Name: quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Tarafından desteklendi NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 yanı sıra Montana State Üniversitesi Tarım Deney İstasyonu fonları ve Murdock Charitable Trust bir ekipman hibe .

Montana State Üniversitesi İnsan Denekleri Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokol uyarınca sağlıklı bağışçılardan heparinize venöz kan toplandı. Tüm bağışçılar bu çalışmaya katılmak için yazılı izin verdi.
1. İnsan polimorfonükleer lökositlerinin saflaştırılması ve insan serumunun izolasyonu
NOT: Tüm reaktifler, ticari olarak kullanılabilen endotoksin algılama kiti kullanılarak endotoksin varlığı rutin olarak kontrol edilmeli ve PMN'lerin istenmeyen astarlanmasını önlemek için <25.0 pg/mL endotoksin içermelidir.
<ol><li>%3 dekstran-%0,9 NaCl (w/v), 35 mL %0,9 NaCl (w/v), 20 mL %1,8 NaCl (w/v), 12 mL 1,077 g/mL yoğunluk gradyan çözeltisi ve oda sıcaklığına 20 mL enjeksiyon veya sulama sınıfı su getirin.</li>
	<li>İnsan serumu izole etmek için, 37 °C'de 37 °C'de 15 mL cam tüpte 4 mL taze çekilmiş insan kanı kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika için 2.000-3.000 × g santrifüj örneği. Üst serum tabakasını taze 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin.</li>
	<li>25 mL taze çekilmiş heparinize (1000 adet/mL) tam insan kanını 25 mL oda sıcaklığında %3 dekstran-0,9% NaCl (1:1 oran) ile iki çoğaltma 50 mL konik santrifüj tüpünde (tüp başına 50 mL toplam hacim) birleştirin. Her 50 mL konik tüpü hafifçe sallayarak karıştırın ve 30 dk oda sıcaklığında bekletin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında kuluçkadan sonra iki ayrı katman görünür. Her dextran-kan karışımının üst tabakasını yeni 50 mL konik tüplere ve santrifüje 450 x g'de 10 dakika oda sıcaklığında düşük veya frensiz olarak aktarın.</li>
	<li>Dikkatlice hem supernatants aspire ve hücre pelet rahatsız etmeden atın. Her hücre peletini 2 mL oda sıcaklığında %0,9 NaCl'de hafifçe askıya alın, resuspended peletleri tek bir 50 mL konik tüpte birleştirin, sonra kalan %0,9 NaCl'i (35 mL'lik son hacim) ekleyin.</li>
	<li>El pipeti kullanarak hücre süspansiyonunun altında 1,077 g/mL yoğunluk gradyan çözeltisi 10 mL oda sıcaklığını dikkatlice alt altında türün. Düşük veya hiç frensiz oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 450 x g'de döndürün. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı hafifçe aspire edin. Supernatant daha önce açıklandığı gibi toplanabilir periferik kan mononükleer hücreleriiçerecektir 14.</li>
	<li>Oda sıcaklığında su 20 mL hücre pelet resuaskıya alarak kırmızı kan hücreleri lyse. 30 s için tüp sallayarak yavaşça karıştırın. Kırmızı kan hücrelerinin lysis bulanıklık belirgin bir azalma eşlik edecek.</li>
	<li>Hemen oda sıcaklığında 10 dakika için 450 × g de% 1.8 NaCl (oda sıcaklığında [RT]) ve santrifüj örnek 20 mL ekleyin. NOT: PMN verimini en üst düzeye çıkarmak ve PMN lysis ve/veya aktivasyonu önlemek için kırmızı kan hücreli lysis'i takiben PMN'lerin tek başına suda bırakıldığı süreyi en aza indirmek önemlidir.</li>
	<li>Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini 2 mL'lik RT RPMI 1640 orta ve buz üzerinde yavaşça yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücreleri say. 1 x 107 hücre/mL konsantrasyonda buz gibi RPMI ile saflaştırılmış PMN'leri yeniden askıya alın ve buzda tutun.</li>
	<li>100 μL saflaştırılmış PMN'yi (1 x 106 hücre) 300 μL buz gibi dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) içeren 1 μL propidium iyodür lekesi içeren iki çoğaltma akış sitometri tüpünde birleştirin. Plazma membran hasarı için pozitif kontrol için, akış sitometri tüplerinden birine 40 μL %0,5 Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Saflaştırılmış hücrelerin ileri saçılım, yan dağılım ve propidium iyodür boyama (535/617 nm de uyarma / emisyon maxima) ölçmek için akış sitometri kullanın(Şekil 1). NOT: İleri ve yan dağılım analizi istenmeyen lenfosit ve monosit popülasyonlarını belirleyecektir. Propidium iyodür sadece uzlaşmış plazma zarı ve propidium iyodür pozitif hücrelerin popülasyonları belirgin olan saflaştırılmış PMN'ler ile hücreleri leke olacaktır kullanılmamalıdır. Bu çalışmalarda saflaştırılmış PMN'ler sadece saflaştırılmış hücrelerin >%98'ini, propidium iyodür için ise %5 oranında pozitif çıktıklarında kullanıldı.</li>
