Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Health (K01DK114390), un sussidio di ricerca dell'American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), una sovvenzione per il progetto di progetto pilota di ricerca University of New Mexico Environmental Health Signature Program and Superfund (P42 ES025589), un Shared Resources Pilot Project Award e un Research Program Support Pilot Project Award del centro oncologico globale UNM (P30CA118100) , e un nuovo premio ricercatore dal Dedicated Health Research Funds presso la Scuola di Medicina dell'Università del Nuovo Messico.

1. Semina delle cellule
<ol><li>Seme 2 x 105 cellule tumorali dell'HCT116 per bene in una piastra di 24 pozzetti e mantengono le cellule nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) durante la notte a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Sostituire il mezzo di coltura con o senza 100 soflfato ferroso (FS) o 10 M doxorubicin (DOX) contenente mezzo e incubare per 24 h.</li>
</ol>2. Preparazione della soluzione DCFH-DA
<ol><li>Sciogliere 4,85 mg di DCFH-DA in 1 mL di solforo dimetilo (DMSO)...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

Il protocollo sperimentale qui descritto è facilmente riproducibile per misurare il ROS totale cellulare. I passaggi critici includono la creazione di soluzioni DCFH-DA fresche ed evitando l'esposizione alla luce, la riduzione al minimo dei disturbi dello stato delle cellule e l'ampio lavaggio PBS prima di scattare le immagini. Per la preparazione della soluzione di lavoro DCFH-DA, la soluzione di stock deve essere aggiunta nel DMEM preriscaldato subito prima di aggiungerla alla piastra 24. Il motivo è che le vecchie s...

Tre principali specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dal metabolismo cellulare che hanno un significato fisiologico sono l'anione di superossido, il radicale idrossile e il perossido di idrogeno1. A basse concentrazioni, partecipano a processi cellulari fisiologici, ma ad alte concentrazioni hanno effetti negativi sulle vie di segnalazione cellulare1. Il nostro corpo ha sviluppato sistemi antiossidanti, che sono efficaci contro il ROS eccessivo. Tuttavia, lo stress ossidativo può verificarsi quando ROS sopraffare la capacità disintossicante del nostro corpo, che contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui infiammazione, cancro, e malattia neurodegenerativa2,3,4.4 Lo scopo di questo metodo è quello di determinare il ROS cellulare totale nelle cellule aderenti utilizzando la colorazione di diattato (DCFH-DA) di 2',7'-diclorodiidrofluorescein (DCFH-DA). La logica è che l'ossidazione del DCFH-DA al 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) è stata ampiamente utilizzata per il rilevamento totale2del ROS, compresi i radicali idrossili (OH) e il biossido di azoto ( . Meccanicamente, DCFH-DA è occupato da cellule dove cellulare all'espegnimento dei fendi fuori i gruppi di acetil, con conseguente DCFH. L'ossidazione di DCFH da parte di ROS converte la molecola in DCF, che emette fluorescenza verde ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm. Rispetto al rilevamento della fluorescenza con citometria di flusso e altri metodi alternativi5, i vantaggi di questo metodo utilizzando un microscopio a fluorescenza e un lettore di lamiere sono che produce immagini fluorescenti chiaramente visibili, ed è facile da eseguire, efficiente e conveniente. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per rilevare ROS cellulare per studiare varie condizioni6,7,8. Questo protocollo viene utilizzato per rilevare ros totale nelle cellule aderenti. L'utilizzo di questo metodo per rilevare ROS nelle celle delle sospensioni potrebbe richiedere alcune modifiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

Lo stress ossidativo è un evento importante sia in condizioni fisiologiche che patologiche. In questo studio, dimostriamo come quantificare lo stress ossidativo misurando le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando come esempio la colorazione di 2',7'-diclorohydrofluorescein (DCFH-DA). Questo protocollo descrive i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della soluzione DCFH-DA, l'incubazione di cellule con la soluzione DCFH-DA e la misurazione dell'intensità normalizzata. La colorazione DCFH-DA è un modo semplice ed economico per rilevare ROS nelle cellule. Può essere utilizzato per misurare la generazione di ROS dopo il trattamento chimico o le modifiche genetiche. Pertanto, è utile per determinare lo stress ossidativo cellulare sullo stress ambientale, fornendo indizi agli studi meccanicistici.

