Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

نشكر باربرا غوريك وناديا هينترتيتر على مساعدتهما في زراعة الخلايا وإعداد الحلول التجريبية. وينوه بامتنان المؤلفون بالدعم المالي من قبل مجموعة التدريب البحثي 1910 "الكيمياء الطبية للجي بيندس الانتقائية GPCR" الممولة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) تحت رقم المنحة 222125149. وتعرب وزارة الشؤون الاجتماعية عن امتنانها بصفة خاصة للمنحة الدراسية التي منحها برنامج بافاريا للمساواة بين الجنسين.

1. البذر الخلية على صفائف القطب الكهربائي
ملاحظة: اختيار تخطيط القطب الكهربائي هو مفاضلة بين الحساسية وعدد الخلايا قيد الدراسة. كلما كان القطب الكهربائي أصغر ، كلما كان القياس أكثر حساسية ، ولكن الأصغر هو عدد الخلايا قيد الدراسة. بالنسبة للخلايا التي تظهر تقلبات مقاومة قوية ?...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياسات المعاوقة الخالية من الملصقات لتحديد علاقة الجرعة والاستجابة لتنشيط GPCR الناجم عن الالوطنية في غياب أو وجود مضادات محددة لنفس المستقبلات. وقد تم تقديم إثبات مفهوم هذه الطريقة في منشور صدر مؤخرا12. على حد علمنا هو أول دراسة تصف إنشاء منحنى الجرعة...