	<li>DPBS ile seyreltilmiş olan 100 μL%20 izole insan serumu ile bu tahlilde kullanılacak tek tek kuyuları kaplayarak PMN sitotoksisite tahlilleri için 96 kuyuluk bir plaka hazırlayın. NOT: Doğrudan plastik veya cam üzerine KAPAK PMNs hücrelerin aktivasyonu neden olacaktır. Sadece medya ve% 0.05 Triton X-100 alacaksınız en az bir pozitif kontrol iyi alacak en az bir negatif kontrol iyi dahil emin olun.</li>
	<li>Plakayı 37 °C'de 30 dk kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, fazla serumu çıkarmak için kaplanmış kuyuları buz gibi DPBS ile iki kez yıkayın. Herhangi bir artık DPBS kaldırmak ve buz üzerinde yer için yavaşça plaka baş aşağı dokunun.</li>
	<li>Kaplamalı her kuyuya 1 x 107 hücre/mL'de 100 μL saflaştırılmış insan PMN'sini hafifçe ekleyin (1 x 106 PMN/iyi). PMN'lerin en az 5 dakika boyunca plakayı buz üzerinde kuluçkaya yatırarak kuyulara yerleşmelerine izin verin.</li>
</ol>2. İnsan polimorfonükleer lökositlere karşı S. aureus ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisite töz
<ol><li>Kültür S. aureus bir gecede triptik soya suyu (TSB) 37 °C'de bir sallayarak inkübatör kullanarak. Bu çalışmalar için, ayrı 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL TSB, S. aureus suşlarının ABD300 veya USA300ΔsaeR/S'nin donmuş kültürleri ile aşılanmış ve 250 rpm'de sallayarak yaklaşık 14 saat büyümüştür.</li>
	<li>Subculture S. aureus taze medya ile bir gecede bakteri kültürünün 1:100 seyreltme gerçekleştirerek. Bakteriler erken sabit büyüme aşamasına ulaşana kadar 37 °C'de titreyerek kuluçkaya yatınız. NOT: Bu deneyler için, 150 mL Erlenmeyer şişelerinde 20 mL triptik soya suyu 200 μL gecelik kültürlü USA300 veya USA300ΔsaeR/S ile aşılanmış ve 37 °C'de 250 rpm'de 5 saat sallayarak inkülasyon almıştır.</li>
	<li>Bakteriler erken sabit büyüme aşamasına ulaştığında, 1 mL alt kültürlü S. aureus'u 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe ve 5000 × g'de oda sıcaklığında 5 dakika santrifüje aktarın.</li>
	<li>Santrifüjden sonra supernatant'ı 3 mL şırıngaya aktarın. Supernatants'ı 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek buz üzerinde yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne geçirin.</li>
	<li>Kültür S. aureusiçin kullanılan buz gibi medya ile supernatants seri seyreltme gerçekleştirin. NOT: Gösterilen deneyler için, USA300 ve USA300ΔsaeR/S'den süpernatantlar buz gibi TSB ile art arda dört adet 1/2 günlük seyreltme yapıldı.</li>
	<li>1.15 adımdan itibaren buz üzerinde PMN'ler içeren 96 kuyulu plakanın tek tek kuyularına tek başına süpernatant numuneler veya ortam (negatif ve pozitif kontroller için) ekleyin. Bu deneyler için her kuyuya 10 μL USA300 veya USA300ΔsaeR/S supernatant numuneleri eklenmiştir. Yavaşça kaya plakası kuyularda supernatants dağıtmak ve 37 °C'de kuluçka.</li>
	<li>İstenilen zamanlarda, kuvözden plakayı çıkarın ve buza yerleştirin. Pozitif kontrol kuyusu için %0,5 Triton X-100'ün 40 μL'sini ekleyin.</li>
	<li>Plakaya bağlı tüm PMN'leri tamamen çıkarmak için numuneleri her kuyuda hafifçe inip çıkarın, ardından numuneleri 1 μL propidium iyodür içeren 300 μL buz gibi DPBS içeren buz üzerinde sitometri tüpleri akışına aktarın.</li>
	<li>Akış sitometrisi kullanarak propidium iyodür pozitif PMN'lerin oranını ölçün (Şekil 2A). DNA'ya bağlandığında propidium iyodür 535/617 nm'de uyarma/emisyon ait.</li>
</ol>3. S. aureus sitotoksisite fagositoz sonrası insan polimorfonükleer lökositlere karşı
NOT: 600 nm (OD600)optik yoğunluğu ve bakteri konsantrasyonu ile tanımlanan büyüme eğrileri bu test başlamadan önce test edilecek S. aureus suşları için ampirik olarak belirlenmelidir. Bu deneylerin başarısı, od600 alt kültürbakterileri kullanarak orta üstel büyüme aşamasında test edilen her S. aureus suşunun eşit konsantrasyonlarda tutarlı bir şekilde hasat ını gerektirir.
