Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (K01DK114390), en forskerstipend fra American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), et forskningspilotprosjekt Stipend fra University of New Mexico Environmental Health Signature Program og Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award og en Research Program Support Pilot Project Award fra UNM omfattende kreftsenter (P30CA118100) , og en ny etterforsker pris fra dedikerte helseforskning midler ved University of New Mexico School of Medicine.

1. Cellereding
<ol><li>Frø 2 x 105 HCT116 kolorektal kreftceller per brønn i en 24-brønnplate og vedlikehold cellene i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) over natten ved 37 °C.</li>
	<li>Bytt kulturmediet med eller uten 100 μM jernsulfat (FS) eller 10 μM doksorubicin (DOX) som inneholder medium og inkuber i 24 timer.</li>
</ol>2. Tilberedning av DCFH-DA-oppløsningen
<ol><li>Oppløs 4,85 mg DCFH-DA i 1 ml dimetylsulfoksid (DMSO) for å lage en 10 mM lagerløsning.</li>
...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

Den eksperimentelle protokollen som er beskrevet her er lett reproduserbar for å måle cellulær total ROS. De kritiske trinnene inkluderer å gjøre DCFH-DA-løsningen frisk og unngå lyseksponering, minimere cellestatusforstyrrelser og omfattende PBS-vask rett før du tar bilder. For fremstilling av DCFH-DA arbeidsløsning, bør lagerløsningen legges til pre-oppvarmet DMEM rett før du legger inn i 24 brønnplaten. Årsaken er at gamle løsninger som genererer høy bakgrunnsfluorescens eller lyseksponering vil føre ...

Tre store reaktive oksygenarter (ROS) produsert av cellulær metabolisme som er av fysiologisk betydning er superoksidanion, hydroksylradikal og hydrogenperoksid1. Ved lave konsentrasjoner deltar de i fysiologiske celleprosesser, men ved høye konsentrasjoner har de bivirkninger på cellesignaler1. Kroppen vår har utviklet antioksidantsystemer, som er effektive mot overdreven ROS. Oksidativt stress kan imidlertid oppstå når ROS overvelder kroppens avgiftende evne, noe som bidrar til mange patologiske tilstander, inkludert betennelse, kreft og nevrodegenerativ sykdom2,3,4. Formålet med denne metoden er å bestemme total cellulær ROS i tilhengerceller ved hjelp av 2',7'-diklordiohydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farging. Begrunnelsen er at oksidasjon av DCFH-DA til 2'-7'diklorofluorescein (DCF) har blitt brukt mye for total ROS-deteksjon, inkludert hydroksylradikaler (•OH) og nitrogendioksid (•NO2). Mekanistisk, DCFH-DA er tatt opp av celler der cellulær esterase cleaves av acetyl grupper, noe som resulterer i DCFH. Oksidasjon av DCFH av ROS konverterer molekylet til DCF, som avgir grønn fluorescens ved en eksitasjon bølgelengde på 485 nm og en utslipp bølgelengde på 530 nm. Sammenlignet med påvisning av fluorescens med strømningscytometri og andre alternative metoder5, fordeler med denne metoden ved hjelp av et fluorescensmikroskop og en plateleser er at den produserer tydelig synlige fluorescerende bilder, og er enkle å utføre, effektive og kostnadseffektive. Denne metoden har blitt mye brukt til å oppdage cellulær ROS for å studere ulike forhold6,7,8. Denne protokollen brukes til å oppdage total ROS i tilhengerceller. Ved hjelp av denne metoden for å oppdage ROS i suspensjon celler kan trenge noen modifikasjoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

Oksidativt stress er en viktig hendelse under både fysiologiske og patologiske forhold. I denne studien viser vi hvordan man kvantifisere oksidativt stress ved å måle totale reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farging i kolorektal kreftcellelinjer som et eksempel. Denne protokollen beskriver detaljerte trinn, inkludert utarbeidelse av DCFH-DA-løsning, inkubasjon av celler med DCFH-DA-løsning og måling av normalisert intensitet. DCFH-DA farging er en enkel og kostnadseffektiv måte å oppdage ROS i celler. Den kan brukes til å måle ROS generasjon etter kjemisk behandling eller genetiske modifikasjoner. Derfor er det nyttig for å bestemme cellulær oksidativt stress på miljøstress, og gir ledetråder til mekanistiske studier.