يقدم هذا التقرير وصفاً مفصلاً لبروتوكول الإضافة التسلسلية الذي تم تطويره للقياس الكمي لتنشيط مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين (GPCR) التي يسببها ليغاند (GPCR) في الخلايا المزروعة بالارتباط بواسطة قياسات المعاوقة الخالية من التسمية. وتشارك مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs) في العديد من الوظائف الفسيولوجية والأمراض البشرية1. وبسبب هذا وسهولة الوصول إليها على سطح الخلية ، GPCRs هي واحدة من أهم أهداف المخدرات. وينعكس هذا التقييم في عدد يقدر بنحو 700 دواء معتمد يستهدف الـ GPCRs، أي ما يعادل حصة تبلغ ~ 35٪ على جميع الأدوية المسوقة2.
ويشمل استحداث عقاقير جديدة عمليتين رئيسيتين هما: '1' تحديد الجزيئات البيولوجية المستهدفة وتوصيفها الوظيفي، و'2' اكتشاف مواد الرصاص الجديدة وتطويرها لتصبح أدوية قابلة للإدارة. وفي كلتا العمليتين، يلزم استخدام أساليب فعالة لتقييم التفاعلات بين المخدِّرات والأهداف والاستجابة البيولوجية اللاحقة. مراحل مختلفة من عملية تطوير المخدرات قبل السريرية الاستفادة من أساليب مختلفة للتحليل تتراوح بين دراسات التفاعل الجزيئي الحيوي بين المخدرات والهدف، على الدراسات الوظيفية على الخلايا في الثقافة، إلى التجارب على مواد الأعضاء المستأصلة أو الحيوانات بأكملها. على حد سواء ، والأهمية الفسيولوجية والتعقيد البيولوجي زيادة من السابق إلى3الأخيرة. على الرغم من أن الهدف العام هو تقليل التجارب الحيوانية ، إلا أن الدراسات الدوائية باستخدام الأعضاء المعزولة من الحيوانات المختبرية أو حتى الحيوانات الكاملة تعتبر حتمية لتوصيف شامل للمرشحين الجدد للأدوية. من حيث القراءة التحليلية ، توفر دراسات علم أدوية الأعضاء استجابة وظيفية "شاملة" متكاملة ذات أهمية فسيولوجية أعلى. ومن عيوب هذه التجارب أنها لا تتوافق مع فحص الإنتاجية العالية لأسباب تقنية وأخلاقية، وقد تم استبدالها إلى حد كبير بدراسات تستند إلى ثقافة الخلية المختبرية4.
طرق لقياس تنشيط GPCR في ثقافات الخلايا تشمل مختلف الاختبارات الكيميائية القائمة على التسمية، والتي تكشف على وجه التحديد الرسل الثانية، وحالة الفوسفور من البروتينات الإشارات المصب، وتفعيل النسخ عبر عوامل النسخ معينة أو ligand الناجمة عن الاتجار مستقبلات داخل الخلايا4،5. ومن عيوب هذه المقالات المستندة إلى التسميات ضرورة تسمية الخلايا بأصباغ أو علامات مشعة قد تكون ضارة. وهذا غالباً ما يتطلب تشغيل المنقّأ كـ تحديد نقطة النهاية لوقت تعرض يجب أن يتم تحديده مسبقاً. إن استخدام اختبارات نقطة النهاية المستندة إلى التسميات يعاني من هذا التوقيت المحدود والمتحيز للغاية للتجربة وخطر أن التسميات الكيميائية والمسابير قد تتداخل مع فسيولوجيا الخلايا العادية - التي قد لا يلاحظها المجرب.
