Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (K01DK114390)، وهي منحة باحث باحث من جمعية السرطان الأمريكية (RSG-050-01-NEC)، وهي منحة مشروع تجريبي بحثي من جامعة نيو مكسيكو برنامج الصحة البيئية التوقيع و Superfund (P42 ES025589)، وجائزة مشروع المشاريع التجريبية للموارد المشتركة وجائزة المشروع التجريبي لدعم برنامج البحوث من مركز السرطان الشامل لجمهورية الأمم المتحدة وMM (P30CA118100) ، وجائزة محقق جديد من صناديق البحوث الصحية المخصصة في كلية الطب بجامعة نيو مكسيكو.

1. بذر الخلية
<ol><li>البذور 2 × 105 HCT116 خلايا سرطان القولون والمستقيم في بئر في لوحة 24-well والحفاظ على الخلايا في المتوسط النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>استبدال الوسط الثقافة مع أو بدون كبريتات حديدية 100 ميكرومتر (FS) أو 10 μm دوكسوروبيسين (DOX) التي تحتوي على المتوس...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

البروتوكول التجريبي الموصوف هنا هو استنساخ بسهولة لقياس مجموع الوردي الخلوية. وتشمل الخطوات الهامة جعل DCFH-DA حل جديدة وتجنب التعرض للضوء، والتقليل من اضطراب حالة الخلية وغسل برنامج تلفزيوني واسعة النطاق الحق قبل التقاط الصور. لإعداد حل العمل DCFH-DA، ينبغي إضافة حل الأسهم إلى DMEM مسبقة الدفء ?...

ثلاثة أنواع الأكسجين التفاعلي الرئيسية (ROS) التي تنتجها الأيض الخلوية التي هي ذات معنى فسيولوجي هي أنيون أكسيد فائق، هيدروكسيل الراديكالية، و بيروكسيد الهيدروجين1. في تركيزات منخفضة، فإنها تشارك في عمليات الخلايا الفسيولوجية، ولكن في تركيزات عالية لديهم آثار سلبية على مسارات إشارة الخلية1. وقد طور الجسم أنظمة مضادة للأكسدة، والتي هي فعالة ضد الإفراط في ROS. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث الإجهاد التأسدي عندما تطغى ROS على قدرة الجسم على إزالة السموم ، مما يساهم في العديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك الالتهاب والسرطان والأمراض العصبيةالتنكسية 2،3،4. والغرض من هذه الطريقة هو تحديد مجموع الوردي الخلوي في الخلايا المتصونة باستخدام 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين diacetate (DCFH-DA) تلطيخ. والأساس المنطقي هو أن أكسدة DCFH-DA إلى 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) قد استخدمت على نطاق واسع للكشف عن مجموع ROS بما في ذلك الجذور الهيدروكسيل (•OH) وثاني أكسيد النيتروجين (• NO2). ميكانيكيا, يتم تناول DCFH-DA من قبل الخلايا حيث شقوق esterase الخلوية قبالة مجموعات أسيتيل, مما أدى إلى DCFH. أكسدة DCFH من قبل ROS يحول الجزيء إلى DCF، الذي ينبعث الفلوروس الأخضر في الطول الموجي الإثارة من 485 نانومتر و طول موجة الانبعاثات من 530 نانومتر. بالمقارنة مع الكشف عن الفلوريسين مع تدفق الأساليب البديلة وغيرها من الطرق البديلة5، مزايا هذا الأسلوب باستخدام المجهر الفلوريس وقارئ لوحة هي أنه ينتج صورا الفلورسنت مرئية بوضوح ، وسهلة الأداء وفعالة وفعالة من حيث التكلفة. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف عن الوردي الخلوي لدراسة مختلف الشروط6,7,8. يستخدم هذا البروتوكول للكشف عن إجمالي ROS في الخلايا المُتصّنة. قد تحتاج هذه الطريقة للكشف عن ROS في الخلايا المعلقة بعض التعديلات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

الإجهاد التأاكسدي هو حدث مهم في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. في هذه الدراسة، ونحن نبين كيفية قياس الإجهاد التأكسي من خلال قياس مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) باستخدام 2'،7'-dichlorodihydrofluscein diacetcein (DCFH-DA) تلطيخ في خطوط الخلايا السرطانية القولونية كمثال. يصف هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية بما في ذلك إعداد حل DCFH-DA، واحتضان الخلايا مع حل DCFH-DA، وقياس الكثافة الطبيعية. DCFH-DA تلطيخ هو وسيلة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن ROS في الخلايا. ويمكن استخدامه لقياس جيل ROS بعد العلاج الكيميائي أو التعديلات الجينية. ولذلك، فمن المفيد لتحديد الأكسدة الخلوية على الإجهاد البيئة، وتوفير أدلة على الدراسات الميكانيكية.

