Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
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我们感谢芭芭拉·戈里克尼克和娜贾·辛特瑞特在细胞培养和实验解决方案的制备方面提供帮助。作者感谢研究培训小组1910年"选择性GPCR配体药物化学"的财政支持，由德国研究基金会（DFG）资助，赠款号为222125149。JAS特别感谢巴伐利亚性别平等方案提供的奖学金。

1. 电极阵列上的电池播种
注：选择电极布局是灵敏度和所研究的电池数量之间的权衡。电极越小，测量越敏感，但所研究的细胞数量越小。对于在基线条件下随时间显示强阻抗波动的电池，更可取的是较大的或数字间电极。
<ol><li>在 37°C 水浴中预加热标准细胞通过和播种所需的所有解决方案。对于人体U-373 MG细胞的检测，它需要：不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS），0.05%?...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

该协议描述了一种无标签阻抗测量方法，以确定在无电激动剂诱导的GPCR活化或存在同一受体的特定拮抗剂时的剂量-反应关系。该方法的概念证明在最近出版的第12号出版物中提出。据我们所知，这是第一个研究描述使用体外单细胞层建立激动剂介导的GPCR活化的全剂量反应曲线。该方法不可避免地需要使用无标签细胞监测方法，并且不适用于端点检测。
该协...

本报告详细介绍了通过无标签阻抗测量，为在粘附生长细胞中结合诱导的G蛋白耦合受体（GPCR）激活的定量而开发的串行添加方案。G蛋白耦合受体（GPCRs）涉及多种生理功能和人类疾病1。由于这一点，并且在细胞表面具有良好的可访问性，GPCRs是最重要的药物靶点之一。这一评估反映在估计的700个针对全环苯酚的核准药物数量上，相当于所有上市药物2的35%的份额。
新药的开发包括两个中心过程：（一） 生物靶分子的鉴定和功能表征，和（二）发现新的铅物质及其发展成可管理药物。在这两个过程中，都需要有效的方法来定量评估药物-目标相互作用和随后的生物下游反应。临床前药物开发过程的不同阶段使用不同的分析方法，从药物和目标之间的生物分子相互作用研究，对培养细胞的功能研究，到切除器官材料或整个动物的实验。生理意义和生物复杂性从前者增加到后3。虽然尽量减少动物实验是总体目标，但使用实验室动物甚至整个动物的分离器官进行药理学研究对于全面描述新药候选者是不可避免的。在分析读出方面，器官药理学研究提供了一个与生理相关性最高的远端、综合的"整体"功能反应。这种实验的一个缺点是，由于技术原因和道德原因，它们与高通量筛选不兼容，并且在很大程度上被基于体外细胞培养4的研究所取代。
在细胞培养物中量化GPCR活化的方法包括不同的基于标签的化学测定，它专门检测第二信使、下游信号蛋白的磷酸化状态、通过某些转录因子转录激活或配体诱导的细胞内受体贩运4、5。这种基于标签的检测的缺点是有必要给细胞贴上可能有害的染料或放射性标记标签。这通常需要在必须先验指定的曝光时间中运行测定作为端点确定。使用基于标签的端点检测会受到实验时间非常有限和偏颇的影响，以及化学标签和探针可能干扰正常细胞生理学的风险，而实验者可能没有注意到。
近年来，用于监测GPCR活化的无标签检测已经出现，如基于阻抗的技术或应用谐振波导光栅5、6的光学方法。用这些方法在实验上不需要给细胞贴上标签。由于这些物理读出在低振幅信号上运行，这些方法被认为是非侵入性的，它们允许实时连续的细胞监测，观察时间仅受细胞培养的限制，而不是由读出。与来自整个器官的读出类似，无标签方法通常报告整体细胞反应，当沿整个信令网络集成导致细胞形态或大规模再分配的时间依赖性但非特定变化时，受体激活的下游。基于阻抗的测定测量细胞形状7、8变化的介电特征，使用谐振波导光栅的测量对动态质量再分配（DMR）9引起的细胞基体界面折射率的变化很敏感。综合特性使得无标签方法对受体介导事件极其敏感，而不管G蛋白（Gq、Gi/0、G12/13）或信号级联6中涉及的β-逮捕素，非常适合受体的内源表达水平。
在标准无标签阻抗测定中，细胞附着生长在多孔板中，共平面金膜电极沉积在每口井10的底部。这些电极阵列连接到阻抗分析仪，并且通过时间解析阻抗读数从单个孔中记录对实验刺激的单元响应。在典型的GPCR测定中，配体以不同的浓度分别添加到每个井中。然后，根据特征曲线特征（如最大信号变化、曲线下面积、给定时间间隔内的信号变化或指定时间点的曲线斜率）分析阻抗时间过程中的配体引起的变化，以量化配体的效力和功效11。
电极阵列的成本可能会限制该技术在高通量筛选（HTS） 运动中的应用。此外，随着要并行跟踪的样本数量不断增加，单个测量的数量也会增加，从而逐渐降低每个油井的可用时间分辨率，甚至对于最先进的多通道记录也是如此。在这种情况下，快速和瞬态细胞响应可能逃避测量。此外，传统的一井-一种浓度方法对片上或片上机的注入器官开发在配体-GPCR相互作用分析中的适用性而言，具有显著的时间和成本因素。
为此，我们开发了一种分步剂量协议，通过持续监测单孔的阻抗，同时逐步增加激动剂浓度，从而记录培养细胞单层中配体诱导GPCR活化的全剂量-反应曲线。序列激动剂添加方案显著提高了每口井的通量，从一种浓度增加到10个或更多浓度，如目前人类U-373 MG细胞的例子所示，该细胞内分泌表达组胺1受体（H1R）。因此，该方法有可能在无标签剂量反应研究中显著提高吞吐量，同时将时间分辨率保持在仪器最大值。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

