Name: detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (K01DK114390), Amerikan Kanser Derneği (RSG-18-050-01-NEC), bir Araştırma Pilot Proje Hibe bir Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir New Mexico Üniversitesi Çevre Sağlığı İmza Programı ve Superfund (P42 ES025589), Paylaşılan Kaynaklar Pilot Proje Ödülü ve UNM kapsamlı kanser merkezinden Araştırma Programı Destek Pilot Proje Ödülü (P30CA118100) , ve New Mexico Tıp Fakültesi'nde Özel Sağlık Araştırma Fonları yeni bir araştırmacı ödülü.

1. Hücre tohumlama
<ol><li>Tohum 2 x 105 HCT116 kolorektal kanser hücreleri 24-iyi plaka içinde iyi başına ve 37 °C gecede Dulbecco modifiye Eagle orta (DMEM) hücreleri korumak.</li>
	<li>24 saat boyunca orta ve inkübat içeren 100 μM demir sülfat (FS) veya 10 μM doksorubisin (DOX) içeren kültür ortamını değiştirin.</li>
</ol>2. DCFH-DA çözeltisinin hazırlanması
<ol><li>10 mM stok çözeltisi yapmak için 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 4.85 mg DCFH-DA ?...

<ol>
	<li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+defense.">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li><li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li><li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer.">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer &amp; Metabolism. 2, 17 (2014).</li><li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization.">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li><li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells.">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li><li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis.">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth.">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li><li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway.">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).</li><li>Kruger, N. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+Method+For+Protein+Quantitation.">The Bradford Method For Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).</li><li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species.">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li><li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues.">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li><li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder/phosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry.">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li></ol>

Burada açıklanan deneysel protokol hücresel toplam ROS ölçmek için kolayca tekrarlanabilir. Kritik adımlar arasında DCFH-DA çözümlerini taze hale getirmek ve ışığa maruz kalmaktan kaçınmak, hücre durumu bozukluğunu en aza indirmek ve fotoğraf çekmeden hemen önce kapsamlı PBS yıkama yer almaktadır. DCFH-DA çalışma solüsyonunun hazırlanması için, stok çözeltisi 24 kuyu plakasına eklemeden hemen önce önceden ısıtılmış DMEM'e eklenmelidir. Bunun nedeni, yüksek arka plan floresan vey...

Fizyolojik anlamı olan hücresel metabolizma tarafından üretilen üç büyük reaktif oksijen türü (ROS) süperoksit aniyon, hidroksil radikal ve hidrojen peroksit1. Düşük konsantrasyonlarda, fizyolojik hücre süreçlerine katılırlar, ancak yüksek konsantrasyonlarda hücre sinyal yolları üzerinde olumsuz etkileri vardır1. Vücudumuz aşırı ROS karşı etkili antioksidan sistemler geliştirmiştir. Ancak, oksidatif stres ROS vücudumuzun detoksifiye yeteneğini bastırmak oluşabilir, hangi birçok patolojik koşullara katkıda bulunur, inflamasyon da dahil olmak üzere, kanser, ve nörodejeneratif hastalık2,3,4. Bu yöntemin amacı 2',7'-diklorodihidrolüorescein diasetat (DCFH-DA) boyama kullanarak yapışık hücrelerde toplam hücresel ROS belirlemektir. Bunun mantığı, DCFH-DA'nın 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) oksidasyonunun hidroksil radikalleri (•OH) ve azot dioksit (•NO2)dahil olmak üzere toplam ROS tespiti için yaygın olarak kullanılmasıdır. Mekanistik olarak, DCFH-DA hücresel esterazın asetil gruplarını keserek DCFH ile sonuçlanan hücreler tarafından alınır. DCFH'nin ROS tarafından oksidasyonu molekülü DCF'ye dönüştürür, bu da 485 nm'lik uyarma dalga boyunda ve 530 nm emisyon dalga boyunda yeşil floresan yayar. Akış sitometrisi ve diğer alternatif yöntemlerle floresan tespiti ile karşılaştırıldığında5, floresan mikroskobu ve plaka okuyucu kullanarak bu yöntemin avantajları, açıkça görülebilir floresan görüntüler üretir, ve gerçekleştirmek kolay, verimli ve maliyet-etkin. Bu yöntem yaygın olarak çeşitli koşulları incelemek için hücresel ROS tespit etmek için kullanılmıştır6,7,8. Bu protokol, yapışık hücrelerdeki toplam ROS'u saptaması için kullanılır. Süspansiyon hücrelerinde ROS'u tespit etmek için bu yöntemi kullanmak için bazı değişiklikler gerekebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:900px;" width="899">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate</td>
			<td style="width:229px;">Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td>
			<td style="width:93px;">20656</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:229px;">TCI America, Portland, OR</td>
			<td style="width:93px;">D4193-25MG</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Ferrous Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:229px;">VWR, Radnor, PA</td>
			<td style="width:93px;">97061-542</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>or any other fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein assay Bradford solution</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA</td>
			<td style="width:93px;">5000001</td>
			<td style="width:300px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax M2 Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>or any other fluorescence microplate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of total reactive oxygen species in adherent cells by 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining

