Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (K01DK114390), een Research Scholar Grant van de American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), een Research Pilot Project Grant van de University of New Mexico Environmental Health Signature Program and Superfund (P42 ES025589), een Shared Resources Pilot Project Award en een Research Program Support Pilot Project Award van UNM uitgebreid kankercentrum (P30CA118100) , en een nieuwe onderzoeker award van de Dedicated Health Research Funds aan de Universiteit van New Mexico School of Medicine.

1. Celzaaien
<ol><li>Zaad 2 x 105 HCT116 colorectale kankercellen per put in een 24-put plaat en onderhouden de cellen in dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) 's nachts op 37 °C.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium door of zonder 100 μM ferrosulfaat (FS) of 10 μM doxorubicine (DOX) met medium en incubaat gedurende 24 uur.</li>
</ol>2. Voorbereiding van de DCFH-DA-oplossing
<ol><li>Los 4,85 mg DCFH-DA op in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) om een voorraadoplossing van 10 mM te...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

Het experimentele protocol dat hier wordt beschreven is gemakkelijk reproduceerbaar om cellulaire totale ROS te meten. De kritieke stappen omvatten het maken van DCFH-DA-oplossing fris en het vermijden van blootstelling aan licht, het minimaliseren van de cel status verstoring en uitgebreide PBS wassen vlak voor het nemen van beelden. Voor de bereiding van dcfh-DA werkoplossing moet de voorraadoplossing worden toegevoegd in voorverwarmde DMEM vlak voordat deze in de 24 putplaat wordt toegevoegd. De reden is dat oude oplo...

Drie belangrijke reactieve zuurstofsoorten (ROS) die door cellulair metabolisme worden geproduceerd die van fysiologische betekenis zijn superoxideanion, hydroxylradical, en waterstofperoxide1. Bij lage concentraties nemen ze deel aan fysiologische celprocessen, maar bij hoge concentraties hebben ze nadelige effecten op celsignaleringstrajecten1. Ons lichaam heeft antioxidantsystemen ontwikkeld, die effectief zijn tegen overmatige ROS. Oxidatieve stress kan echter optreden wanneer ROS het ontgiftende vermogen van ons lichaam overweldigt, wat bijdraagt aan vele pathologische aandoeningen, waaronder ontsteking, kanker en neurodegeneratieve ziekte2,3,4. Het doel van deze methode is het bepalen van de totale cellulaire ROS in aanhangende cellen met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA) kleuring. De reden is dat oxidatie van DCFH-DA tot 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) op grote schaal is gebruikt voor totale ROS-detectie, waaronder hydroxylradicalen (•OH) en stikstofdioxide (•NR2). Mechanistisch, DCFH-DA wordt opgenomen door cellen waar cellulaire esterase kloven uit de acetyl groepen, wat resulteert in DCFH. Oxidatie van DCFH door ROS zet het molecuul om in DCF, dat groene fluorescentie uitzendt bij een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 530 nm. Vergeleken met detectie van fluorescentie met stroomcytometrie en andere alternatieve methoden5,voordelen van deze methode met behulp van een fluorescentie microscoop en een plaatlezer zijn dat het duidelijk zichtbare fluorescerende beelden produceert, en is gemakkelijk uit te voeren, efficiënt en kosteneffectief. Deze methode is op grote schaal gebruikt om cellulaire ROS te detecteren voor het bestuderen van verschillende aandoeningen6,7,8. Dit protocol wordt gebruikt voor het detecteren van de totale ROS in aanhangende cellen. Het gebruik van deze methode om ROS in suspensiecellen te detecteren, kan enkele wijzigingen nodig hebben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

Oxidatieve stress is een belangrijke gebeurtenis onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. In deze studie laten we zien hoe oxidatieve stress te kwantificeren door het meten van de totale reactieve zuurstof soorten (ROS) met behulp van 2',7',7's ofgfohydrofluoresceïne diacetaat (DCFH-DA) kleuring in colorectale kanker cellijnen als voorbeeld. Dit protocol beschrijft gedetailleerde stappen, waaronder de voorbereiding van dcfh-DA-oplossing, incubatie van cellen met DCFH-DA-oplossing en meting van genormaliseerde intensiteit. DCFH-DA kleuring is een eenvoudige en kosteneffectieve manier om ROS in cellen te detecteren. Het kan worden gebruikt om ROS generatie te meten na chemische behandeling of genetische modificaties. Daarom is het nuttig voor het bepalen van cellulaire oxidatieve stress op milieustress, het verstrekken van aanwijzingen voor mechanistische studies.