在细胞培养实验中，基于标签的阻抗测定越来越多地用于非侵入性研究配体诱导的GPCR活化。该方法提供实时单元监控，与设备相关的时间分辨率降低至几十毫秒，并且高度自动化。然而，当样本数量变高（例如，不同配体的剂量反应研究）时，一次性电极阵列的成本以及连续井记录的可用时间分辨率可能会受到限制。因此，我们在这里提出了一个串行的激动剂添加协议，它有可能显著增加无标签GPCR检测的输出。使用串行激动剂添加协议，GPCR激动剂按顺序添加到单个细胞层，同时持续监测样品的阻抗（激动器模式）。通过这种串行方法，现在可以从单个细胞层为GPCR激动剂建立一个完整的剂量反应曲线。序列激动剂添加方案适用于不同的GPCR耦合类型，Gq Gi/0或Gs，与所研究受体的重组和内源表达水平兼容。GPCR 拮抗剂的受体阻塞也是可评估的（拮抗模式）。

在表1-4中，使用8井电极阵列，将组胺作为激动剂的实验，展示了一种制备各种激动剂溶液的典型方案。表 1和表 2提供了使用加法模式1的实验的体积和浓度（参见图 1），而表 3 和表 4则显示添加模式 2之后的实验的体积和浓度（参见图 1）。数据是使用方程 （1） ...

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Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

该协议演示了使用无标签阻抗测量从单个微电极上生长的单个细胞层的激动剂诱导GPCR活化的全剂量-反应关系的实时记录。新的配量方案显著提高了吞吐量，而不会损失时间分辨率。

基于无标签阻抗的 GPCR 检测中用于提高吞吐量的逐步加量协议

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

该协议能够记录从一个细胞群体中记录GPCR激动剂的完整功能集中反应关系，并提供详细的激动剂表征，即使是低细胞样本数。串行量的优势是吞吐量增加，因为单个井足以进行全浓度响应分析。该技术非常适合研究稀有和复杂的生物模型中的单转导，如封闭微流体容器中的片上器官格式。只要有适当的设备可用，协议就不难执行。以正确的浓度准备各种 GPCR 配体解决方案是成功的关键。研究生迈克尔·斯基巴和本实验室的本科生安妮·米尔德纳将演示这个程序。对于细胞种子化到电极阵列上，将适当浓度的细胞添加到每个电极阵列的孔中，并允许细胞在室温下均匀地沉淀到井底上10至15分钟。在37摄氏度和5%二氧化碳的标准细胞培养箱中至少36小时后，通过相对比显微镜检查细胞层，以确保每个电极与细胞完全覆盖。然后用适当体积的预热、无血清培养的培养素替换每井中的细胞培养培养。要启动阻抗记录，请将电极阵列放入阻抗分析仪的连接阵列支架中，并确认电极与阻抗分析仪之间的适当低阻抗接触。在软件的用户界面中选择电极类型和/或多井格式。如果单频和多频数据采集模式可用，且要分析的井数较低或时间分辨率不关键，请选择多频率记录。为确保最大时间分辨率，请选择单个监控频率。然后开始采集时间过程数据，并选择数据文件夹以用于保存数据的位置。阻抗读数将记录在每一个井的指定频率数中，为了在八井阵列的激动器模式下启动串行加法协议，向细胞中添加 30 微升，其对角剂的最低浓度。然后让细胞在预定义的时间内响应和平衡，然后添加下一个最高浓度的30微升，直到添加激动剂的每个连续稀释。要分析数据，请减去第一次添加激动剂解之前最后一个数据点的阻抗，并设置添加零的时间以规范化阻抗值。绘制规范化阻抗的时间过程，并绘制各个时间路线，以在每次添加步骤后确定阻抗中的最大值。用这些值组成数据表，并绘制最大阻抗变化的值作为激动剂浓度的函数。然后使用数据拟合例程使用四参数物流模型确定半最大值的有效浓度和最大响应。在这个具有代表性的实验中，每15分钟连续向细胞中添加10个组胺浓度增加的溶液，并在每个时间点测量阻抗的变化。阻抗变化可以绘制为组胺浓度的函数和拟合在七孔实验数据点的四参数物流模型的转移函数。为了考虑可能组胺受体下调节、细胞脱敏或过度刺激，可以减少分析的数据范围，如此单序列量分试验所示。然后，三参数优化可应用于数据，为此分析提供 0.75 正负 0.12 微摩尔的半最大值有效浓度。在第一组胺前20分钟添加组胺受体拮抗二苯胺会导致序列配药方案内阻抗延迟增加，从而需要更高的激动剂来引起细胞反应。在剂量反应关系中，对手的作用表示为曲线的右移，对应于半最大值有效浓度的增加，前提是拮抗剂是相对于对手的竞争配体。成功应用串行配分方案在技术上很容易，但需要周密的规划，因为要正确计时执行所有步骤是具有挑战性的。串行给给为使用其他读出系统进行浓度响应研究铺平了道路，这些读出系统对并行监测的样品数量有限。串行给药的特殊优势允许研究受体调节的信号转导与全新的读数，是敏感的其他表型变化，如细胞力学。在准备受体激动剂的库存溶液时，请戴上手套和护目镜，因为它们在吸入或吞咽时可能很危险。

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