تم علاج خلايا سرطان القولون والمستقيم HCT116 مع 100 μM FS أو 10 μM DOX للحث على الإجهاد التأكسي7. كما هو مبين في الشكل 1، تم زيادة الفلوريسين الخضراء بشكل كبير من قبل كل من FS و DOX كما هو متوقع. لتحديد حجم التغير النسبي في الكثافة، تم lysed الخلايا بعد التقاط الصور وتطبيعها مع ?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوي (ROS) باستخدام 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين diacetate (DCFH-DA). يمكن لهذه الطريقة تصور تعريب ROS الخلوي في الخلايا المُلزِمة مع مجهر الفلوريسنس وقياس شدة ROS مع قارئ لوحة الفلوريسين. وهذا البروتوكول بسيط وفعال وفعال من حيث التكلفة.

الكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي في الخلايا المنضمة من قبل 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين Diacetate تلطيخ

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوية في الخلايا المتمسكة مع المجهر المفلور فقط، وقياس كثافة أنواع الأكسجين التفاعلية مع قارئ لوحة الفلوريسين. هذا البروتوكول بسيط وفعال وفعال من حيث التكلفة. ابدأ بذر مرتين 10 إلى الخلايا السرطانية القولونية HCT116 الخامسة في DMEM في كل بئر من 24 بئرًا.احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استبدل الوسيطة الثقافية بـ 100 كبريتات حديدية صغيرةمولار، أو 10 وسيط يحتوي على دوكسوروبيسين ميكرومولار، واحتضان الطبق لمدة 24 ساعة أخرى. إعداد حل DCFH-DA عن طريق حل 4.85 ملليغرام من DCFH-DA في ملليلتر واحد من DMSO لجعل حل مخزون 10 ملليمولار.الحق قبل إضافته إلى الآبار، وتمييع الأسهم مع DMEM قبل الدافئة لجعل حل العمل 10 micromolar، ودوامة لمدة 10 ثوان. لطخة الخلايا، وإزالة المتوسطة التي تحتوي على المخدرات، وغسلها مرة واحدة مع DMEM. إضافة 500 ميكرولترات من DCFH-DA حل العمل في كل بئر، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.بعد الحضانة، وإزالة DCFH-DA من الآبار، وغسلها مرتين مع DMEM، ومرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. ثم ، إضافة 500 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر. استخدام قناة البروتين الفلورسنت الخضراء على المجهر الفلوريسنس لالتقاط صور تمثيلية للخلايا.ثم إزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة فحص المناعة المشعة إلى كل بئر. احتضان لوحة على الجليد لمدة خمس دقائق، وجمع lysates الخلية في أنابيب 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الأنابيب في 21، 130 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.ثم نقل 100 ميكرولترات من السوبر إلى لوحة سوداء 96 جيدا. استخدم قارئ الصهرات الصغيرة في الطول الموجي للإثارة من 485 نانومتر، وطول موجة من الانبعاثات من 530 نانومتر، لقياس الفلوروس في كل بئر. المقبل، وقياس تركيز البروتين مع مقايسة برادفورد عن طريق نقل ميكرولتر واحد من السوبر إلى لوحة واضحة 96 جيدا مع 100 ميكرولترات من محلول تحليل البروتين.استخدام تركيزات البروتين لتطبيع شدة الفلوريسنس. تم علاج خلايا سرطان القولون والمستقيم HCT116 مع 100 كبريتات حديدية ميكرومولار، أو 10 دوكسوروبيسين ميكرومولار، للحث على الإجهاد التأكسي. كما هو متوقع، تم زيادة الفلورس الأخضر بشكل كبير من قبل كلا العلاجين.لتحديد التغيرات الكثافة النسبية، تم lysed الخلايا وتطبيعها مع تركيزات البروتين. وقد زادت شدة الفلورسينس النسبية زيادة كبيرة بسبب كبريتات الحديد أو دوكسوروبايسين. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تجعل DCFH-DA حل جديدة وتجنب التعرض للضوء، وكذلك للحد من اضطراب حالة الخلية، وأداء برنامج تلفزيوني واسعة غسل الحق قبل التقاط الصورة.بالإضافة إلى الكشف عن إجمالي ROS بواسطة هذا البروتوكول، يمكن إجراء ROS على وجه التحديد مثل بيروكسيد.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

الحمض النووي تلطيخ الأسلوب استناداً إلى هطول الأمطار Formazan الناجمة عن التعرض للضوء الأزرق

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

الأسلوب الكمي والنوعي سفينجوميلين من LC-MS استخدام اثنين مستقرة نظير المسمى الأنواع سفينجوميلين

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...