Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Wij danken Barbara Goricnick en Nadja Hinterreiter voor hun hulp bij het kweken van cellen en het voorbereiden van experimentele oplossingen. De auteurs erkennen dankbaar financiële steun van de Research Training Group 1910 "Medicinale chemie van selectieve GPCR ligands" gefinancierd door de Duitse Research Foundation (DFG) onder subsidienummer 222125149. JAS is vooral dankbaar voor een beurs toegekend door de Beierse Gender Equality Program.

1. Celzaaien op elektrodearrays
OPMERKING: Selectie van elektrode lay-out is een afweging tussen gevoeligheid en het aantal cellen in studie. Hoe kleiner de elektrode, hoe gevoeliger is de meting, maar hoe kleiner het aantal cellen dat wordt onderzocht. Voor cellen die in de loop van de tijd sterke impedantieschommelingen vertonen onder basisomstandigheden, hebben grotere of onderling gedigitaliseerde elektroden de voorkeur.
<ol><li>Verwarm alle oplossingen die nodig zijn voor standaard celp...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een methode voor labelvrije impedantiemetingen om de dosisresponsrelatie van agonist-geïnduceerde GPCR-activering te bepalen bij afwezigheid of aanwezigheid van specifieke antagonisten voor dezelfde receptor. Het proof of concept van deze methode werd gepresenteerd in een recente publicatie12. Voor zover wij weten is het de eerste studie die de oprichting beschrijft van een volledige dosisresponscurve van agonist-gemedieerde GPCR-activering met behulp van een eencellige la...

