Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (K01DK114390), una Beca de Becas de Investigación de la Sociedad Americana contra el Cáncer (RSG-18-050-01-NEC), un Proyecto Piloto de Investigación Subvención del Programa de Firma de Salud Ambiental y Superfundo de la Universidad de Nuevo México (P42 ES025589), un Premio al Proyecto Piloto de Recursos Compartidos y un Premio al Proyecto Piloto de Apoyo al Programa de Investigación del Centro Oncológico Integral de la UNM (P30CA118100) , y un nuevo premio de investigador de los Fondos De Investigación Sanitaria Dedicados de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nuevo México.

1. Siembra celular
<ol><li>Semilla 2 x 105 células de cáncer colorrectal HCT116 por pozo en una placa de 24 pozos y mantener las células en el medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco durante la noche a 37 oC.</li>
	<li>Sustituya el medio de cultivo por o sin sulfato ferroso de 100 m (FS) o doxorubicina (DOX) de 10 oM que contenga medio e incubar durante 24 h.</li>
</ol>2. Preparación de la solución DCFH-DA
<ol><li>Disolver 4,85 mg de DCFH-DA en 1 ml de dimetilsólfóxido (D...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

El protocolo experimental descrito aquí es fácilmente reproducible para medir el total celular ROS. Los pasos críticos incluyen hacer que la solución DCFH-DA sea fresca y evitar la exposición a la luz, minimizar las perturbaciones del estado de las células y el lavado extenso de PBS justo antes de tomar imágenes. Para la preparación de la solución de trabajo DCFH-DA, la solución de stock debe añadirse a DMEM precalentado justo antes de añadir en la placa de 24 pozos. La razón es que las soluciones antiguas q...

Tres especies principales de oxígeno reactivo (ROS) producidas por el metabolismo celular que son de significado fisiológico son anión superóxido, radical hidroxilo, y peróxido de hidrógeno1. A bajas concentraciones, participan en procesos celulares fisiológicos, pero a altas concentraciones tienen efectos adversos en las vías de señalización celular1. Nuestro cuerpo ha desarrollado sistemas antioxidantes, que son eficaces contra el exceso de ROS. Sin embargo, el estrés oxidativo puede ocurrir cuando ROS abruma la capacidad desintoxicante de nuestro cuerpo, lo que contribuye a muchas condiciones patológicas, incluyendo inflamación, cáncer, y enfermedad neurodegenerativa2,,3,4. El propósito de este método es determinar el total de ROS celular en las células adherentes utilizando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) tinción. La razón es que la oxidación de DCFH-DA a 2'-7'diclorofluoresceína (DCF) se ha utilizado ampliamente para la detección total de ROS, incluidos los radicales hidroxilo (•OH) y el dióxido de nitrógeno (•NO2). Mecánicamente, DCFH-DA es tomado por células donde la esterasa celular se corta fuera de los grupos de acetil, lo que resulta en DCFH. La oxidación de DCFH por ROS convierte la molécula a DCF, que emite fluorescencia verde a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm. En comparación con la detección de fluorescencia con citometría de flujo y otros métodos alternativos5,las ventajas de este método utilizando un microscopio de fluorescencia y un lector de placas son que produce imágenes fluorescentes claramente visibles, y es fácil de realizar, eficiente y rentable. Este método ha sido ampliamente utilizado para detectar ROS celular para el estudio de diversas condiciones6,7,8. Este protocolo se utiliza para detectar ROS total en células adherentes. El uso de este método para detectar ROS en las células de suspensión puede necesitar algunas modificaciones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

El estrés oxidativo es un evento importante en condiciones fisiológicas y patológicas. En este estudio, demostramos cómo cuantificar el estrés oxidativo midiendo las especies de oxígeno reactivo total (ROS) utilizando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) tinción en líneas celulares de cáncer colorrectal como ejemplo. Este protocolo describe los pasos detallados, incluida la preparación de la solución DCFH-DA, la incubación de células con solución DCFH-DA y la medición de la intensidad normalizada. La tinción DCFH-DA es una forma sencilla y rentable de detectar ROS en las células. Se puede utilizar para medir la generación de ROS después de un tratamiento químico o modificaciones genéticas. Por lo tanto, es útil para determinar el estrés oxidativo celular sobre el estrés ambiental, proporcionando pistas para estudios mecanicistas.

Las células cancerosas colorrectales HCT116 fueron tratadas con 100 m FS o 10 m DOX para inducir estrés oxidativo7. Como se muestra en la Figura 1,la fluorescencia verde se incrementó drásticamente tanto por FS como en DOX como se esperaba. Para cuantificar el cambio de intensidad relativa, las células fueronizadas después de tomar imágenes y normalizadas con concentraciones de proteínas. La intensidad de fluorescencia cuantificada se incrementó significativa...

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Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.

Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Este método se puede utilizar para analizar especies celulares reactivas de oxígeno en células adherentes con solo un microscopio de fluorescencia, y cuantificar la intensidad reactiva de las especies de oxígeno con lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable. Comience por sembrar dos veces 10 a la quinta células de cáncer colorrectal HCT116 en DMEM en cada pozo de una placa de 24 pozos.Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, sustituya el medio de cultivo por 100 sulfatos ferrosos micromolares, o 10 medios micromolares que contengan doxorubicina, e incubar la placa durante otras 24 horas. Prepare la solución DCFH-DA disolviendo 4,85 miligramos de DCFH-DA en un mililitro de DMSO para hacer una solución de stock de 10 milimolar.Justo antes de añadirlo a los pozos, diluir el caldo con DMEM precalentó para hacer una solución de trabajo de 10 micromolares, y vórtice durante 10 segundos. Para manchar las células, retire el medio que contiene el medicamento y lávelos una vez con DMEM. Agregue 500 microlitros de solución de trabajo DCFH-DA en cada pozo e incubar la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Después de la incubación, retire el DCFH-DA de los pozos, y lávelos dos veces con DMEM, y una vez con PBS. A continuación, agregue 500 microlitros de PBS a cada pozo. Utilice el canal de proteína fluorescente verde en el microscopio de fluorescencia para tomar imágenes representativas de las células.A continuación, retire el PBS y agregue 200 microlitros de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación a cada pozo. Incubar la placa sobre hielo durante cinco minutos y recoger los lysates celulares en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 21, 130 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.A continuación, transfiera 100 microlitros del sobrenadante a una placa negra de 96 pozos. Utilice un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros, y una longitud de onda de emisión de 530 nanómetros, para medir la fluorescencia en cada pozo. A continuación, mida la concentración de proteínas con el ensayo Bradford transfiriendo un microlitro del sobrenadante a una placa clara de 96 pozos con 100 microlitros de solución de ensayo de proteínas.Utilice las concentraciones de proteínas para normalizar las intensidades de fluorescencia. Las células cancerosas colorrectales HCT116 fueron tratadas con 100 sulfatos ferrosos micromolares, o 10 doxorubicina micromolares, para el estrés oxidativo inductor. Como era de esperar, la fluorescencia verde se incrementó dramáticamente con ambos tratamientos.Para cuantificar los cambios de intensidad relativa, las células se normalizaron y normalizaron con concentraciones de proteínas. La intensidad relativa de fluorescencia se incrementó significativamente por sulfato ferroso o doxorubicina. Al realizar este procedimiento, es importante hacer que la solución DCFH-DA sea fresca y evitar la exposición a la luz, así como minimizar la perturbación del estado celular, y realizar un lavado extenso de PBS justo antes de tomar la imagen.Además de la detección del ROS total por este protocolo, específicamente ROS como peróxido se puede realizar.

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