<ol><li>2.1.1 ve 2.1.2 adımlarında açıklandığı gibi S. aureus suşları ve alt kültür bakterilerinin bir gecede başlayan kültürleri.</li>
	<li>Hasat alt kültürlenmiş S. aureus 1 mL kültürlü bakterilerin 1,5 mL mikrosantrifüj tüp ve 5.000 × g oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj aktarArak orta üstel büyüme ulaşmıştır. NOT: Büyüme koşullarımız altında, USA300 ve USA300ΔsaeR/S yaklaşık 135 dk kuluçka dan sonra orta üstel büyüme aşamasına ulaşmıştır6.</li>
	<li>Supernatant'ı keserek santrifüjden sonra S. aureus'u yıkayın, DPBS'nin 1 mL'sinde peletli bakterileri yeniden sulandırın, numuneyi 30 s'ye girdaplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika 5 dakika için 5.000 × g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Opsonize S. aureus DPBS ile seyreltilmiş % 20 insan serumu 1 mL bakteriyel pelet resuaskıya ve 15 dakika ajitasyon ile 37 °C'de kuluçka.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5.000 x g'de 5 dakika santrifüj opsonize edilmiş bakteriler. Yıkama S. aureus supernatant keserek santrifüj aşağıdaki, 1 mL DPBS peletli bakterileri resumize, sonra bakteri pelet tamamen ayrı artı ek bir 30 saniye kadar örnek girdap. Oda sıcaklığında 5 dakika 5 dakika için 5.000 × g centrifuge bakteri.</li>
	<li>1 mL RPMI opsonize S. aureus suşları resuspend, bakteriyel pelet tamamen parçalanana kadar örnek girdap, ve daha sonra ek bir 30 s. buz üzerinde bakteri yerleştirin.</li>
	<li>Seyreltik opsonize S. aureus buz gibi RPMI ile istenilen konsantrasyona suşları. Girdap 30 s ve buz üzerinde yer.</li>
	<li>Triptik soya agar üzerinde bakterilerin 1:10 seri seyreltme kaplama tarafından opsonize S. aureus konsantrasyonu doğrulayın. NOT: Bu testte kullanılan bakterilerin konsantrasyonundaki farklılıklar sonraki PMN plazma membran geçirgenliği üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğinden(Şekil 3A),test edilen her bir suş konsantrasyonunun her deney için belirlenmesi ve suşlar arasındaki eşdeğer olması çok önemlidir.</li>
	<li>1.14 adımdan itibaren buz üzerindeki 96 kuyuluk plakadaki PMN'lere her S. aureus süzmesinden veya RPMI'den (pozitif ve negatif kontroller için) 100°L/kuyuyu yavaşça ekleyin. Yavaşça kaya plaka kuyularda S. aureus dağıtmak için.</li>
	<li>4 °C15'te8 dk için 500 × g plakayı santrifüj ederek fagositoz senkronize edin. Santrifüjden hemen sonra 37 °C'de kuluçka plakası (T = 0).</li>
	<li>İstenilen zamanlarda, kuvözden plakayı çıkarın ve buza yerleştirin. Pozitif kontrol kuyusu için %0,5 Triton X-100'ün 40 μL'sini ekleyin.</li>
	<li>Plakaya bağlı tüm PMN'leri tamamen çıkarmak için numuneleri her kuyuda hafifçe inip çıkarın, ardından numuneleri 1 μL propidium iyodür ile 200 μL buz gibi DPBS içeren buz üzerinde sitometri tüpleri akmaya aktarın.</li>
	<li>Adım 2.9'da açıklandığı gibi akış sitometrisini kullanarak propidium iyodür boyama örneklerini analiz edin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., H&#246;&#246;k, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+invasion+and+evasion:+The+many+functions+of+the+surface+proteins+of+Staphylococcus+aureus.">Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2014).</li><li>Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+manipulation+of+host+immune+responses.">Staphylococcal manipulation of host immune responses.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).</li><li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+toxins.">Staphylococcus aureus toxins.</a> Current Opinion in Microbiology. , (2014).</li><li>Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epic+Immune+Battles+of+History:+Neutrophils+vs.+Staphylococcus+aureus.">Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).</li><li>Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytes.">Phagocytes.</a> Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).</li><li>Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SaeR+Binds+a+Consensus+Sequence+within+Virulence+Gene+Promoters+to+Advance+USA300+Pathogenesis.">SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li><li>Borgogna, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+Bacterial+Pneumonia+by+Staphylococcus+aureus+Following+Influenza+A+Infection+Is+SaeR/S+Dependent.">Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li><li>Guerra, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+SaeR/S-regulated+factors+reduce+human+neutrophil+reactive+oxygen+species+production.">Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production.</a> Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).</li><li>Zurek, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+innate+immunity+in+promoting+SaeR/S-mediated+virulence+in+Staphylococcus+aureus.">The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus.</a> J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).</li><li>Nygaard, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartic+Acid+Residue+51+of+SaeR+Is+Essential+for+Staphylococcus+aureus+Virulence.">Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3085 (2018).</li><li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocidins:+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors.">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li><li>B&#248;yum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils.">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li><li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SaeR/S+gene+regulatory+system+is+essential+for+innate+immune+evasion+by+Staphylococcus+aureus.">The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, pmn'lerin insan kanından arındırılmasını ve s. aureus'un sitotoksisitesini bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine karşı ölçmek için propidium iyodür kullanan iki ayrı tahlilyi tanımlar. Bu işlemlerin başarısı saflaştırılmış PMN'lerin kalitesine ve bu patojen tarafından üretilen S. aureus ve ekstrasellüler proteinlerin uygun şekilde hazırlanmasına bağlıdır. PMN'lerin izolasyonu için, endotoksin kontaminasyonundan arınmış reaktifler kullanarak, hücre preparatlarını nazikçe tedavi ederek ve hücreleri uygun sıcaklıkta tutarak saflaştırma sırasında ve sonrasında PMN aktivasyonunu en aza indirmek önemlidir. PMN aktivasyonu gösteren işaretler saflaştırma sırasında hücrelerin kümelenmesi ve izole hücrelerin% 5'ten fazla propidium iyodür için pozitif leke içerir. PMN'lerin nispeten kısa ömrü nedeniyle, bu hücreler insan kanından izole edilmeli ve aynı gün içinde test edilmelidir. PMN'ler arınma sonrası 3 saatten fazla buzüzerinde bırakılırsa spontan apoptoz belirtileri göstermeye başlayacaktır. Daha önce de belirtildiği gibi, her PMN preparatının, izole hücrelerin saflığını ve bütünlüğünü sağlamak için ileri ve yan dağılım akış sitometri analizi nin yanı sıra propidium iyodür boyama kullanılarak dikkatle değerlendirilmesi çok önemlidir.