Dit rapport presenteert een gedetailleerde beschrijving van een seriële toevoeging protocol ontwikkeld voor de kwantificering van ligand-geïnduceerde G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) activering in aanhangende cellen door label-vrije impedantie metingen. G eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) zijn betrokken bij een veelheid van fysiologische functies en menselijke ziekten1. Vanwege deze en hun goede toegankelijkheid aan het celoppervlak, GPCRs zijn een van de belangrijkste drug doelen. Deze beoordeling wordt weerspiegeld in een geschat aantal ~ 700 goedgekeurde geneesmiddelen gericht op GPCRs, gelijk aan een ~ 35% aandeel op alle op de markt gebrachte drugs2.
De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen omvat twee centrale processen: i) de identificatie en functionele karakterisering van biologische doelmoleculen, en (ii) de ontdekking van nieuwe loodstoffen en hun ontwikkeling tot administrable drugs. In beide processen zijn efficiënte methoden nodig om interacties met drugsengerichtheid en de daaropvolgende biologische downstreamrespons kwantitatief te evalueren. Verschillende stadia van het preklinische geneesmiddelenontwikkelingsproces maken gebruik van verschillende analysemethoden, variërend van biomoleculaire interactiestudies tussen medicijn en doel, over functionele studies over cellen in de cultuur, tot experimenten op uitgesneden orgaanmateriaal of hele dieren. Beide fysiologische betekenis en biologische complexiteit nemen toe van de eerste naar de laatste3. Hoewel het het algemene doel is om dierproeven te minimaliseren, worden farmacologische studies met behulp van geïsoleerde organen van proefdieren of zelfs hele dieren onvermijdelijk geacht om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen volledig te karakteriseren. In termen van analytische uitlezing, orgaan farmacologie studies bieden een distale, integratieve "holistische" functionele respons van de hoogste fysiologische relevantie. Een nadeel van dergelijke experimenten is dat zij om zowel technische als ethische redenen niet verenigbaar zijn met een hoge doorvoerscreening en grotendeels zijn vervangen door studies op basis van in vitro celcultuur4.
Methoden om gpcr-activering in celculturen te kwantificeren, omvatten verschillende op etiketten gebaseerde chemische tests, die specifiek tweede boodschappers detecteren, fosforylatietoestand van downstream-signaaleiwitten, transcriptieactivering via bepaalde transcriptiefactoren of ligand-geïnduceerde intracellulaire receptorhandel4,5. Een nadeel van dergelijke op etiketten gebaseerde tests is de noodzaak om de cellen te etiketteren met mogelijk schadelijke kleurstoffen of radioactieve markers. Dit vereist vaak het uitvoeren van de test als een eindpunt-bepaling voor een blootstelling stijd die moet worden opgegeven a priori. Met behulp van label-gebaseerde eindpunt testen lijdt aan deze zeer beperkte en bevooroordeelde timing van het experiment en het risico dat chemische etiketten en sondes kunnen interfereren met de reguliere celfysiologie - potentieel onopgemerkt door de experimentator.
In de afgelopen jaren zijn labelvrije tests voor het monitoren van GPCR-activatie naar voren gekomen, zoals impedantiegebaseerde technieken of optische methoden die resonante waveguide roosters toepassen5,6. Etikettering van de cellen is experimenteel niet nodig met deze benaderingen. Aangezien deze fysieke uitlezingen werken op lage amplitude signalen, dergelijke methoden worden beschouwd als niet-invasief, ze zorgen voor continue cel monitoring potentieel in real time en de observatie tijd wordt alleen beperkt door de celcultuur niet door de uitlezing. Vergelijkbaar met uitlezingen van hele organen, label-vrije benaderingen vaak verslag over holistische celreacties, ver stroomafwaarts van receptor activering wanneer de integratie langs het hele signaleringsnetwerk leidt tot tijd-afhankelijke, maar eerder onspecifieke veranderingen in celmorfologie of massa herverdeling. Overwegende dat op impedantie gebaseerde tests de diëlektrische signatuur van veranderingen in celvorm7,8meten , metingen met behulp van resonerende golfgeleidingsroosters gevoelig zijn voor veranderingen in de brekingsindex op de celsubstraatinterface als gevolg van dynamische massaherverdeling (DMR)9. Het integrerende karakter maakt labelvrije methoden uiterst gevoelig voor receptorgemedieerde gebeurtenissen, ongeacht het type(en) van G-eiwit (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) of β-arrestine die betrokken zijn bij de signaleringcascade6 en goed geschikt voor eneexpressieniveaus van de receptor.
In een standaard label-vrije impedantie-gebaseerde test de cellen zijn adherently geteeld in multi-well platen met coplanar goud-film elektroden afgezet op de bodem van elke put10. Deze elektrodearrays zijn verbonden met een impedantieanalyzer en de celreacties op een experimentele stimulus worden geregistreerd vanuit individuele putten door door de tijd opgeloste impedantiemetingen. In een typische GPCR-test wordt een ligand toegevoegd in individueel verschillende concentraties aan elk individu goed. De ligand-geïnduceerde veranderingen in de impedantie tijdcursus worden vervolgens geanalyseerd met betrekking tot karakteristieke curvekenmerken zoals maximale signaalverandering, gebied onder de curve, signaalverandering binnen een bepaald tijdsinterval of helling van de curve op een bepaald tijdspunt, om de potentie en werkzaamheid van de ligand te kwantificeren11.
De kosten van de elektrodearrays kunnen de toepassing van deze techniek beperken in HTS-campagnes (high throughput screening). Bovendien neemt het aantal afzonderlijke metingen toe en vermindert daarmee geleidelijk de beschikbare tijdsresolutie voor elke put - zelfs voor state-of-the-art meerkanaalsopnamen. Onder dergelijke omstandigheden kunnen snelle en voorbijgaande celreacties aan de meting ontsnappen. Bovendien, de conventionele een goed - een concentratie benadering legt een aanzienlijke tijd en kostenfactor op perfused organ-on-chip of body-on-chip ontwikkelingen met betrekking tot hun geschiktheid in ligand-GPCR interactie analyse.
Om deze reden ontwikkelden we een stapsgewijs doseringsprotocol dat het registreren van volledige dosisresponscurven van ligand-geïnduceerde GPCR-activering in gekweekte celmonolagen mogelijk maakt door de impedantie van één enkele put continu te monitoren, terwijl de agonistconcentratie stapsgewijs wordt verhoogd. Het seriële agonist toevoegingsprotocol verhoogt de doorvoer per put aanzienlijk van één concentratie naar 10 of meer concentraties, zoals blijkt uit het huidige voorbeeld van menselijke U-373 MG-cellen, die de histamine 1-receptor (H1R) endoopeerig uitdrukken. Zo heeft de methode het potentieel om de doorvoer in labelvrije dosisresponsstudies aanzienlijk te verbeteren, terwijl de tijdsresolutie op het instrumentele maximum wordt gehandhaafd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