HCT116 kolorektal kreftceller ble behandlet med 100 μM FS eller 10 μM DOX for å indusere oksidativt stress7. Som vist i figur 1ble grønn fluorescens dramatisk økt med både FS og DOX som forventet. For å kvantifisere den relative intensitetsendringen ble cellene lysert etter å ha tatt bilder og normalisert med proteinkonsentrasjoner. Den kvantifiserte fluorescensintensiteten ble signifikant økt med FS- eller DOX i HCT116-celler.
<p class="jove_content" fo:...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Her presenterer vi en protokoll for å oppdage totale cellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Denne metoden kan visualisere cellulær ROS lokalisering i tilhengerceller med et fluorescensmikroskop og kvantifisere ROS-intensitet med en fluorescensplateleser. Denne protokollen er enkel, effektiv og kostnadseffektiv.

Påvisning av total reaktive oksygenarter i tilhengerceller av 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Flekker

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Denne metoden kan brukes til å analysere cellulære reaktive oksygenarter i tilbeslutningsceller med bare et fluorescensmikroskop, og kvantifisere reaktiv oksygenartintensitet med fluorescensplateleser. Denne protokollen er enkel, effektiv og kostnadseffektiv. Start med seeding to ganger 10 til den femte HCT116 kolorektal kreftceller i DMEM i hver brønn av en 24-brønns plate.Inkuber cellene over natten ved 37 grader Celsius. På neste dag erstatter du kulturmediet med 100 mikromolar jernsulfat, eller 10 mikromolar doksorubicinholdig medium, og inkuber platen i ytterligere 24 timer. Forbered DCFH-DA-løsningen ved å oppløse 4,85 milligram DCFH-DA i ett milliliter DMSO for å lage en 10 millimolar lagerløsning.Rett før du legger den til brønnene, fortynne bestanden med forhåndsvarmet DMEM for å lage en 10 mikromolar arbeidsløsning, og vortex det i 10 sekunder. For å flekke cellene, fjern det legemiddelholdige mediet, og vask dem en gang med DMEM. Tilsett 500 mikroliter dcfh-da arbeidsløsning i hver brønn, og inkuber platen ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Etter inkubasjonen, fjern DCFH-DA fra brønnene, og vask dem to ganger med DMEM, og en gang med PBS. Deretter legger du til 500 mikroliter PBS til hver brønn. Bruk den grønne fluorescerende proteinkanalen på fluorescensmikroskopet til å ta representative bilder av cellene.Fjern deretter PBS, og legg til 200 mikroliter radioimmunoprecipitation analysebuffer til hver brønn. Inkuber platen på is i fem minutter, og samle cellen lysates i 1,5 milliliter rør. Sentrifuger rørene ved 21, 130 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Deretter overfører du 100 mikroliter av supernatanten til en svart 96-brønns plate. Bruk en mikroplateleser ved en eksitasjonsbølgelengde på 485 nanometer, og en utslippsbølgelengde på 530 nanometer, for å måle fluorescensen i hver brønn. Deretter måler du proteinkonsentrasjonen med Bradford-analysen ved å overføre en mikroliter av supernatanten til en klar 96-brønnsplate med 100 mikroliter proteinanalyseoppløsning.Bruk proteinkonsentrasjonene til å normalisere fluorescensintensitetene. HCT116 kolorektalkreftceller ble behandlet med 100 mikromolar jernsulfat, eller 10 mikromolar doksorubicin, for å indusere oksidativt stress. Som forventet ble grønn fluorescens dramatisk økt ved begge behandlingene.For å kvantifisere de relative intensitetsendringene ble cellene lyset og normalisert med proteinkonsentrasjoner. Den relative fluorescensintensiteten ble signifikant økt ved jernsulfat eller doksorubicin. Når du utfører denne prosedyren, er det viktig å gjøre DCFH-DA-løsningen frisk og unngå lyseksponering, samt for å minimere cellestatusforstyrrelser, og å utføre omfattende PBS-vask rett før du tar bildet.I tillegg til påvisning av den totale ROS av denne protokollen, kan spesielt ROS som peroksid utføres.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA flekker metode basert på Formazan nedbør forårsaket av blå lyseksponering

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Kvantitative og kvalitative metode for Sphingomyelin av LC-MS bruker to stabil Isotopically merket Sphingomyelin arter

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Måling av mitokondrie oksygenforbruk i Permeabilized fiber av Drosophila med minimale mengder vev

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og tolke oksygen forbruk priser helt Fly hodet segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...