في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقالات خالية من التسمية لرصد تنشيط GPCR ، مثل التقنيات القائمة على المعاوقة أو الأساليب البصرية التي تطبق صريف اتصال الرنانة5،6. ولا يشترط وضع علامات على الخلايا من الناحية التجريبية في هذه النُهج. كما هذه القراءة المادية تعمل على إشارات السعة المنخفضة، وتعتبر هذه الأساليب غير الغازية، فإنها تسمح للرصد المستمر الخلية يحتمل في الوقت الحقيقي ووقت المراقبة محدودة فقط من قبل ثقافة الخلية وليس من قبل القراءة. على غرار عمليات القراءة من أجهزة كاملة ، وعادة ما يقدم نهج خالية من التسمية على استجابات الخلايا الشاملة ، بعيدا المصب من تنشيط مستقبلات عندما التكامل على طول شبكة الإشارات بأكملها يؤدي إلى تغييرات تعتمد على الوقت ولكن بدلا غير محددة في مورفولوجيا الخلية أو إعادة توزيع الشامل. في حين أن الاختبارات المستندة إلى المعاوقة تقيس التوقيع العازل للتغيرات في شكل الخلية7،8، فإن القياسات التي تستخدم صريفات الموجات الرنانة حساسة للتغيرات في مؤشر الانكسار في واجهة الركيزة الخلوية الناشئة عن إعادة توزيع الكتلة الديناميكية (DMR)9. الطابع التكاملي يجعل أساليب خالية من التسمية حساسة للغاية للأحداث بوساطة مستقبلات بغض النظر عن نوع (ق) من البروتين G (Gس،Gi/0،Gs،G12/13)أو α-arrestin المشاركة في سلسلة الإشارات6 ومناسبة تماما لمستويات التعبير الذاتية من المستقبلات.
في معيار المعاوقة خالية من المعاوقة على أساس المعاوقة نمت الخلايا في لوحات متعددة الآبار مع أقطاب coplanar الذهب فيلم المودعة في الجزء السفلي من كل بئر10. وترتبط هذه الصفائف القطب إلى محلل المعاوقة ويتم تسجيل استجابات الخلية إلى التحفيز التجريبي من الآبار الفردية عن طريق قراءات المعاوقة حل الوقت. في مقاضد GPCR نموذجي يتم إضافة ligand في تركيزات مختلفة بشكل فردي لكل فرد بشكل جيد. ثم يتم تحليل التغييرات الناجمة عن ligand في مسار وقت المعاوقة فيما يتعلق بميزات المنحنى المميزة مثل الحد الأقصى لتغيير الإشارة ، والمساحة تحت المنحنى ، وتغيير الإشارة في غضون فترة زمنية معينة أو ميل المنحنى في نقطة زمنية محددة ، من أجل تحديد فعالية وفعالية ligand11.
قد تحد تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية من تطبيق هذه التقنية في حملات الفحص عالي الإنتاجية (HTS). وعلاوة على ذلك ، مع تزايد أعداد العينات التي يتعين اتباعها بالتوازي ، يزيد عدد القياسات الفردية وبالتالي يقلل من دقة الوقت المتاحة لكل بئر تدريجيا - حتى بالنسبة للتسجيلات المتعددة القنوات. في ظل هذه الظروف قد الاستجابات الخلية سريعة وعابرة الهروب من القياس. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد الأساليب التقليدية - نهج تركيز واحد يفرض عامل وقت وتكلفة كبير على التطورات المُطَلَّبة على الأجزاء أو الأجزاء على الشريحة فيما يتعلق بملاءمتها في تحليل تفاعل ligand-GPCR.
لهذا السبب، وضعنا بروتوكول الجرعات خطوة خطوة خطوة التي تمكن من تسجيل منحنيات الاستجابة الجرعة الكاملة من تنشيط GPCR الناجم عن ligand في أحادية الخلية المستزرعة عن طريق الرصد المستمر لمعاوقة بئر واحد في حين يتم زيادة تركيز ناهدي خطوة بخطوة. يزيد بروتوكول الإضافة المغطورية التسلسلي بشكل كبير من الإنتاجية لكل بئر من تركيز واحد إلى 10 تركيزات أو أكثر ، كما هو موضح في المثال الحالي لخلايا U-373 MG البشرية ، والتي تعبر بشكل داخلي عن مستقبلات الهيستامين 1 (H1R). وبالتالي، فإن الأسلوب لديه القدرة على تحسين الإنتاجية بشكل كبير في دراسات الاستجابة للجرعة الخالية من التسمية، في حين يتم الاحتفاظ بالدقة الزمنية في الحد الأقصى الفعال.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

