Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Vi takker Barbara Goricnick og Nadja Hinterreiter for deres hjælp med celledyrkning og forberedelse af eksperimentelle løsninger. Forfatterne anerkender taknemmeligt økonomisk støtte fra Research Training Group 1910 "Medicinsk kemi selektivgpcr ligands" finansieret af Den Tyske Forskningsfond (DFG) under tilskudnummer 222125149. JAS er især taknemmelig for et stipendium ydet af den bayerske ligestilling program.

1. Cellesåning på elektrode arrays
BEMÆRK: Udvælgelse af elektrodelayout er en afvejning mellem følsomhed og antallet af undersøgte celler. Jo mindre elektroden er, jo mere følsom er målingen, men jo mindre er antallet af undersøgte celler. For celler, der viser stærke impedansudsving over tid under baseline betingelser, større eller interdigiterede elektroder er at foretrække.
<ol><li>Forvarm alle løsninger, der er nødvendige for standardcellegangs- og såning i et 37 °C vand...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Denne protokol beskriver en metode til etiketfri impedansmålinger for at bestemme forholdet mellem dosis og respons for agonist-induceret GPCR-aktivering i fravær eller tilstedeværelse af specifikke antagonister for den samme receptor. Beviset for denne metode blev fremlagt i en nylig publikation12. Så vidt vi ved, er det den første undersøgelse, der beskriver etableringen af en fuld dosis-respons kurve af agonist-medieret GPCR aktivering ved hjælp af en enkelt celle lag in vitro. Tilgangen...