S. aureus tarafından iki bileşenli lökocidinlerin ekspresyonu, bu protokolde açıklanan tahliller kullanılarak gözlenen, tehlikeye atılmış PMN plazma membran bütünlüğünün çoğunluğundan sorumludur. Bu toksinlerin ve fenol-çözünür modüler ler gibi diğer gözenek oluşturan peptidlerin ekspresyonundaki değişim, S. aureus suşları arasında insan PMN'lerine karşı sitotoksisite farklılıkları yaratacaktır. Buna ek olarak, s. aureus'un fagositoz tahlillerinde PMN'lere oranı sonraki PMN plazma membran geçirgenliği üzerinde önemli bir etkiye sahiptir(Şekil 3A) ve bu deneyler, alt kültürlü bakterilerin OD600'ü kullanarak orta üstel büyüme evresinde test edilen her S. aureus suşunun eşit konsantrasyonlarda tutarlı bir şekilde hasat edilmesini gerektirir. Bu hususlar göz önüne alındığında, sitotoksisite tahlilleri başlamadan önce incelenecektir tüm suşları için büyüme eğrileri tanımlamak için çok önemlidir. S. aureus sitotoksisitesini in vitro olarak önemli büyüme farklılıkları gösteren suşlarla analiz etmek için bu yöntemleri önermiyoruz.
USA300 insan PMNs karşı son derece sitotoksik olduğu bilinen öldürücü MRSA izole15 ve bu suş SaeR / S kaybı önemli ölçüde insan PMNs hedef çok sayıda iki bileşenli lökocidinlerin transkripsiyon azaltır6,12, bu suşları açıklanan tahlilleri kullanarak sitotoksisite karşılaştırmak için ideal modeller yapma. Ancak, farklı S. aureus izole leri arasında geniş genetik varyasyon vardır ve bu protokollerde ayrıntılı parametreler diğer S. aureus suşları test ederken insan PMN'lerine karşı sitotoksisite önemli değişikliklere neden olmayabilir. Büyüme koşulları, supernatants hacimleri veya PMN'ler için bakteri oranı terzilik S. aureusdiğer suşları kullanarak bu yöntemlerle başarı için gerekli olabilir.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
to:
Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60681">Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes</a>. The title was&#160;updated.

Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Staphylococcus aureus insanlarda hastalıkların geniş bir yelpazede neden gram-pozitif bir bakteridir. Bu belirgin patojen enfeksiyonun farklı yönlerine katkıda bulunan çok sayıda virülans faktörleri üretir. Bunlar s. aureus ana doku farklı türde uymak için izin yüzey molekülleri içerir1, konak bağışıklık yanıtı ile müdahale ekstrasellüler proteinler2, ve ana bilgisayar hücrelerinin farklı türde hedef gizli toksinler bir dizi3. Bu raporda, s. aureus tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin insan polimorfonükleer lökositlere (PMN'ler veya nötrofiller) karşı ürettiği sitotoksiteyi ölçen bir yöntem tanımlanmıştır.
PMN'ler memelilerde en bol lökosittir. Bu dolaşan bağışıklık hücreleri hızla yerleşik hücreler veya istilacı mikroplara özgü bileşikler tarafından üretilen tehlike sinyalleri yanıt olarak konak doku hakaret sitesine işe alınır. Bu moleküllerden ve ekstravazasyon sırasında aktif yerleşik konak hücreleri ile doğrudan temaslardan ekstrasellüler girişi priming olarak bilinen bir süreç PMN'lerin aktivasyon durumunu artırmak4,5. Sıkıntılı doku ya da enfeksiyon oluşmasını önlemek için tasarlanmış önemli doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını uygulayan astarlı PMN'ler. Bu bağlama ve içselleştirme, ya da fagositoksis, güçlü antimikrobiyal bileşiklerin bir pil tarafından mikrop imha cumulating hücre içi olayların bir çağlayan tetikleyen işgal mikroorganizmalarıniçerir 5.
PMN'ler insanları istilacı patojenlerden koruyan önemli bir rol oynar lar ve özellikle S. aureus enfeksiyonunu önlemek için önemlidir4. Ancak, bu bakteri farklı PMN fonksiyonlarını engelleyen çok çeşitli virülans genleri üretir. Bunlar arasında sinyal moleküllerinin tanınmasını engelleyen, dokubarındırmaya yapışmayı önleyen, antimikrobiyal bileşiklerin üretimini engelleyen ve plazma zarı bütünlüğünü bozan hücre dışı proteinlerbulunmaktadır 4. S. aureus, bu virülans genlerinin zamansal ekspresyonunu, belirli çevresel ipuçlarını tanıyan birden fazla iki bileşenli duyu sisteminden gelen kolektif girdi yoluyla yönetir. SaeR / S iki bileşenli sistem enfeksiyonsırasında S. aureus virülans gen transkripsiyon önemli bir up-regülatör 6,7,8,9,10,11. Özellikle, bu iki bileşenli sistem özellikle insan PMNs12hedef iki bileşenli lökocidins üretimi için kritik olduğu gösterilmiştir.