يتم استخدام الاختبارات المستندة إلى المعاوقة الخالية من الملصقات بشكل متزايد لدراسة تنشيط GPCR الناجم عن ligand غير الغازية في تجارب زراعة الخلايا. يوفر هذا النهج في الوقت الحقيقي رصد الخلية مع دقة الوقت التي تعتمد على الجهاز وصولا الى عدة عشرات من ميلي ثانية وأنه مؤتمتة للغاية. ومع ذلك، عندما ترتفع أعداد العينات (على سبيل المثال، دراسات الاستجابة للجرعة لمختلف الليغاندات المختلفة)، قد تصبح تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية التي يمكن التخلص منها وكذلك دقة الوقت المتاحة للتسجيلات المتسلسلة من قبل البئر محدودة. ولذلك ، فإننا نقدم هنا بروتوكول إضافة ناهض المسلسل الذي لديه القدرة على زيادة كبيرة في الناتج من تخفيضات GPCR خالية من التسمية. باستخدام بروتوكول إضافة الناضر التسلسلي ، يتم إضافة جهاز GPCR agonist بالتتابع في زيادة التركيزات إلى طبقة خلية واحدة مع مراقبة مقاومة العينة باستمرار (وضع الناضر). مع هذا النهج التسلسلي، فمن الممكن الآن لإنشاء منحنى الجرعة استجابة كاملة لGPCR الناقد من طبقة خلية واحدة فقط. ينطبق بروتوكول الإضافة المؤنّد التسلسلي على أنواع اقتران GPCR المختلفة ، Gq Gi/0 أوG s وهو متوافق مع مستويات التعبير المؤتلفة والذاتية للمستقبلات قيد الدراسة. مستقبلات منع من قبل خصوم GPCR هو تقييم كذلك (وضع الخصم).