Denne rapport indeholder en detaljeret beskrivelse af en seriel tilføjelse protokol udviklet til kvantificering af ligand-induceret G protein-koblet receptor (GPCR) aktivering i tilhængere spirende dyrkede celler ved label-fri impedans målinger. G protein-koblede receptorer (GPCRs) er involveret i et væld af fysiologiske funktioner og sygdomme hos mennesker1. På grund af dette og deres gode tilgængelighed på celleoverfladen er GPCR'er et af de vigtigste narkotikamål. Denne vurdering afspejles i et anslået antal ~700 godkendte lægemidler rettet mod GPCR,svarende til en andel på ~35 % på alle markedsførte lægemidler2.
Udviklingen af nye lægemidler omfatter to centrale processer: i) identifikation og funktionel karakterisering af biologiske målmolekyler og ii) opdagelsen af nye blystoffer og deres udvikling i administrative lægemidler. I begge processer er der behov for effektive metoder til kvantitativt at evaluere lægemiddelmålinteraktioner og den efterfølgende biologiske downstream-respons. Forskellige stadier i den prækliniske lægemiddeludviklingsproces gør brug af forskellige analysemetoder lige fra biomolekylære interaktionsundersøgelser mellem lægemiddel- og mål, over funktionelle undersøgelser af celler i kultur, til forsøg med punktafgifter på organmateriale eller hele dyr. Både fysiologisk betydning og biologisk kompleksitet stige fra førstnævnte til sidstnævnte3. Selv om det er det overordnede mål at minimere dyreforsøg, farmakologiske undersøgelser ved hjælp af isolerede organer fra laboratoriedyr eller endda hele dyr anses for at være uundgåelige til omfattende karakterisere nye lægemiddelkandidater. Med hensyn til analytisk udlæsning giver organfarmakologiundersøgelser en distalt, integrativ "holistisk" funktionel respons af højeste fysiologiske relevans. En ulempe ved sådanne forsøg er , at de ikke er forenelige med høj gennemløbsscreening af tekniske såvel som etiske årsager og i vid udstrækning er blevet erstattet af undersøgelser baseret på in vitrocellekultur4.
Metoder til at kvantificere GPCR aktivering i cellekulturer omfatter forskellige etiket-baserede kemiske analyser, som specifikt påvise sekunder budbringere, fosforylering tilstand nedstrøms signalering proteiner, transskriptionelle aktivering via visse transskription faktorer eller ligand-induceret intracellulære receptor handel4,5. En ulempe ved sådanne etiketbaserede analyser er nødvendigheden af at mærke cellerne med potentielt skadelige farvestoffer eller radioaktive markører. Dette kræver ofte at køre analysen som en slutpunkt-bestemmelse for en eksponeringstid, der skal specificeres a priori. Brug af etiketbaserede endepunktsanalyser lider under denne meget begrænsede og forudindtagede timing af forsøget og risikoen for, at kemiske etiketter og sonder kan forstyrre den almindelige cellefysiologi – potentielt ubemærket af eksperimentatoren.
I de seneste år, label-fri analyser til overvågning GPCR aktivering er opstået, ligesom impedans-baserede teknikker eller optiske metoder, der anvender resonant waveguide riste5,6. Mærkning af cellerne er eksperimentelt ikke påkrævet med disse tilgange. Da disse fysiske udlæsninger opererer på lav amplitude signaler, sådanne metoder betragtes som ikke-invasive, de giver mulighed for kontinuerlig celleovervågning potentielt i realtid, og observationstiden er kun begrænset af cellekulturen ikke af udlæsningen. Svarende til udlæsninger fra hele organer, label-fri tilgange ofte rapport om holistiskcellereaktioner, langt nedstrøms for receptor aktivering, når integration langs hele signalnetværket fører til tidsafhængige, men snarere uspecifikke ændringer i celle morfologi eller masse omfordeling. Mens impedansbaserede analyser måler den dielektriske signatur af ændringer i celleform7,8, er målinger ved hjælp af resonantbølgeføringsriste følsomme over for ændringer i brydningsindeks ved cellesubstratgrænsefladen som følge af dynamisk masseomfordeling (DMR)9. Den integrativkarakter gør labelfri metoder ekstremt følsomme over for receptormedierede hændelser uanset typen(e) af G-protein (Gq, Gi/0, Gs,G12/13) eller β-arrestin involveret i receptorens signaleringkaskade 6 og velegnet til receptorens endogene ekspressionsniveauer.
I en standard label-fri impedans-baserede analyse cellerne er konsekvent dyrket i multi-well plader med coplanar guld-film elektroder deponeret på bunden af hver brønd10. Disse elektrode arrays er forbundet til en impedans analysator og celle reaktioner på en eksperimentel stimulus registreres fra individuelle brønde ved tidsløst impedans aflæsninger. I en typisk GPCR analyse en ligand er tilføjet i individuelt forskellige koncentrationer til hver enkelt brønd. De ligand-inducerede ændringer i impedanstidskurset analyseres derefter med hensyn til karakteristiske kurvefunktioner såsom maksimal signalændring, område under kurven, signalændring inden for et givet tidsinterval eller hældning af kurven på et bestemt tidspunkt for at kvantificere ligandens styrke og virkning11.
Omkostningerne ved elektrodearrays kan begrænse anvendelsen af denne teknik i høj gennemløbscreening (HTS) kampagner. Med et stigende antal prøver, der skal følges parallelt, stiger antallet af individuelle målinger desuden og reducerer dermed den tilgængelige tidsopløsning for hver brønd gradvist - selv for state of the art multichannel-optagelser. Under sådanne forhold kan hurtige og forbigående cellereaktioner slippe ud af målingen. Hertil kommer, at den konventionelle en brønd - en koncentration tilgang pålægger en betydelig tid og omkostningsfaktor på perfunderede organ-on-chip eller body-on-chip udvikling med hensyn til deres egnethed i ligand-GPCR interaktion analyse.
Derfor udviklede vi en trinvis doseringsprotokol, der gør det muligt at registrere fuld dosisresponskurver for ligand-induceret GPCR-aktivering i dyrkede cellemonolag ved løbende at overvåge impedansen for en enkelt brønd, mens den agonistiske koncentration øges trinvist. Den seriet agonist tilføjelse protokol øger gennemløb pr godt fra en koncentration til 10 eller flere koncentrationer, som vist på det nuværende eksempel på humane U-373 MG celler, som endogent udtrykke histamin 1 receptor (H1R). Metoden har således potentiale til at forbedre gennemløbet betydeligt i analyser af etiketfri dosisrespons, mens tidsopløsningen bevares på det instrumentale maksimum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