Bu protokol üç farklı bölüme ayrılmıştır. Birinci bölümde Bøyum13 ve Nauseef14tarafından belirlenen yöntemlerden uyarlanmış bir protokol kullanılarak yoğunluk gradyan santrifüj kullanarak INSAN kanından PMNarsaflaştırma açıklar. İkinci ve üçüncü bölümlerde S. aureus sitotoksisitesini incelemek için iki farklı teknik detay; biri S. aureus tarafından üretilen ekstrasellüler proteinler ile PMN'leri zehirlerken, diğeri fagositoz dan sonra yaşayan bakterilerin PMN'lere zarar verme yeteneğini inceler. Bu işlemler, S. aureus gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu PMN plazma membran bütünlüğünün kaybını ölçmek için propidium iyodür kullanır. Propidium iyodür normalde hücre zarı geçirimsiz ama S. aureus toksinler tarafından bozulmuş plazma membranları çapraz olabilir DNA bağlayıcı florofor. Akış sitometri analizi propidium iyodür-pozitif PMN'lerin hızlı nicelemesi S. aureus suşlarının göreceli sitotoksisitesini ölçmek için izin verir. Metisiline dirençli S. aureus (MRSA) darbeli alan jel elektroforezi tip USA300 ve bu suşta saeR/S izojenik deletion mutantı (USA300ΔsaeR/S)olarak tanımlanan bu işlemlerin S. aureus'un insan PMN'lerine karşı sitotoksisitesini nasıl ölçebileceğini göstermek için model olarak kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2B1323Q</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-044</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8% Sodium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5150</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x75mm Culture tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-430</td>
			<td>Used as flow cytometry tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/w) Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8802</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3125 Hand Tally Counter</td>
			<td>Traceable Products</td>
			<td>3125CC</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-656</td>
			<td>For dispensing media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>211823</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>BD 309657</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>Cell counting apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x (Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M0687</td>
			<td>Plate for holding experimental samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Syringe Filters</td>
			<td>Omicron Scientific</td>
			<td>SFPV13R</td>
			<td>For filtering supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td>Membrane impermeable DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-34503-24</td>
			<td>For growing cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red</td>
			<td>Corning</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td>Used in resuspending cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Water for Irrigation, USP</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7113</td>
			<td>PMN purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pipette Pump</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F37898</td>
			<td>For aspirating liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>Membrane integrity positive control</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the cytotoxicity of staphylococcus aureus against human polymorphonuclear leukocytes

Staphylococcus aureus, polimorfonükleer lökositlerin (PMN'ler veya nötrofiller) membran bütünlüğünü hedef alan ve bozan çok çeşitli lökocidins salgılayabilme yeteneğine sahiptir. Bu protokol, hem insan PMN'lerinin saflaştırılmasını hem de S. aureus sitotoksisitesinin PMN'lere karşı üç farklı bölümde ölçülmesini açıklar. Bölüm 1, yoğunluk santrifüjü kullanılarak PMN'lerin ve serumun insan kanından izolasyonunu ayrıntılarıyla anlatır. Bölüm 2, S. aureus tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisitesini bu saflaştırılmış insan PMN'lerine karşı test eder. Bölüm 3 canlı S. aureus'unfagositotunu takiben insan PMN'lerine karşı sitotoksisiteyi ölçer. Bu işlemler, hücre zarı geçirimsiz bir DNA bağlayıcı florofi olan propidium iyodür ile tedavi edilen PMN'lerin akış sitometri analizini kullanarak S. aureus lökosilikinler tarafından PMN plazma membran bütünlüğünün bozulmasını ölçer. Topluca, bu yöntemler hızla birincil insan PMN'ler karşı S. aureus sitotoksisite test avantajı var ve kolayca konak-patojen etkileşimleri diğer yönlerini incelemek için adapte edilebilir.

Yukarıda açıklanan prosedürlerin MRSA PFGE tipi USA300 kullanarak insan PMN'lerine karşı S. aureus'un sitotoksisitesini nispeten ölçmek için nasıl kullanılabileceğini ve bu türdeki saeR/S'nin izojenik deletion mutantı (USA300ΔsaeR/S)önceki çalışmalarda nasıl kullanıldığını gösterdik6. Bu protokolün 1. Saflaştırılmış PMN'lerin monosit veya lenfositlerle(Şekil 1A,B)kontaminasyonunu göstermek için ileri ve yan dağılım çizimleri kullanıldı ve PMN bütünlüğü propidium iyodür boyama(Şekil 1C)kullanılarak belirlendi. İnsan PMN arınma açıklanan yöntem sürekli 0,5 x 107 için 1 x 108 PMNs >98% saf ve >95% propidium iyodür negatif verim olabilir.
USA300 ve USA300ΔsaeR/S tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisitesi, bu protokolün 2. Bu deneyler, USA300 tarafından üretilen ekstrasellüler proteinler ile 30 dk zehirlenmesinden sonra saflaştırılmış PMN'lerin propidium iyodür boyamasında konsantrasyona bağlı bir artış göstermektedir(Şekil 2B). Önceki çalışmalar saer / S iki bileşenli sistem insan PMNs6,10,11,16hedef çok sayıda iki bileşenli lökocidins ifade için önemli olduğunu göstermiştir . Bu önceki bulgularla uyumlu olarak, USA300ΔsaeR/S (Şekil 2B)tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlere maruz kaldıktan sonra çok az propidium iyodür-pozitif PMN saptandı. Diğer deneyler, yaklaşık 30 dakika(Şekil 2C)sonra platolanan USA300 hücre dışı proteinlerin zehirlenmesini takiben lysed PMN'lerin oranında sürekli bir artış olduğunu göstermiştir. USA300ΔsaeR/Starafından üretilen ekstrasellüler proteinlere maruz kaldıktan sonra tüm zaman dilimlerinde insan PMN'lerinin minimal lysis'i belirtilmiştir. Bu sonuçlar, insan PMN'lerine karşı hücre dışı S. aureus proteinleri tarafından sitotoksisitenin göreceli niceliği için bu tahkizin yararını göstermektedir.