يظهر مخطط نموذجي لإعداد مختلف الحلول الناضعة لتجربة باستخدام صفائف أقطاب كهربائية 8-well مع الهستامين كما في الجداول 1-4. الجدول 1 والجدول 2 يقدمان أحجاماً وتركيزات لتجربة باستخدام طريقة الإضافة 1 (انظر الشكل 1)،في حين يقدم الجدول 3 ...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

يوضح هذا البروتوكول التسجيل في الوقت الحقيقي لعلاقات الجرعة والاستجابة الكاملة لتنشيط GPCR الناجم عن الجرعة من طبقة خلية واحدة تزرع على قطب صغير واحد باستخدام قياسات مقاومة خالية من التسمية. يزيد نظام الدوس الجديد بشكل كبير من الإنتاجية دون فقدان في دقة الوقت.

بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

وهذا البروتوكول يتيح تسجيل علاقة استجابة تركيز وظيفية كاملة من ناهض GPCR من مجموعة خلايا واحدة ويوفر توصيفاً ناهضاً مفصلاً حتى بالنسبة لأرقام عينات الخلايا المنخفضة. والميزة الرئيسية للدَبَة المتسلسلة هي الزيادة في الإنتاجية لأن بئراً واحداً يكفي لإجراء تحليل كامل للاستجابة للتركيز. وهذه التقنية مناسبة تماما لدراسة عملية النقل المفردة في نماذج بيولوجية نادرة ومعقدة، مثل صيغ الجهاز على الشريحة في حاويات ميكروفلويديك مغلقة.وليس من الصعب تنفيذ البروتوكول، شريطة توافر المعدات المناسبة. إن إعداد حلول GPCR ليجوند المختلفة بتركيز مناسب هو مفتاح النجاح. مايكل سكيبا، طالب دراسات عليا، وآن ميلدنر، طالبة جامعية، من مختبرنا سوف يظهران الإجراء.بالنسبة لذر الخلايا على صفائف القطب، أضف التركيز المناسب للخلايا إلى آبار كل صفيف قطب، والسماح للخلايا بالاستقرار بشكل متجانس على قيعان البئر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ما لا يقل عن 36 ساعة في حاضنة ثقافة الخلايا القياسية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وفحص طبقات الخلية عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة لضمان تغطية كاملة لكل قطب مع الخلايا. ثم استبدال متوسطة ثقافة الخلية في كل بئر مع حجم مناسب من قبل تدفئة، مصل خال من المتوسطة.لبدء تسجيل المعاوقة، ضع صفيف الأقطاب الكهربائية في حامل الصفيف المتصل لمحلل المعاوقة، وتأكد من وجود اتصال مقاومة منخفض مناسب بين الأقطاب ومحلل المعاوقة. حدد نوع القطب و / أو تنسيق متعدد البئر في واجهة المستخدم للبرنامج. إذا كانت أوضاع الحصول على بيانات الترددات المفردة ومتعددة متوفرة وكان عدد الآبار التي سيتم تحليلها منخفضًا أو أن دقة الوقت ليست حرجة، حدد تسجيلات تردد متعددة.لضمان دقة زمنية قصوى، حدد تردد مراقبة واحد. ثم ابدأ في الحصول على بيانات المقرر الزمني، وحدد مجلد البيانات لتحديد مكان حفظ البيانات. سيتم تسجيل قراءات المعاوقة في عدد محدد من الترددات لكل بئر لبدء بروتوكول الإضافة التسلسلية في الوضع المتألم لصفيفة ثمانية آبار ، إضافة 30 ميكرولترات من أدنى تركيز من ناهض من الفائدة للخلايا.ثم اسمحوا الخلايا الاستجابة وتككيل لفترة محددة مسبقا من الوقت قبل إضافة 30 ميكرولترات من أعلى تركيز المقبل حتى تم إضافة كل تخفيف المسلسل من ناهض. لتحليل البيانات، قم بطرح مقاومة آخر نقطة بيانات قبل الإضافة الأولى للحل المتألم، ثم قم بتعيين وقت إضافة صفر إلى تسوية قيم المعاوقة. رسم الوقت من المعاوقة تطبيع، وارسم دورات زمنية الفردية لتحديد الحد الأقصى في مقاومة بعد كل خطوة إضافة.إنشاء ورقة بيانات مع هذه القيم، و رسم قيم الحد الأقصى من تغيير المعاوقة كدالة من تركيز ناهض. ثم استخدم روتين تركيب البيانات لتحديد التركيزات الفعالة نصف القصوى والاستجابة القصوى باستخدام نموذج لوجستي أربع معلمات. في هذه التجربة التمثيلية، تمت إضافة 10 حلول مع زيادة تركيزات الهستامين بشكل متسلسل إلى الخلايا كل 15 دقيقة، وتم قياس التغير في المعاوقة في كل نقطة زمنية.ويمكن بعد ذلك رسم التغييرات في المعاوقة كدالة لتركيز الهستامين ووظيفة نقل نموذج لوجستي رباعي البارامترات يتم تركيبه على نقاط البيانات التجريبية من سبع آبار. لحساب الممكن مستقبلات الهستامين downregulation، إزالة حساسية الخلية، أو الإفراط في التحفيز، يمكن تقليل نطاق البيانات للتحليل، كما هو مبين لهذه التجربة التسطية المسلسل واحد. ويمكن بعد ذلك تطبيق ثلاثة معلمات التحسين على البيانات، وتوفير تركيز فعال نصف أقصى من 0.75 زائد أو ناقص 0.12 ميكرومولار لهذا التحليل.إضافة الهستامين مستقبلات خصم ديفينهيدرامين 20 دقيقة قبل الهستامين الأولى النتائج في تأخر زيادة المعاوقة داخل نظام الزهوة المسلسل, المقابلة للحاجة إلى ناهض أعلى لإثارة استجابة الخلية. في العلاقة استجابة الجرعة، يتم التعبير عن تأثير الخصم كتحول نحو اليمين من المنحنيات، المقابلة لزيادة في التركيز الفعال نصف القصوى، شريطة أن يكون الخصم يغاند تنافسية نسبة إلى ناهض. التطبيق الناجح لمخطط الزجرية سهل من الناحية الفنية ولكنه يتطلب تخطيطًا مدروسًا ، حيث أنه من الصعب تنفيذ جميع الخطوات مع التوقيت الصحيح.وقد مهدت ال دوسينغ المسلسل الطريق لإجراء دراسات استجابة تركيز مع نظم قراءات أخرى محدودة فيما يتعلق بعدد العينات التي يتم رصدها بالتوازي. مزايا خاصة من الدوس المسلسل تسمح لدراسة نقل إشارة المستقبلات بوساطة مع قراءات جديدة تماما التي هي حساسة لتغيرات ظاهرية أخرى، مثل الخلايا المنوية. يرجى ارتداء قفازات ونظارات واقية عند إعداد حلول الأسهم من ناهض المستقبلات، لأنها قد تكون خطرة عند استنشاقها أو ابتلعها.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

في كل مكان في المختبر واختبارات الديوبيكيتيمنت النيوكليوسوم

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

رصد GPCR-β-arrestin1/2 التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي لتسريع اكتشاف المخدرات

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

التسمية خاليه ايمونوبريسيبيتيشن الطيف الطيفي سير العمل لتحديد المواقع النووية علي نطاق واسع التنميط

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

بروتوكول ماكسي للسباحة المربوطة بسرعة لتقييم القلب والتنفس للسباحين

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

الفحص الاستراتيجي وتوصيف مجمع إشارات البروتين البصرية GPCR-mini-G للتبلور الناجح

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

استجواب مواز لـ α-Arrestin2 تجنيد لـ Ligand الفحص على نطاق GPCR على نطاق واسع باستخدام PRESTO-Tango assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

في المختبر توصيف مرافقي هيستون باستخدام المقايسات التحليلية والمنسدلة والمرافقة

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...