Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
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この研究の一部は、米国癌学会(RSG-18-050-01-NEC)の研究奨学生助成金である国立衛生研究所(K01DK114390)によって支えられ、研究パイロットプロジェクト助成金を受け取りました。 ニューメキシコ大学環境衛生署名プログラムとスーパーファンド(P42 ES025589)、共有資源パイロットプロジェクト賞、UNM総合がんセンターの研究プログラム支援パイロットプロジェクト賞(P30CA118100)ニューメキシコ大学医学部の健康研究基金の新しい研究者賞を受賞。

1. 細胞の播種
<ol><li>種子2 x 105 HCT116大腸癌細胞は24ウェルプレートでウェルあたり、37°Cで一晩ダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)の細胞を維持します。</li>
	<li>培地を含む100μMの硫酸第一鉄(FS)または10μMドキソルビシン(DOX)を含む培地とインキュベートを24時間使用するか、または含まない培地を交換してください。</li>
</ol>2. DCFH-DA溶液の調製
<ol><li>DCFH-DAの4.85mgを...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

ここで説明する実験プロトコルは、細胞総ROSを測定するために容易に再現可能である。重要なステップには、DCFH-DA溶液を新鮮にし、光暴露を回避し、細胞状態障害を最小限に抑え、画像を撮る直前に広範なPBS洗浄を行う必要があります。DCFH-DA作業ソリューションの調製のために、ストック溶液は24ウェルプレートに追加する前に、事前に温められたDMEMに追加する必要があります。その理由?...

生理的意味を持つ細胞代謝によって産生される3つの主要な活性酸素種(ROS)は、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、及び過酸化水素1である。低濃度では、それらは生理学的細胞プロセスに関与するが、高濃度では細胞シグナル伝達経路1に悪影響を及ぼす。私たちの体は、過剰なROSに対して有効である抗酸化システムを開発しました。しかし、酸化ストレスは、炎症、癌、および神経変性疾患,,2、3、4を含む多くの病的状態に寄与する、ROSが私たちの体の解毒能力を圧倒2するときに発生する可能性があります。この方法の目的は、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)染色を使用して、接着細胞における総細胞ROSを決定することです。その根拠は、DCFH-DAから2'-7'ジクロロフルオレセイン(DCF)への酸化が、ヒドロキシルラジカル(•OH)および二酸化窒素(•NO2)を含む総ROS検出のために広く使用されてきたということです。機械学的に、DCFH-DAは、細胞エステラーゼがアセチル基を切断する細胞によって取り込まれるため、DCFHが得られます。ROSによるDCFHの酸化は、分子をDCFに変換し、励起波長485nmで緑色蛍光を放出し、発光波長は530nmです。フローサイトメトリーと他の代替方法5で蛍光の検出と比較すると、この方法の利点は、蛍光顕微鏡とプレートリーダーを用いて、それが明確に目に見える蛍光画像を生成し、かつ、効率的かつ費用対効果が高く、実行が容易である。この方法は、様々,な条件6、7、87を研究6するための細胞ROSを検出するために広く使用されている。8このプロトコルは、接着細胞の総ROSを検出するために使用されます。この方法を使用して懸濁液細胞のROSを検出するには、いくつかの変更が必要な場合があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

酸化ストレスは、生理学的および病理学的条件下で重要な事象である。本研究では、2',7'ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全活性酸素種(ROS)を測定し、大腸癌細胞系で染色を行い、酸化ストレスを定量する方法を例に示す。このプロトコルはDCFH-DA溶液の調製、DCFH-DA溶液による細胞のインキュベーション、および正規化された強度の測定を含む詳細なステップを記述する。DCFH-DA染色は、細胞内のROSを検出するためのシンプルで費用対効果の高い方法です。これは、化学処理または遺伝子改変後のROS生成を測定するために使用することができる。そのため、環境ストレス時の細胞酸化ストレスを決定するのに有用であり、機械学的研究の手がかりを提供する。

HCT116大腸癌細胞を100 μM FSまたは10 μM DOXで処理し、酸化ストレス7を誘導した。図1に示すように、期待通りFSとDOXの両方により緑色蛍光が劇的に増加した。相対的な強度変化を定量化するために、細胞を画像を撮った後にリセドし、タンパク質濃度で正規化した。定量された蛍光強度は、HCT116細胞におけるFSまたはDOXによって有意に増加した。
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Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

ここでは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全細胞活性酸素種(ROS)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、蛍光顕微鏡で接着細胞における細胞ROS局在を可視化し、蛍光プレートリーダーでROS強度を定量化することができる。このプロトコルは、シンプルで効率的で費用対効果が高いプロトコルです。

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

この方法は、接着細胞の細胞活性酸素種を蛍光顕微鏡だけで分析し、蛍光プレートリーダーで反応酸素種の強度を定量するために使用できます。このプロトコルは、シンプルで効率的で、費用対効果が高いプロトコルです。DMEMのHCT116大腸癌細胞を24ウェルプレートの各ウェルに2回10回播種することから始めます。細胞を摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、培養培地を100ミクロモル硫酸第一鉄、または10マイクロモルドキソルビシン含有培地に交換し、さらに24時間プレートをインキュベートする。DCFH-DAの4.85ミリグラムをDMSOの1ミリリットルに溶解して、10ミリモルのストック溶液を作り出して、DCFH-DA溶液を調製します。井戸に加える直前に、あらかじめ温めたDMEMでストックを希釈して10マイクロモル加工溶液を作り、10秒間渦を出します。細胞を染色するには、薬物含有培地を取り出し、DMEMで一度洗います。各井戸に500マイクロリットルのDCFH-DA作業溶液を加え、30分間摂氏37度でプレートをインキュベートします。インキュベーション後、DCFH-DAをウェルから取り出し、DMEMで2回、PBSで1回洗浄します。次に、各ウェルに500マイクロリットルのPBSを加えます。蛍光顕微鏡の緑色蛍光タンパク質チャネルを使用して、細胞の代表的な画像を撮影します。次いでPBSを取り出し、各ウェルに200マイクロリットルの放射性免疫沈降アッセイバッファーを加える。氷の上にプレートを5分間インキュベートし、細胞ライセートを1.5ミリリットルのチューブに集めます。チューブを摂氏4度で10分間10分間21、130倍Gで遠心分離する。その後、上清の100マイクロリットルを黒い96ウェルプレートに移します。マイクロプレートリーダーは、励起波長485ナノメートル、発光波長530ナノメートルで、各ウェルの蛍光を測定します。次に、1マイクロリットルの上清を100マイクロリットルのタンパク質アッセイ溶液を用いた透明な96ウェルプレートに移すことによって、ブラッドフォードアッセイでタンパク質濃度を測定します。タンパク質濃度を使用して蛍光強度を正規化します。HCT116大腸癌細胞を100ミクロモル硫酸第一鉄、または10ミクロモルドキソルビシンで処理し、酸化ストレスを誘発した。予想通り、両方の治療によって緑色蛍光が劇的に増加した。相対的な強度変化を定量化するために、細胞をタンパク質濃度でリズし、正規化した。この相対蛍光強度は、硫酸第一鉄またはドキソルビシンによって有意に増加した。この手順を実行する際には、DCFH-DA溶液を新鮮にし、光暴露を避け、細胞状態障害を最小限に抑え、画像を撮る直前に広範なPBS洗浄を行うことが重要です。このプロトコルによる総ROSの検出に加えて、具体的には過酸化物などのROSを行うことができる。

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