Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health (K01DK114390), ett forskningsstipendium från American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), ett pilotprojekt för forskning från American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), ett pilotprojekt för forskning Bidrag från University of New Mexico Environmental Health Signature Program och Superfund (P42 ES025589), en Shared Resources Pilot Project Award och ett forskningsprogram Support Pilot Project Award från UNM omfattande cancer center (P30CA118100) , och en ny utredare utmärkelse från de särskilda hälsoforskningsfonder vid University of New Mexico School of Medicine.

1. Cellsåd
<ol><li>Frö 2 x 105 HCT116 kolorektal cancerceller per brunn i en 24-brunnsplatta och underhåll cellerna i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) över natten vid 37 °C.</li>
	<li>Byt ut odlingsmediet mot eller utan 100 μM järnsulfat (FS) eller 10 μM doxorubicin (DOX) som innehåller medium och inkubat i 24 timmar.</li>
</ol>2. Förberedelse av DCFH-DA-lösningen
<ol><li>Lös 4,85 mg DCFH-DA i 1 ml dimetylsulfat (DMSO) för att göra en 10 mM-stamlösning.</li>
...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

Det experimentella protokoll som beskrivs här är lätt reproducerbara att mäta cellulära totala ROS. De kritiska stegen är att göra DCFH-DA lösning fräsch och undvika ljusexponering, minimera cellstatusstörningar och omfattande PBS-tvättning precis innan du tar bilder. För beredning av DCFH-DA arbetslösning bör stamlösningen läggas till förvärmd DMEM precis innan den läggs till i 24-brunnsplattan. Anledningen är att gamla lösningar som genererar hög bakgrund fluorescens eller ljusexponering kommer at...

Tre stora reaktiva syrearter (ROS) som produceras av cellulär metabolism som är av fysiologisk betydelse är superoxid anjon, hydroxylradikal, och väteperoxid1. Vid låga koncentrationer deltar de i fysiologiska cellprocesser, men vid höga koncentrationer har de negativa effekter på cellsignaleringsvägarna1. Vår kropp har utvecklat antioxidant system, som är effektiva mot överdriven ROS. Emellertid, oxidativ stress kan uppstå när ROS överväldiga avgiftande förmåga vår kropp, vilket bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive inflammation, cancer, och neurodegenerativa sjukdomar2,3,4. Syftet med denna metod är att bestämma totala cellulära ROS i vidhäftande celler med 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) färgning. Motiveringen är att oxidation av DCFH-DA till 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) har använts i stor utsträckning för total ROS-detektion inklusive hydroxylradikaler (•OH) och kvävedioxid (•NO2). Mekanistiskt tas DCFH-DA upp av celler där cellesteras klyver av acetylgrupperna, vilket resulterar i DCFH. Oxidation av DCFH av ROS omvandlar molekylen till DCF, som avger grön fluorescens vid en excitationvåglängd på 485 nm och en utsläppsvåglängd på 530 nm. Jämfört med detektion av fluorescens med flödescytometri och andra alternativa metoder5är fördelarna med denna metod med hjälp av ett fluorescensmikroskop och en plattläsare att den producerar väl synliga fluorescerande bilder och är lätt att utföra, effektiva och kostnadseffektiva. Denna metod har använts i stor utsträckning för att upptäcka cellulära ROS för att studera olika villkor6,7,8. Detta protokoll används för att upptäcka total AVKASTNING i vidhäftande celler. Använda denna metod för att upptäcka ROS i suspensionsceller kan behöva vissa ändringar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

Oxidativ stress är en viktig händelse under både fysiologiska och patologiska förhållanden. I denna studie visar vi hur man kvantifierar oxidativ stress genom att mäta totala reaktiva syrearter (ROS) med 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) färgning i kolorektal cancer cellinjer som ett exempel. Detta protokoll beskriver detaljerade steg inklusive beredning av DCFH-DA lösning, inkubation av celler med DCFH-DA lösning och mätning av normaliserad intensitet. DCFH-DA färgning är ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att upptäcka ROS i celler. Det kan användas för att mäta ROS-generering efter kemisk behandling eller genetiska modifieringar. Därför är det användbart för att bestämma cellulär oxidativ stress på miljöstr stress, vilket ger ledtrådar till mekanistiska studier.

