Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (K01DK114390), um Research Scholar Grant da American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), um Projeto Piloto de Pesquisa Grant do Programa de Assinatura de Saúde Ambiental da Universidade do Novo México e Superfund (P42 ES025589), um Prêmio piloto de recursos compartilhados e um prêmio de projeto piloto de suporte ao programa de pesquisa do Centro de Câncer Abrangente unm (P30CA118100) , e um novo prêmio de pesquisador do Fundo dedicado à pesquisa em saúde da Faculdade de Medicina da Universidade do Novo México.

1. Semeadura celular
<ol><li>Semente 2 x 105 HCT116 células cancerígenas colorretal por poço em uma placa de 24 poços e manter as células no meio águia modificada (DMEM) modificado de Dulbecco durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Substitua o meio de cultura por ou sem sulfato ferroso de 100 μM (FS) ou 10 μM doxorubicina (DOX) contendo médio e incubado por 24 h.</li>
</ol>2. Preparação da solução DCFH-DA
<ol><li>Dissolva 4,85 mg de DCFH-DA em 1 mL de sulfóxido de dimetil...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

O protocolo experimental descrito aqui é facilmente reproduzível para medir ros total celular. As etapas críticas incluem tornar a solução DCFH-DA fresca e evitar a exposição à luz, minimizar a perturbação do estado celular e a extensa lavagem de PBS logo antes de tirar imagens. Para a preparação da solução de trabalho DCFH-DA, a solução de estoque deve ser adicionada em DMEM pré-aquecido logo antes de adicionar na placa de poço 24. A razão é que soluções antigas que geram fluorescência de fundo el...

Três grandes espécies de oxigênio reativo (ROS) produzidas pelo metabolismo celular que são de significado fisiológico são ânion de superóxido, radical hidroxis e peróxido de hidrogênio1. Em baixas concentrações, participam de processos fisiológicos celulares, mas em altas concentrações têm efeitos adversos nas vias de sinalização celular1. Nosso corpo desenvolveu sistemas antioxidantes, que são eficazes contra ros excessivos. No entanto, o estresse oxidativo pode ocorrer quando a ROS sobrecarrega a capacidade desintoxicante do nosso corpo, o que contribui para muitas condições patológicas, incluindo inflamação, câncer e doença neurodegenerativa2,,3,4. O objetivo deste método é determinar o ros celular total em células aderentes usando a coloração de diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). A lógica é que a oxidação de DCFH-DA a 2'-7'dichlororeoresceína (DCF) tem sido usada extensivamente para detecção total de ROS, incluindo radicais hidroxil (•OH) e dióxido de nitrogênio (•NO2). Mecanicamente, DCFH-DA é tomado por células onde esterase celular cleaves fora dos grupos de acetil, resultando em DCFH. A oxidação de DCFH por ROS converte a molécula em DCF, que emite fluorescência verde em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm. Comparado com a detecção de fluorescência com citometria de fluxo e outros métodos alternativos5, as vantagens deste método usando um microscópio de fluorescência e um leitor de placas são que produz imagens fluorescentes claramente visíveis, e é fácil de executar, eficiente e econômico. Este método tem sido amplamente utilizado para detectar ROS celular para estudar várias condições6,,7,8. Este protocolo é usado para detectar ros total em células aderentes. O uso deste método para detectar ROS em células de suspensão pode precisar de algumas modificações.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

O estresse oxidativo é um evento importante em condições fisiológicas e patológicas. Neste estudo, demonstramos como quantificar o estresse oxidativo medindo a coloração total de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando 2',7'-diclorodihiorescetina diacetato (DCFH-DA) manchando em linhas de células cancerígenas colorretais como exemplo. Este protocolo descreve etapas detalhadas, incluindo a preparação da solução DCFH-DA, a incubação de células com solução DCFH-DA e a medição da intensidade normalizada. A coloração DCFH-DA é uma maneira simples e econômica de detectar ROS nas células. Pode ser usado para medir a geração de ROS após tratamento químico ou modificações genéticas. Portanto, é útil para determinar o estresse oxidativo celular sobre o estresse ambiental, fornecendo pistas para estudos mecanicistas.

As células cancerígenas colorretais HCT116 foram tratadas com 100 μM FS ou 10 μM DOX para induzir o estresse oxidativo7. Como mostrado na Figura 1,a fluorescência verde foi dramaticamente aumentada tanto por FS quanto pelo DOX, como esperado. Para quantificar a mudança de intensidade relativa, as células foram lístidas após a realização de imagens e normalizadas com concentrações proteicas. A intensidade de fluorescência quantificada foi significativamen...

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Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Este método pode ser usado para analisar espécies de oxigênio reativa celular em células aderentes com apenas um microscópio de fluorescência, e quantificar a intensidade das espécies de oxigênio reativa com leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico. Comece semeando duas vezes 10 para o quinto HCT116 células cancerígenas colorretais em DMEM em cada poço de uma placa de 24 poços.Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, substitua o meio de cultura por 100 sulfato ferroso micromolar, ou 10 micromolars contendo doxorubicina, e incubar a placa por mais 24 horas. Prepare a solução DCFH-DA dissolvendo 4,85 miligramas de DCFH-DA em um mililitro de DMSO para fazer uma solução de estoque de 10 mililitros.Logo antes de adicioná-lo aos poços, diluir o estoque com DMEM pré-aquecido para fazer uma solução de trabalho de 10 micromolar, e vórtice por 10 segundos. Para colorir as células, remova o meio contendo drogas e lave-as uma vez com DMEM. Adicione 500 microliters de solução de trabalho DCFH-DA em cada poço, e incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos.Após a incubação, remova o DCFH-DA dos poços e lave-os duas vezes com DMEM e uma vez com PBS. Em seguida, adicione 500 microliters de PBS a cada poço. Use o canal de proteína fluorescente verde no microscópio de fluorescência para tirar imagens representativas das células.Em seguida, remova o PBS e adicione 200 microliters de tampão de ensaio radioimune a cada poço. Incubar a placa no gelo por cinco minutos, e coletar os lises celulares em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos a 21, 130 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, transfira 100 microliters do supernante para uma placa preta de 96 poços. Use um leitor de microplaca em um comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros, e um comprimento de onda de emissão de 530 nanômetros, para medir a fluorescência em cada poço. Em seguida, meça a concentração de proteína com o ensaio de Bradford transferindo um microliter do supernante para uma placa clara de 96 poços com 100 microliters de solução de ensaio proteico.Use as concentrações proteicas para normalizar as intensidades de fluorescência. As células cancerígenas colorretais HCT116 foram tratadas com 100 sulfato ferroso micromolar, ou 10 doxorubicina micromolar, para induzir o estresse oxidativo. Como esperado, a fluorescência verde foi dramaticamente aumentada por ambos os tratamentos.Para quantificar as alterações relativas de intensidade, as células foram lístidas e normalizadas com concentrações proteicas. A intensidade relativa da fluorescência foi significativamente aumentada por sulfato ferroso ou doxorubicina. Ao realizar este procedimento, é importante tornar a solução DCFH-DA fresca e evitar a exposição à luz, bem como minimizar a perturbação do estado celular e realizar uma extensa lavagem de PBS logo antes de tirar a imagem.Além da detecção do ROS total por este protocolo, especificamente ros como peróxido pode ser realizado.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Bioquímica

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Usando o índice elevado de imagem para quantificar o destino noivado em células aderentes

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...