Bu protokolün 3. bölümünde açıklanan fagosittoz sonrası insan PMN'lerine karşı S. aureus sitotoksisite testini kullanarak USA300 ve USA300Δsaer/S test ettik(Şekil 3). USA300 fagositozundan sonra propidium iyodür pozitif PMN oranında konsantrasyona bağlı artış 90 dakika sonra gözlendi (Şekil 3A). USA300ΔsaeR/S (Şekil 3A)fagositozunun ardından propidium iyodür pozitif olan PMN'lerin oranında önemli bir azalma gözlenmiştir ve SaeR/S iki bileşenli sistemin insan PMN'lerine karşı S. aureus sitotoksisitesi için önemli olduğunu gösteren diğer sonuçları destekleyen(Şekil 2)7,11. Daha önce de belirtildiği gibi şekil 3A'dagösterildiği gibi, S. aureus konsantrasyonundaki farklılıklar fagositöz sonrası PMN lysis üzerinde belirgin bir etkiye sahiptir. Bu deneylerin her birinde kullanılan USA300 ve USA300ΔsaeR/S inoculum'un numaralandırması, bu suşlar arasındaki sitotoksisite kontrastının kullanılan bakterilerin konsantrasyonundaki farklılıklardan kaynaklanmadığını göstermiştir(Şekil 3B). Bu bulgular, fagositotis sonrası insan PMN'lerine karşı S. aureus sitotoksisite tözünün insan PMN plazma membran bütünlüğünü tehlikeye atma yeteneğini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> Şekil 1: Saflaştırılmış PMN'lerin akış sitometri analizi. (A) saflaştırılmış insan PMN'leri ve (B) PERiferik kan mononükleer hücreleri ile kasıtlı olarak kontamine olmuş PMN'lerin temsili akış sitometri nokta plotları. (C) Minimal propidium iyodür boyama gösteren temsili akış sitometri histogramı (<%1) %0,05 Triton X-100 (gölgeli kırmızı) ile tedavi edilen PMN'lere kıyasla saflaştırılmış PMN'lerin (gölgeli gri). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> Şekil 2: S. aureustarafından üretilen hücre dışı proteinler ile sarhoş PMN'lerin akış sitometri analizi. (A) Media control (gölgeli mavi) ile kuluçka 30 dakika sonra propidium iyodür ile boyanmış PMN'lerin temsili akış sitometri histogramı, 1:110 (gölgeli gri) veya% 0.05 Triton X-100 (gölgeli kırmızı) son konsantrasyonda USA300 supernatant filtreli. (B) 30 dk'lık kuluçkadan sonra, farklı konsantrasyonlarda USA300 veya USA300,saeR/S supernatants ile propidium iyodür pozitif PMN'lerin oranı. (C) Propidium iyodür pozitif PMN'lerin usa300 veya USA300 ile inkübasyonu takiben zaman içinde 1:110'luk son konsantrasyondasaeR/S supernatant oranı. Veriler, iki kuyruklu t-testi ile belirlenen * p ≤ 0.05 ve ** p ≤ 0.005 ile en az 3 ayrı deneyin ortalama ± SEM olarak sunulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> Şekil 3: S. aureusfagositosisi sonrası PMN'lerin akış sitometri analizi. (A) Propidium iyodür pozitif PMN'lerin farklı konsantrasyonlarda ABD300 veya USA300,saeR/S. (B) Panel A.'da gösterilen deneylerde kullanılan opsonize S. aureus suşlarının konsantrasyonu , iki kuyruklu test ile belirlenen 4 ayrı deneyin ortalama ± SEM±si olarak sunulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes at JoVE.com

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Bu protokol, polimorfonükleer lökositlerin tüm insan kanından arındırılması için bir yöntem ve staphylococcus aureus'un sitotoksisitesini bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine karşı ölçen iki ayrı tahlilaçıklamaktadır.

İnsan Polimorfonükleer Lökositlere Karşı Staphyloccus aureus Sitortoksitesinin Ölçülmesi

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

Staphylococcus aureus patogenezi teşvik virülans faktörleri geniş bir yelpazede üreten bir gram-pozitif bakteridir. Bunlar arasında pmn veya nötrofil olarak da adlandırılan polimorfonükleer lökositlerin membran bütünlüğünü bozan iki bileşenli lökotoksinler yer almaktadır. Bu video, pmn'lerin insan tam kanından izolasyonunu ve bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine karşı S.aureus sitotoksisitesini ölçmek için iki ayrı tahlili göstermektedir.Bu tahliller tüm standart laboratuvar ekipmanları ile gerçekleştirilebilir ve kolayca konak patojen etkileşimin diğer yönlerini incelemek için uyarlanabilir. Bu deneyler insan bağışçılarından alınan tam kanı kullanacak ve ilgili kurumsal komite nin veya inceleme kurulunun onayını ve tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onay alındığına dair bir beyan da gerekecektir. Bu işlemin ilk adımı, nötrofillerin santrifüj ve yoğunluk gradyanları ile izole edilmesidir.İlk olarak, oda sıcaklığına %3 dekstran %0,9 sodyum klorür, %0,9 sodyum klorür 35 mililitre, %1,8 sodyum klorür 20 mililitre, mililitre ficoll çözeltisi başına 1,077 gram 12 mililitre ve 20 mililitre su getirin. 25 mililitre taze çekilmiş heparinize edilmiş tüm insan kanını iki konik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 25 mililitre eşdeğer hacim, 3% dextran, bire bir oranında% 0.9 sodyum klorür ile taze çizilmiş heparinized tam kan 25 mililitre birleştirin.Her 50 mililitrelik konik tüpü hafifçe sallayarak karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Oda sıcaklığında kuluçkadan sonra iki ayrı katman görünür. Yeni 50 mililitre konik tüpler içine her dextran kan karışımı üst tabakası aktarın.Düşük veya hiç mola vermeden oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 g santrifüj. Dikkatlice hem supernatants aspire ve hücre pelet rahatsız etmeden atın. Yavaşça% 0.9 sodyum klorür iki mililitre her hücre pelet askıya.Tek bir resuspended pelet birleştirin, 50 mililitre konik sonra kalan 0.9% sodyum klorür 35 mililitre son hacmiekleyin. Dikkatle bir el pipet kullanarak hücre süspansiyon altında mililitre ficoll çözeltisi başına 1.077 gram 10 mililitre underlay. 