HCT116 kolorektal cancerceller behandlades med 100 μM FS eller 10 μM DOX för att inducera oxidativ stress7. Som framgår av figur 1ökade grön fluorescens dramatiskt av både FS och DOX som förväntat. För att kvantifiera den relativa intensitetsförändringen var cellerna lysed efter att ha tagit bilder och normaliserades med proteinkoncentrationer. Den kvantifierade fluorescensintensiteten ökade signifikant med FS eller DOX i HCT116-celler.
<p class="jove...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka totala cellulära reaktiva syrearter (ROS) med 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Denna metod kan visualisera cellulära ROS lokalisering i vidhäftande celler med en fluorescens mikroskop och kvantifiera ROS intensitet med en fluorescens platta läsare. Detta protokoll är enkelt, effektivt och kostnadseffektivt.

Detektion av total reaktiva syrearter i vidhäftande celler med 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Färgning

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Denna metod kan användas för att analysera cellulära reaktiva syrearter i anhängare celler med endast en fluorescens mikroskop, och kvantifiera reaktiva syrearter intensitet med fluorescens plattan läsare. Det här protokollet är enkelt, effektivt och kostnadseffektivt. Börja med sådd två gånger 10 till den femte HCT116 kolorektal cancerceller i DMEM i varje brunn av en 24-brunns platta.Inkubera cellerna över natten vid 37 grader Celsius. På nästa dag, ersätta odlingsmediet med 100 mikromolar järnsulfat, eller 10 mikromolar doxorubicin-innehållande medium, och inkubera plattan i ytterligare 24 timmar. Förbered DCFH-DA-lösningen genom att lösa upp 4,85 milligram DCFH-DA i en milliliter dmso för att göra en 10 millimolar lagerlösning.Precis innan du lägger den till brunnarna, späd beståndet med förvättnad DMEM att göra en 10 mikromolar arbetslösning, och virvel det i 10 sekunder. Att färga cellerna, ta bort det läkemedelsinnehållande mediet, och tvätta dem en gång med DMEM. Tillsätt 500 mikroliter DCFH-DA arbetslösning i varje brunn, och inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 30 minuter.Efter inkubationen, ta bort DCFH-DA från brunnarna, och tvätta dem två gånger med DMEM, och en gång med PBS. Lägg sedan till 500 mikroliter PBS till varje brunn. Använd den gröna fluorescerande proteinkanalen på fluorescensmikroskopet för att ta representativa bilder av cellerna.Ta sedan bort PBS, och tillsätt 200 mikroliter av radioimmunoprecipitation assay buffert till varje brunn. Inkubera plattan på is i fem minuter, och samla cellen lysates i 1,5 milliliter rör. Centrifugera rören vid 21, 130 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Överför sedan 100 mikroliter av supernatanten till en svart 96-brunnsplatta. Använd en mikroplattläsare vid en excitationsvåglängd på 485 nanometer, och en emissionsvåglängd på 530 nanometer, för att mäta fluorescensen i varje brunn. Därefter mäta proteinkoncentrationen med Bradford-analysen genom att överföra en mikroliter av supernatanten till en tydlig 96-brunnsplatta med 100 mikroliter proteinanalyslösning.Använd proteinkoncentrationerna för att normalisera fluorescensintensiteterna. HCT116 kolorektal cancerceller behandlades med 100 micromolar järnsulfat, eller 10 micromolar doxorubicin, att inducera oxidativ stress. Som väntat ökades den gröna fluorescensen dramatiskt av båda behandlingarna.För att kvantifiera de relativa intensitetsförändringarna var cellerna lysed och normaliseras med protein koncentrationer. Den relativa fluorescens intensiteten ökades avsevärt av järnsulfat eller doxorubicin. När du utför detta förfarande, är det viktigt att göra DCFH-DA lösning fräsch och undvika ljusexponering, samt att minimera cell status störning, och att utföra omfattande PBS tvätta rätt innan du tar bild.Förutom detektering av den totala ROS av detta protokoll, specifikt ROS såsom peroxid kan utföras.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA färgning metod baserad på Formazan nederbörd induceras av blå ljus exponering

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Kvantitativ och kvalitativ metod för ceramidas av LC-MS med två stabila Isotopically märkt ceramidas arter

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Mätning av mitokondriell syreförbrukning i Permeabilized fibrer av Drosophila använder minimala mängder av vävnad

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...