Le cellule tumorali del colon-retto HCT116 sono state trattate con 100 FS o 10 -M DOX per indurre lo stress ossidativo7. Come mostrato nella Figura 1, la fluorescenza verde è stata drammaticamente aumentata sia da FS che da DOX come previsto. Per quantificare il cambiamento di intensità relativo, le cellule sono state lismilate dopo l'assunzione di immagini e normalizzate con concentrazioni di proteine. L'intensità quantificata della fluorescenza è stata significa...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.

Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Questo metodo può essere utilizzato per analizzare le specie di ossigeno reattivo cellulare nelle cellule aderenti con solo un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità reattiva delle specie di ossigeno con il lettore di piastre a fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente ed economico. Inizia seminando due volte 10 alla quinta cellule tumorali colorettali HCT116 in DMEM in ogni pozzo di una piastra da 24 porri.Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il mezzo di coltura con 100 solfato ferroso micromolare, o 10 mezzo contenente doxorubicina micromolare, e incubare la piastra per altre 24 ore. Preparare la soluzione DCFH-DA sciogliendo 4,85 milligrammi di DCFH-DA in un millilitro di DMSO per fare una soluzione di 10 millimolare.Poco prima di aggiungerlo ai pozzi, diluire il materiale con DMEM preri riscaldato per creare una soluzione di lavoro da 10 micromolari e vortice per 10 secondi. Per macchiare le cellule, rimuovere il mezzo contenente farmaci e lavarle una volta con DMEM. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavoro DCFH-DA in ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo l'incubazione, rimuovere il DCFH-DA dai pozzi e lavarli due volte con DMEM e una volta con PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri di PBS ad ogni pozzo. Utilizzare il canale proteico fluorescente verde sul microscopio a fluorescenza per scattare immagini rappresentative delle cellule.Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione a ciascun pozzo. Incubare la piastra sul ghiaccio per cinque minuti e raccogliere i liscivi cellulari in tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi a 21, 130 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi trasferire 100 microlitri del supernatante su una piastra nera da 96 porri. Usa un lettore di micropiastrite ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nanometri, per misurare la fluorescenza in ogni pozzo. Successivamente, misurare la concentrazione proteica con il saggio di Bradford trasferendo un microlitro del supernatante in una piastra chiara da 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione di dosaggio proteico.Utilizzare le concentrazioni proteiche per normalizzare le intensità di fluorescenza. Le cellule tumorali colorettali HCT116 sono state trattate con 100 solfati ferrosi micromolari, o 10 doxorubicina micromolare, per indurre stress ossidativo. Come previsto, la fluorescenza verde è stata drasticamente aumentata da entrambi i trattamenti.Per quantificare i cambiamenti di intensità relativa, le cellule sono state lese e normalizzate con concentrazioni proteiche. L'intensità relativa della fluorescenza è stata significativamente aumentata dal solfato ferroso o dalla doxorubicina. Quando si esegue questa procedura, è importante rendere fresca la soluzione DCFH-DA ed evitare l'esposizione alla luce, nonché ridurre al minimo i disturbi dello stato delle cellule ed eseguire un ampio lavaggio PBS subito prima di scattare l'immagine.Oltre al rilevamento del ROS totale da parte di questo protocollo, è possibile eseguire specificamente ROS come il perossido.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Ricerca

Biochimica

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Metodo quantitativo e qualitativo per sfingomielina mediante LC-MS utilizzando due stabile isotopicamente etichettato sfingomielina specie

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Misurare e interpretare i tassi di consumo di ossigeno in tutto Vola testa segmenti

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Con alto contenuto di Imaging per quantificare l'impegno di destinazione in cellule aderenti

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...