450 g'de oda sıcaklığında 30 dakika döndükten sonra, düşük veya hiç mola vermeden, daha önce gösterildiği gibi hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı hafifçe aspire edin.Oda sıcaklığında su 20 mililitre hücre pelet resuspend tarafından kırmızı kan hücreleri lyse. 30 saniye boyunca sallayarak hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 g'da %1,8 sodyum klorür ve santrifüj numunesi ile 20 mililitre ekleyin.Daha önce gösterildiği gibi dikkatle supernatant aspire. Yavaşça iki mililitre oda sıcaklığında RPMI hücre pelet askıya ve buz üzerinde yer. Hemacytometer kullanarak hücreleri say.Saflaştırılmış PMN'leri, buz gibi RPMI ile mililitre başına 10 ila 7. 100 mikrolitre saflaştırılmış PMN'yi 300 mikrolitre DPBS ile birleştirin, iki çoğaltma akış sitometri tüpünde bir mikrolitre propidium iyodür lekesi içeren. Pozitif kontrol için, akış sitometri tüplerinden birine %0,5 Triton X-100 çözeltisi 40 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın.İzole PMN'lerin saflığını ve bütünlüğünü belirlemek için ileri saçılma, yan dağılım ve propidium iyodür boyamasını ölçmek için akış sitometrisini kullanın. Sadece %98 saf ve %95 propidium iyodür negatif üzerinde PMN preparatları kullanılmalıdır. Normal insan serumunun izolasyonuna dikkat eden protokol için, tam el yazmasına bakın.Bu tahlilde kullanılacak bireysel kuyulara DPBS ile seyreltilmiş %20 izole edilmiş insan serumunun 100 mikrolitresini ekleyerek PMN sitotoksisite tahlilleri için 96 kuyuluk bir plaka hazırlayın. Sadece medya alacak en az bir negatif kontrol kuyusu ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat plaka% 0.05 Triton X.Incubate alacak en az bir pozitif kontrol kuyusu içerdiğinden emin olun. Kuluçkadan sonra, kodlanmış kuyuları 100 mikrolitre buz gibi DPBS ile iki kez yıkayın ve plakayı buza yerleştirin.Plaka kuyularından kalan DPBS'yi çıkarın ve iyi kodlanmış her birine mililitre başına 10 defa 10'uncu saflaştırılmış insan PMN'si 100 mikrolitre ekleyin. Kaplama nötrofiller aşağıdaki sitotoksisite tahlilleri kullanmadan önce en az beş dakika buz üzerinde bırakarak yerleşmek için izin verin. Bu bölümde, stafilokok aureus tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisitesini insan PMN'lerine karşı ölçen bir analiz açıklanmaktadır.Kültür S.aureus bir gecede uygun ortamda bir sallayarak inkübatör kullanarak 37 santigrat derece önceki gün deneyin ayarlayın. Subculture S.aureus taze medya ile bir gecede bakteri kültürleri bir ila 100 seyreltme gerçekleştirerek. Bakteriler erken sabit büyüme aşamasına ulaşana kadar sallayarak 37 santigrat derecede kuluçka.Büyüme beş saat sonra, oda sıcaklığında beş dakika için 5, 000 g bir 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp ve santrifüj içine altkültür S.aureus bir mililitre aktarın. Santrifüjden sonra, aspire süpernatantları. 0,22 mikron şırınga filtresiile yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp ve buz üzerinde yer aspire supernatants geçirin.Kültür Staph aureus için kullanılan buz gibi medya ile supernatants seri seyreltme gerçekleştirin. Daha önce açıklandığı gibi, buz üzerinde PMN'ler içeren 96 kuyuluk bir plakanın bireysel kuyularına negatif ve pozitif kontroller için ödünç verilen süpernatant numuneleri veya ortamları nazikçe ekleyin. Yavaşça kaya plaka sıyrıklarda supernatants dağıtmak ve 37 santigrat derece kuluçka.İstenilen zamanlarda, kuvözden plakayı çıkarın ve buza yerleştirin. Her akış sitometri tüpüne bir mikrolitre propidium iyodür içeren 300 mikrolitre buz gibi DPBS ekleyin. Örnekleri buz üzerinde akan sitometri tüplerine aktarın.Pozitif kontrol kuyusu için, bir akış sitometri tüpüne aktarmadan önce numuneye 20 mikrolitre %10 Triton X ekleyin. Akış sitometrisi kullanarak sarhoş PMN'lerin propidium iyodür boyama analiz edin. Bu bölümde, insan PMN'leri ile fagositöz sonrası S.aureus'un sitotoksisitesini ölçen bir analiz açıklanmaktadır.600 nanometreoptik yoğunluğu ve bakteri konsantrasyonu tarafından tanımlanan büyüme eğrileri bu töz kullanmadan önce ilgili Staph aureus suşları için belirlenmelidir. Daha önce açıklandığı gibi, S.aureus suşları ve alt kültür bakterilerin in gece kültürleri başlayın. Bir kez altkültür Staph aureus orta üstel büyüme ulaştı, 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp ve santrifüj 5, 000 g oda sıcaklığında beş dakika için kültür bakterilerin bir mililitre transfer.S.aureus'u peleti bozmadan süpernatantını azarlayarak yıkayın ve bir mililitre DPBS'de peletli bakterileri yeniden askıya alın. 30 saniye boyunca örnekleri girdap. Örnekleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 5,000 g'da santrifüj edin.Staph aureus'u oksetmek için önce %20 insan serumunun bir mililitresinde bakteri peletini yeniden askıya alın. Sonra 37 derecede