Label-fri impedans-baserede analyser er i stigende grad bruges til ikke-invasivt undersøgelse ligand-induceret GPCR aktivering i cellekultur eksperimenter. Tilgangen giver celleovervågning i realtid med en enhedsafhængig tidsopløsning ned til flere snese millisekunder, og den er meget automatiseret. Men når antallet af prøver bliver høje (f.eks. dosisresponsundersøgelser for forskellige ligander), kan omkostningerne for engangselektrodearrays samt den tilgængelige tidsopløsning for sekventielle brønd-by-well-optagelser blive begrænsende. Derfor præsenterer vi her en seriel agonist tilføjelse protokol, som har potentiale til at øge produktionen af label-fri GPCR assays. Ved hjælp af den serielle agonist tilføjelse protokol, en GPCR agonist er tilføjet sekventielle i stigende koncentrationer til en enkelt celle lag, mens løbende overvågning af prøvens impedans (agonist mode). Med denne serielle tilgang er det nu muligt at etablere en fuld dosisresponskurve for en GPCR-agonist fra blot et enkelt cellelag. Den seriel agonist tilføjelse protokol gælder for forskellige GPCR kobling typer, Gq Gi / 0 eller Gs og det er kompatibel med rekombinant og endogenudtryk niveauer af receptoren under undersøgelsen. Receptor blokering af GPCR antagonister kan vurderes samt (antagonist mode).

En typisk ordning for forberedelse af de forskellige agonistløsninger vises til et eksperiment med 8-brønds elektrodearrays med histamin som agonist i tabel 1-4. Tabel 1 og tabel 2 viser mængder og koncentrationer for et eksperiment ved hjælp af tilsætningstilstand 1 (jf. figur 1), mens tabel 3 og tabel 4 viser mængder og koncentrationer til et forsøg efter tilsætningstilstand <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Denne protokol viser real-time registrering af fuld dosis-respons relationer for agonist-induceret GPCR aktivering fra en enkelt celle lag dyrket på en enkelt mikroelektrode ved hjælp af label-fri impedans målinger. Den nye doseringsordning øger gennemløb betydeligt uden tab i tidsløsning.