HCT116 colorectale kankercellen werden behandeld met 100 μM FS of 10 μM DOX om oxidatieve stress te veroorzaken7. Zoals blijkt uit figuur 1,werd de groene fluorescentie zoals verwacht drastisch verhoogd met zowel FS als DOX. Om de relatieve intensiteitsverandering te kwantificeren, werden de cellen na het nemen van beelden gelysed en genormaliseerd met eiwitconcentraties. De gekwantificeerde fluorescentieintensiteit werd aanzienlijk verhoogd door FS of DOX in HCT116...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.

Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Deze methode kan worden gebruikt om cellulaire reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen met slechts een fluorescentiemicroscoop te analyseren en de intensiteit van de reactieve zuurstofsoorten te kwantificeren met fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief. Begin met het zaaien van twee keer 10 tot de vijfde HCT116 colorectale kankercellen in DMEM in elke put van een 24-put plaat.Broed de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius. Vervang de volgende dag het kweekmedium door 100 micromolar ferrosulfaat, of 10 micromolar doxorubicinehoudend medium, en broed de plaat nog 24 uur uit. Bereid de DCFH-DA-oplossing voor door 4,85 milligram DCFH-DA op te lossen in één milliliter DMSO om een 10 millimolar voorraadoplossing te maken.Vlak voordat u het aan de putten toevoegt, verdun de voorraad met voorverwarmde DMEM om een 10 micromolar werkoplossing te maken en draaikolk het gedurende 10 seconden. Om de cellen te bevlekken, verwijder het medicijnhoudende medium en was ze één keer met DMEM. Voeg 500 microliter DCFH-DA werkoplossing toe aan elke put en ontcubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.Na de incubatie, verwijder de DCFH-DA uit de putten, en was ze twee keer met DMEM, en een keer met PBS. Voeg vervolgens 500 microliter PBS toe aan elke put. Gebruik het groene fluorescerende eiwitkanaal op de fluorescentiemicroscoop om representatieve beelden van de cellen te maken.Verwijder vervolgens de PBS en voeg 200 microliters radioimmunoprecipitatietestbuffer toe aan elke put. Broed de plaat vijf minuten op ijs en verzamel de cellysates in buizen van 1,5 milliliter. Centrifugeren de buizen op 21, 130 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.Breng vervolgens 100 microliter van de supernatant over naar een zwarte 96-putplaat. Gebruik een microplate lezer op een excitatie golflengte van 485 nanometer, en een emissie golflengte van 530 nanometer, om de fluorescentie te meten in elke put. Meet vervolgens de eiwitconcentratie met de Bradford-test door een microliter van de supernatant over te brengen naar een duidelijke 96-putplaat met 100 microliters eiwittestoplossing.Gebruik de eiwitconcentraties om de fluorescentieintensiteiten te normaliseren. HCT116 colorectale kankercellen werden behandeld met 100 micromolar ferrosulfaat, of 10 micromolar doxorubicine, om oxidatieve stress te veroorzaken. Zoals verwacht, werd de groene fluorescentie dramatisch verhoogd door beide behandelingen.Om de relatieve intensiteitsveranderingen te kwantificeren, werden de cellen gelyseerd en genormaliseerd met eiwitconcentraties. De relatieve fluorescentieintensiteit werd aanzienlijk verhoogd door ferrosulfaat of doxorubicine. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om DCFH-DA-oplossing fris te maken en blootstelling aan licht te voorkomen, evenals om de storing in de celstatus te minimaliseren en om vlak voor het maken van beeld uitgebreide PBS-was uit te voeren.Naast de detectie van de totale ROS door dit protocol, kan specifiek ROS zoals peroxide worden uitgevoerd.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA kleuring methode gebaseerd op Formazan neerslag veroorzaakt door blootstelling aan blauw licht

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...