nisfora 15 dakika boyunca ajitasyon la örnekleri kuluçkaya yatırın. Daha önce gösterildiği gibi santrifüj aşağıdaki yıkama öküzlü Staph aureus.Seyreltik öküzleşmiş Staph aureus suşları bir kez 10 için 8 koloni oluşturan birimleri, Mililitre başına CPU, buz gibi RPMI ile. 30 saniye boyunca örnek girdap ve buz üzerinde yerleştirin. Agar üzerinde bakterilerin 1 ila 10 seri seyreltme kaplama tarafından bu tahliller için kullanılan Staph aureus konsantrasyonlarını onaylayın.1.14 adımdan itibaren buz üzerindeki 96 kuyuluk plakadaki PMN'lere her Staph aureus suşunun veya pozitif ve negatif kontroller için RPMI'nin kuyubaşına 100 mikrolitre ekleyin. Yavaşça kaya plaka kuyularda Staph aureus dağıtmak için. Fagositoz'u 500 g'da santrifüj plakaile dört santigrat derecede sekiz dakika, 37 santigrat derecede ise inkübasyon plakası ile senkronize edin.İstenilen zaman noktalarında, plakayı buza koyun ve her akış sitometri tüpüne bir mikrolitre propidium iyodür içeren 200 mikrolitre buz gibi dpbs ekleyin ve numuneleri ilgili tüplerine aktarın. 2.8 ve 2.9'da açıklandığı gibi akış sitometrisi kullanarak propidium iyodür boyama örneklerini analiz edin. Staph aureus tarafından insan PMN'lerini hedef alan iki bileşenli lökotoksinlerin transkripsiyonu, insan PMN'lerine karşı Staph aureus sitotoksisitesini ölçmek için tanımlanan tahlillerin yararını göstermek için SA veya S2 bileşen sistemini gerektirir.Bu deneyler, bu türdeki SA veya S'nin isolojenik deletion mutantında USA300 olarak tanımlanan klinik olarak alakalı Staph aureus izole edilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Sol panel saflaştırılmış PMN'leri, sağ panel ise kasıtlı olarak kirlenmiş örnekleri örnek olarak gösterecektir. Bu protokolün birinci bölümünde açıklanan yordamlar kullanılarak izole edilen PMN'ler propidium iyodür ile boyanmış ve akış sitometrisi kullanılarak incelenmiştir.1A ve 1B. PMN bütünlüğü propidium iyodür boyama kullanılarak belirlendi. İnsan PMN arınma açıklanan yöntemi ni kullanarak, biz sürekli üzerinde% 98 saf ve% 95 propidium iyodür negatif 8 PMNs için 7-bir kez 10 beş kez 10 izole edebilirsiniz.USA300 ve AsaeR/S mutant tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlerin sitotoksisitesi saflaştırılmış PMN'lere karşı test edildi. Bu deneyler, ABD300 tarafından üretilen ekstrasellüler proteinler ile 30 dakikalık zehirlenme sonrasında saflaştırılmış PMN'lerin propidium iyodür boyamasında konsantrasyona bağlı bir artış olduğunu göstermektedir, ancak AsaeR/S mutantı ile değil. Daha sonraki deneyler, yaklaşık 30 dakika sonra platolanan ABD300 hücre dışı proteinlerin zehirlenmesinden sonra propidium iyodür pozitif PMN'lerin oranında sürekli bir artış olduğunu göstermiştir.AsaeR/S mutant ı tarafından üretilen ekstrasellüler proteinlere maruz kaldıktan sonra insan PMN'lerinin minimal propidium iyodür boyaması her zaman dikkat çekti. Son olarak, senkronize fagositoz sonrası PMN'lere karşı USA300 ve AsaeR/S mutantının sitotoksisitesi test edilmiş, USA300 fagositozundan 90 dakika sonra propidium iyodür pozitif PMN'lerin oranında konsantrasyona bağlı bir artış gözlenmiştir. AsaeR/S mutantının fagositozundan sonra önemli ölçüde daha az PMN propidium iyodür pozitifti.Bu deneylerin her birinde ABD300 ve AsaeR/S mutant inoculum'un numaralandırması, bu suşlar arasındaki sitotoksisite kontrastının kullanılan bakterilerin konsantrasyonundaki farklılıklardan kaynaklanmadığını göstermiştir. Bu protokol, s.aureus'un sitotoksisitesini bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerine karşı ölçmek için iki farklı teknikle PMN'lerin insan kanından arınmalarını tanımlar. Bu prosedürlerin başarısı safpmns kalitesi ve Staph aureus bakteri veya supernatants uygun hazırlanmasına bağlı olacaktır.Bu işlemleri gerçekleştirirken dikkat etmesi gereken önemli noktalar için lütfen yazının tamamına başvurun. USA300 öldürücü mrsa izole ve AsaeR / S kaybı önemli ölçüde insan PMNs hedef virülans faktörlerin transkripsiyon azaltır, bu suşları açıklanan tahliller kullanarak sitotoksisite karşılaştırmak için ideal modeller yapma. Staph aureus diğer suşları kullanırken büyüme koşulları, supernatants hacimleri veya PMN'ler için bakteri oranı terzilik gerekli olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Damla Akış ve Döner Disk Reaktörler kullanın Staphylococcus aureus Biyofilm Analizi

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Subkutan Enfeksiyon Metisiline Dirençli Stafilokok Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Metisiline Dirençli Deneysel Endokardit Modeli<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) Sıçan

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Demir Kaynağı Olarak İnsan Hemoglobin kullanarak Staphylococcus aureus Büyüme

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Metisiline diren

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Biyofilm İlişkili Hedefleme<em&gt; Staphylococcus aureus</emKullanma&gt; Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

bir Genotiplendirme<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Tarafından Ribozomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...