Trinvis doseringprotokol for øget overførselstid i label-free impedansbaserede GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Denne protokol gør det muligt at registrere en komplet funktionel koncentration svar forhold af GPCR agonist fra en celle population og giver detaljerede agonist karakterisering selv for lave celle prøve tal. Den største fordel ved seriel dosering er stigningen i gennemløb, da en enkelt brønd er tilstrækkelig til en fuld koncentration respons analyse. Denne teknik er velegnet til at studere enkelt transduktion i sjældne og komplekse biologiske modeller, som organ-on-chip formater i lukkede mikrofluidic beholdere.Protokollen er ikke vanskelig at udføre, forudsat at det relevante udstyr er til rådighed. Forberedelse af de forskellige GPCR ligand løsninger på den rigtige koncentration er nøglen til succes. Michael Skiba, en kandidatstuderende, og Anne Mildner, en bachelorstuderende, fra vores laboratorium vil demonstrere proceduren.For celle såning på elektrode arrays, tilsæt passende koncentration af celler til brøndene i hver elektrode array, og lad cellerne til at bosætte sig homogent på brønden bunde i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur. Efter mindst 36 timer i en standardcellekulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid skal cellelagene inspiceres ved fasekontrastmikroskopi for at sikre en fuldstændig dækning af hver elektrode med celler. Derefter erstattes cellekulturmediet i hver brønd med det passende volumen af forvardt, serumfrit medium.For at starte en impedansoptagelse skal du placere elektrodearrayet i den forbindelsesarrayanalysator, der forbinder array, og bekræfte en korrekt kontakt med lav impedans mellem elektroderne og impedansanalysatoren. Vælg elektrodetypen og/eller multi-well-formatet i softwarens brugergrænseflade. Hvis der findes en og flere typer dataindsamlingstilstande, og antallet af brønde, der skal analyseres, er lavt, eller tidsopløsningen ikke er kritisk, skal du vælge flere frekvensoptagelser.Vælg en enkelt overvågningsfrekvens for at sikre en maksimal tidsopløsning. Start derefter anskaffelsen af tidsforløbsdataene, og vælg datamappen, hvor dataene skal gemmes. Impedansaflæsningerne vil blive registreret ved det angivne antal frekvenser for hver brønd For at starte den serielle tilføjelsesprotokol i agonisttilstanden for en otte-brønds array, skal du tilføje 30 mikroliter af den laveste koncentration af den agonist af interesse for cellerne.Lad derefter cellerne reagere og ligevægt i den foruddefinerede periode, før der tilsættes 30 mikroliter af den næsthøjeste koncentration, indtil hver seriefortynding af agonisten er blevet tilføjet. Hvis du vil analysere dataene, skal du trække impedansen af det sidste datapunkt før den første tilføjelse af agonistløsning og indstille tidspunktet for tilføjelsen af nul for at normalisere impedansværdierne. Plot tidsforløbet for normaliseret impedans, og plot de enkelte tidskurser for at identificere maksime i impedans efter hvert tilføjelsestrin.Skriv et dataark med disse værdier, og afbilde værdierne for den maksimale impedansændring som en funktion af den agonistiske koncentration. Brug derefter en data-montering rutine til at bestemme den halve maksimale effektive koncentrationer og maksimal respons ved hjælp af fire-parameter logistik model. I dette repræsentative eksperiment blev 10 opløsninger med stigende histaminkoncentrationer fortløbende føjet til cellerne hvert 15.Impedansændringerne kunne derefter afbildes som en funktion af histaminkoncentrationen, og overførselsfunktionen for en fire-parameter logistisk model, der er monteret på de eksperimentelle datapunkter fra syv brønde. For at tage højde for mulig histaminreceptornedregulering, celledesibilisering eller overstimulering kan dataområdet for analysen reduceres, som vist for dette enkeltseriedseforsøg. Optimering af tre parametre kan derefter anvendes på dataene, hvilket giver en halvmaksimel effektiv koncentration på 0,75 plus eller minus 0,12 mikromolar til denne analyse.Tilføjelsen af histamin receptor antagonist diphenhydramin 20 minutter før den første histamin resulterer i en forsinket stigning i impedans inden for den serielle dosing ordningen, svarende til behovet for en højere agonist at fremkalde en celle respons. I forholdet mellem dosisrespons udtrykkes antagonistens virkning som en højreadgående forskydning af kurverne, svarende til en stigning i halvmaksimal effektiv koncentration, forudsat at antagonisten er en konkurrencedygtig ligand i forhold til agonisten. Vellykket anvendelse af den serielle dosing ordningen er teknisk let, men kræver tankevækkende planlægning, da det er udfordrende at udføre alle de trin med den korrekte timing.Seriel dosering har banet vejen for at udføre koncentrationsresponsundersøgelser med andre udlæsningssystemer, der er begrænsede med hensyn til antallet af prøver, der overvåges parallelt. De særlige fordele ved seriel dosing tillader undersøgelse af receptor-medieret signal transduktion med helt nye udlæsninger, der er følsomme over for andre fænocypiciske ændringer, ligesom cytomechanics. Bær handsker og beskyttelsesbriller, når du tilbereder beholderens lageropløsninger, da de kan være farlige ved indånding eller indtagelse.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro-allestedsnærværende og Deubiquitinationassays af Nukleosomale histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Overvågning af GPCR-β-arrestin1/2 interaktioner i realtid levende systemer til at fremskynde Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunoprecipitation massespektrometri workflow for storstilet nuklear Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

En hurtigt forøget Tethered-Svømning Maximal protokol for cardiorespiratory vurdering af svømmere

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering af Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel forhør af β-Arrestin2 Rekruttering til Ligand Screening på en GPCR-wide Scale ved hjælp af PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In vitro Karakterisering af histon chaperoner ved hjælp af analytiske, pull-down og chaperoning assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...