Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (K01DK114390), et forskningsforskerlegattilskud fra American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), et pilotprojekt Tilskud fra University of New Mexico Environmental Health Signature Program og Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award og et forskningsprogram Support Pilot Project Award fra UNM omfattende kræft center (P30CA118100) , og en ny investigator pris fra Dedicated Health Research Fonde ved University of New Mexico School of Medicine.

1. Cellesåning
<ol><li>Seed 2 x 105 HCT116 kolorektal cancerceller pr godt i en 24-brønd plade og vedligeholde cellerne i Dulbecco modificerede Eagle medium (DMEM) natten ved 37 °C.</li>
	<li>Dyrkningsmediet udskiftes med eller uden 100 μM jernsulfat (FS) eller 10 μM doxorubicin (DOX), der indeholder medium og inkubat i 24 timer.</li>
</ol>2. Forberedelse af DCFH-DA-løsningen
<ol><li>4,85 mg DCFH-DA opløses i 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO) for at fremstille en 10 mM stamopløsn...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

Den eksperimentelle protokol, der er beskrevet her, er let reproducerbar at måle cellulære samlede ROS. De kritiske trin omfatter at gøre DCFH-DA-løsningen frisk og undgå lyseksponering, minimere forstyrrelser i cellestatus og omfattende PBS-vask lige før du tager billeder. Til fremstilling af DCFH-DA arbejdsløsning skal stamopløsningen tilsættes til forvarmet DMEM lige før tilsætning i 24 brøndpladen. Årsagen er, at gamle løsninger, der genererer høj baggrund fluorescens eller lyseksponering vil føre til...

Tre store reaktive ilt arter (ROS) produceret af cellulære stofskifte, der er af fysiologisk betydning er superoxid anion, hydroxyl radikal, og hydrogenperoxid1. Ved lave koncentrationer deltager de i fysiologiske celleprocesser, men ved høje koncentrationer har de negative virkninger på cellesignalveje1. Vores krop har udviklet antioxidantsystemer, som er effektive mod overdreven ROS. Men, oxidativ stress kan forekomme, når ROS overvælde afgiftende evne i vores krop, som bidrager til mange patologiske tilstande, herunder betændelse, kræft, og neurodegenerative sygdom2,3,4. Formålet med denne metode er at bestemme total cellulær ROS i klæbende celler ved hjælp af 2',7'-dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) farvning. Begrundelsen er, at oxidation af DCFH-DA til 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) er blevet anvendt i udstrakt grad til total ROS-detektion, herunder hydroxylradikals (•OH) og nitrogendioxid (•NO2). Mekanistisk, DCFH-DA er taget op af celler, hvor cellulære esterase kløver off acetyl grupper, hvilket resulterer i DCFH. Oxidation af DCFH ved ROS konverterer molekylet til DCF, som udsender grøn fluorescens ved en excitation bølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 530 nm. Sammenlignet med påvisning af fluorescens med flowcytometri og andre alternative metoder5er fordelene ved denne metode ved hjælp af et fluorescensmikroskop og en pladelæser, at den producerer klart synlige fluorescerende billeder og er let at udføre, effektiv og omkostningseffektiv. Denne metode er blevet anvendt i vid udstrækning til at opdage cellulære ROS for at studere forskellige betingelser6,7,8. Denne protokol bruges til at registrere total ROS i klæbende celler. Brug af denne metode til at opdage ROS i suspension celler kan have brug for nogle ændringer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

Oxidativt stress er en vigtig begivenhed under både fysiologiske og patologiske forhold. I denne undersøgelse demonstrerer vi, hvordan man kvantificerer oxidativt stress ved at måle den samlede reaktive iltart (ROS) ved hjælp af 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farvning i kolorektal cancer cellelinjer som et eksempel. Denne protokol beskriver detaljerede trin, herunder forberedelse af DCFH-DA-opløsning, inkubation af celler med DCFH-DA-opløsning og måling af normaliseret intensitet. DCFH-DA farvning er en enkel og omkostningseffektiv måde at opdage ROS i celler. Det kan bruges til at måle ROS generation efter kemisk behandling eller genetiske modifikationer. Derfor er det nyttigt til bestemmelse af cellulære oxidativstress på miljøstress, der giver spor til mekanistiske undersøgelser.