Oksidatif stres hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda önemli bir olaydır. Bu çalışmada kolorektal kanser hücre hatlarında 2',7'-diklorodihidrofloresensein diasetat (DCFH-DA) kullanılarak total reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçerek oksidatif stresin nasıl ölçültüldüğü gösterilmiştir. Bu protokol, DCFH-DA çözeltisinin hazırlanması, DCFH-DA çözeltisi olan hücrelerin kuluçkaya yatırılması ve normalleştirilmiş yoğunluğun ölçülmesi gibi ayrıntılı adımları açıklar. DCFH-DA boyama hücrelerde ROS tespit etmek için basit ve uygun maliyetli bir yoldur. Kimyasal tedavi veya genetik modifikasyonlardan sonra ROS neslini ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, çevre stresi üzerine hücresel oksidatif stres belirlenmesi için yararlıdır, mekanistik çalışmalariçin ipuçları sağlayan.

HCT116 kolorektal kanser hücreleri oksidatif strese neden olmak için 100 μM FS veya 10 μM DOX ile tedavi edildi7. Şekil 1'degösterildiği gibi, yeşil floresan beklendiği gibi hem FS hem de DOX tarafından önemli ölçüde artmıştır. Göreceli yoğunluk değişimini ölçmek için hücreler görüntü alındıktan sonra lysed edildi ve protein konsantrasyonları ile normale döndü. HCT116 hücrelerinde ölçülen floresan yoğunluğu FS veya DOX ile öneml...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining at JoVE.com

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Burada, toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (DCFH-DA) kullanarak tespit etmek için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel ROS lokalizasyon görselleştirmek ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu ölçmek. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir.

2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

Bu yöntem, sadece floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel reaktif oksijen türlerini analiz etmek ve floresan levha okuyucu ile reaktif oksijen türlerinin yoğunluğunu ölçmek için kullanılabilir. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir. DMEM'deki beşinci HCT116 kolorektal kanser hücrelerini 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya iki kez 10 ila 5 kat tohumlayarak başlayın.Hücreleri bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 100 mikromolar demir sülfat veya 10 mikromolar doksorubisin içeren orta ile kültür ortamı değiştirin ve başka bir 24 saat boyunca plaka kuluçka. 10 milimolar stok çözümü yapmak için bir mililitre DMSO'da 4,85 miligram DCFH-DA eriterek DCFH-DA çözeltisini hazırlayın.Kuyulara eklemeden hemen önce, 10 mikromolar çalışma çözeltisi yapmak için önceden ısıtılmış DMEM ile stok seyreltin ve 10 saniye girdap. Hücreleri lekelemek için, ilaç içeren ortamı çıkarın ve dmem ile bir kez yıkayın. Her kuyuya 500 mikrolitre DCFH-DA çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı 30 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, DCFH-DA'yı kuyulardan çıkarın ve iki kez DMEM ile ve bir kez de PBS ile yıkayın. Daha sonra, her kuyuya 500 mikrolitre PBS ekleyin. Hücrelerin temsili görüntülerini çekmek için floresan mikroskoptaki yeşil floresan protein kanalını kullanın.Sonra PBS çıkarın ve her kuyuya radyoimmünopremit analiz tampon200 mikrolitre ekleyin. Plakayı beş dakika buzüzerinde kuluçkaya yatırın ve hücre lisatlarını 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Tüpleri 21, 130 kez G'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Sonra 100 mikrolitre süpernatantı siyah 96 kuyuluk bir plakaya aktarın. Her kuyudaki floresansı ölçmek için 485 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda ve 530 nanometre lik bir emisyon dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu kullanın. Daha sonra, 100 mikrolitre protein istiyatçözeltisi çözeltisi ile süpernatantın bir mikrolitresini 96 kuyulu bir plakaya aktararak Bradford tsay ile protein konsantrasyonu ölçün.Floresan yoğunlukları normalleştirmek için protein konsantrasyonları kullanın. HCT116 kolorektal kanser hücreleri oksidatif strese neden olmak için 100 mikromolar demir sülfat veya 10 mikromolar doksorubisin ile tedavi edildi. Beklendiği gibi, yeşil floresan önemli ölçüde her iki tedavi ile artmıştır.Göreceli yoğunluk değişimlerini ölçmek için hücreler protein konsantrasyonları ile normalleştirildi. Göreceli floresan yoğunluğu demir sülfat veya doksorubisin ile önemli ölçüde artmıştır. Bu yordamı gerçekleştirirken, DCFH-DA çözümünü taze yapmak ve ışığa maruz kalmaktan kaçınmak, hücre durumu bozukluğunü en aza indirmek ve görüntü almadan hemen önce kapsamlı PBS yıkama yapmak önemlidir.Bu protokol ile toplam ROS tespitine ek olarak, özellikle peroksit gibi ROS yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA Formazan yağış mavi ışığa maruz tarafından indüklenen esas alarak yöntemini boyama

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...