virulent MRSA-isolat och förlusten av AsaeR /S minskar dramatiskt transkription av virulensfaktorer som riktar sig mot mänskliga PMNs, vilket gör dessa stammar idealiska modeller för att jämföra cytotoxicitet med hjälp av de analyser som beskrivs. Skräddarsy tillväxtförhållanden, volymer av supernatanter till, eller förhållandet mellan bakterier till PMNs kan krävas när du använder andra stammar av Staph aureus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Användning av Drip Flow och roterande reaktorer Disk för Staphylococcus aureus Biofilm Analys

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subkutan Infektion med meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimentell Endokardit Modell av Meticillinresistenta<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) i råtta

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Tillväxt med humant hemoglobin som järnkälla

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR-analys f

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studera Interaktioner av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrofiler genom flödescytometri-och Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik och Oxidativ Burst: Protokoll för isolering och utvärdering av humana leukocyter och trombocyter

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Inriktnings Biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Använda Resazurin baserade läkemedlet-känslighet analys

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypning av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; vid Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...