HCT116 kolorektal cancerceller blev behandlet med 100 μM FS eller 10 μM DOX for at fremkalde oxidativt stress7. Som vist i figur 1blev grøn fluorescens dramatisk forøget både FS og DOX som forventet. For at kvantificere den relative intensitetsændring blev cellerne lyset efter at have taget billeder og normaliseret med proteinkoncentrationer. Den kvantificerede fluorescensintensitet blev signifikant forøget af FS eller DOX i HCT116-celler.
<p class="jove_co...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Her præsenterer vi en protokol til påvisning af total cellulære reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA). Denne metode kan visualisere cellulær ROS lokalisering i klæbende celler med en fluorescens mikroskop og kvantificere ROS intensitet med en fluorescens plade læser. Denne protokol er enkel, effektiv og omkostningseffektiv.

Påvisning af totalreaktive iltarter i klæbende celler med 2',7'-Dichlordihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Denne metode kan bruges til at analysere cellulære reaktive iltarter i klæbende celler med kun et fluorescensmikroskop og kvantificere reaktiv iltarters intensitet med fluorescenspladelæser. Denne protokol er enkel, effektiv og omkostningseffektiv. Start med såning to gange 10 til den femte HCT116 kolorektal cancer celler i DMEM i hver brønd af en 24-brønd plade.Inkuber cellerne natten over ved 37 grader Celsius. På den næste dag, erstatte kulturmediet med 100 mikromolar jernsulfat, eller 10 mikromolar doxorubicin-holdige medium, og inkubere pladen i yderligere 24 timer. Forbered DCFH-DA-opløsningen ved at opløse 4,85 mg DCFH-DA i en milliliter DMSO for at lave en 10 millimolar lageropløsning.Lige før du tilføjer det til brøndene, fortynde bestanden med forvarmtet DMEM at gøre en 10 mikromolar arbejdsløsning, og vortex det i 10 sekunder. At plette cellerne, fjerne narkotika-holdige medium, og vaske dem én gang med DMEM. Tilsæt 500 mikroliter af DCFH-DA arbejdsløsning i hver brønd, og inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Efter inkubationen fjernes DCFH-DA'en fra brøndene, og de vaskes to gange med DMEM og én gang med PBS. Derefter tilsættes 500 mikroliter AF PBS til hver brønd. Brug den grønne fluorescerende proteinkanal på fluorescensmikroskopet til at tage repræsentative billeder af cellerne.Fjern derefter PBS, og tilsæt 200 mikroliter af radioimmunoprecipitation assay buffer til hver brønd. Indkube pladen på is i fem minutter, og opsaml cellelysningerne i 1,5 milliliterrør. Centrifuge rørene ved 21, 130 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Overfør derefter 100 mikroliter af supernatanten til en sort 96-brøndplade. Brug en mikropladelæser ved en excitation bølgelængde på 485 nanometer, og en emission bølgelængde på 530 nanometer, at måle fluorescens i hver brønd. Dernæst måle proteinkoncentrationen med Bradford-analysen ved at overføre en mikroliter af supernatanten til en klar 96-brøndplade med 100 mikroliter proteinanalyseopløsning.Brug proteinkoncentrationerne til at normalisere fluorescensintensiteten. HCT116 kolorektal cancerceller blev behandlet med 100 mikromolar jernsulfat, eller 10 mikromolar doxorubicin, at fremkalde oxidativstress. Som forventet, grøn fluorescens blev dramatisk forøget af begge behandlinger.For at kvantificere de relative intensitetsændringer blev cellerne lyset og normaliseret med proteinkoncentrationer. Den relative fluorescensintensitet blev signifikant forøget med jernsulfat eller doxorubicin. Når du udfører denne procedure, er det vigtigt at gøre DCFH-DA-opløsning frisk og undgå lyseksponering samt at minimere cellestatusforstyrrelser og at udføre omfattende PBS-vask, lige før du tager billedet.Ud over påvisning af den samlede ROS ved denne protokol, specielt ROS såsom peroxid kan udføres.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA farvning metode baseret på formazankoncentrationen nedbør induceret af blå lys eksponering

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Kvantitative og kvalitative metode for Sphingomyelin af LC-MS bruger to stabile brændselsfremstilling mærket Sphingomyelin arter

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Måling af mitokondrie iltforbrug i Permeabilized fibre fra Drosophila bruger minimale mængder af væv

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Ved hjælp af højt indhold Imaging for at kvantificere mål Engagement i vedhængende celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Undersøgelse af metabolismen af seks systemiske insekticider i en nyetableret celle affjedrings kultur afledt af te (Camellia sinensis L.) Blade

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...