Label-vrije impedantie-gebaseerde testen worden steeds vaker gebruikt om niet-invasief bestuderen ligand-geïnduceerde GPCR activering in celcultuur experimenten. De aanpak biedt real-time celbewaking met een apparaatafhankelijke tijdsresolutie tot enkele tientallen milliseconden en is sterk geautomatiseerd. Wanneer de steekproefaantallen echter hoog worden (bijvoorbeeld dosisresponsstudies voor verschillende liganden), kunnen de kosten voor de beschikbare elektrodearrays en de beschikbare tijdsresolutie voor sequentiële well-by-well-opnames beperkend worden. Daarom presenteren we hier een seriële agonist toevoeging protocol dat het potentieel heeft om de output van label-vrije GPCR testen aanzienlijk te verhogen. Met behulp van de seriële agonist toevoeging protocol, een GPCR agonist wordt achtereenvolgens toegevoegd in toenemende concentraties tot een enkele cel laag, terwijl voortdurend toezicht op impedantie van het monster (agonist modus). Met deze seriële aanpak is het nu mogelijk om een volledige dosis-responscurve vast te stellen voor een GPCR-agonist uit slechts één enkele cellaag. Het seriële agonist toevoegingsprotocol is van toepassing op verschillende GPCR-koppelingstypen, Gq Gi/0 of Gs en is compatibel met recombinante en endogene expressieniveaus van de onderzochte receptor. Receptor blokkeren door GPCR antagonisten is ook te beoordelen (antagonist-modus).

Een typisch schema voor de voorbereiding van de verschillende agonist oplossingen wordt getoond voor een experiment met behulp van 8-goed elektrode arrays met histamine als agonist in tabellen 1-4. Tabel 1 en tabel 2 bevatten volumes en concentraties voor een experiment met toevoegingsmodus 1 (zie figuur 1),terwijl tabel 3 en tabel 4 volumes en concentraties presenteren voor een experiment n...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Dit protocol toont real-time registratie van volledige dosis-respons relaties voor agonist-geïnduceerde GPCR activering van een eencellige laag geteeld op een enkele micro-elektrode met behulp van label-vrije impedantie metingen. De nieuwe dosing regeling verhoogt aanzienlijk doorvoer zonder verlies in de tijd resolutie.

Stepwise Dosing Protocol voor verhoogde doorvoer in label-vrije impedance-based GPCR-tests

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Dit protocol maakt het mogelijk om een volledige functionele concentratieresponsrelatie van GPCR-agonist uit één celpopulatie op te nemen en biedt gedetailleerde agonistische karakterisering, zelfs voor lage celmonsternummers. Het belangrijkste voordeel van seriële dosering is de toename van de doorvoer, omdat een enkele put voldoende is voor een volledige concentratieresponsanalyse. Deze techniek is zeer geschikt om enkele transductie te bestuderen in zeldzame en complexe biologische modellen, zoals organ-on-chip formaten in gesloten microfluidic containers.Het protocol is niet moeilijk uit te voeren, mits de juiste apparatuur beschikbaar is. Het voorbereiden van de verschillende GPCR ligand oplossingen op de juiste concentratie is de sleutel tot succes. Michael Skiba, een afgestudeerde student, en Anne Mildner, een student, van ons laboratorium zal de procedure aan te tonen.Voor celzaaien op de elektrode arrays, voeg de juiste concentratie van cellen aan de putten van elke elektrode array, en laat de cellen homogeen te vestigen op de put bodems gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Na ten minste 36 uur in een standaard celkweek incubator op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, inspecteer de cellagen door fase-contrast microscopie om een volledige dekking van elke elektrode met cellen te garanderen. Vervang vervolgens het celkweekmedium in elke put door het juiste volume van voorverwarmd, serumvrij medium.Om een impedantieopname te starten, plaatst u de elektrodearray in de verbindingsarrayhouder van de impedantieanalyzer en bevestigt u een goed contact met lage impedantie tussen de elektroden en de impedantieanalyzer. Selecteer het elektrodetype en/of multi-well formaat in de gebruikersinterface van de software. Als er één- en meervoudige frequentie gegevensverwervingsmodi beschikbaar zijn en het aantal te analyseren putten laag is of de tijdresolutie niet van cruciaal belang is, selecteert u meerdere frequentieopnamen.Als u een maximale tijdsresolutie wilt garanderen, selecteert u één bewakingsfrequentie. Begin vervolgens met het verzamelen van de tijdscursusgegevens en selecteer de gegevensmap voor waar u de gegevens opslaan. De impedantiemetingen worden geregistreerd op het opgegeven aantal frequenties voor elke put Om het serie-toevoegingprotocol in de agonistische modus voor een acht-well array te starten, voeg 30 microliters van de laagste concentratie van de agonist van belang toe aan de cellen.Laat de cellen vervolgens reageren en equilibrate voor de vooraf bepaalde periode voordat u 30 microliter van de op een na hoogste concentratie toevoegt totdat elke seriële verdunning van de agonist is toegevoegd. Als u de gegevens wilt analyseren, trekt u de impedantie van het laatste gegevenspunt vóór de eerste toevoeging van agonistische oplossing af en stelt u de tijd van bijtellingsn nul in om de impedantiewaarden te normaliseren. Plot de tijdsloop van genormaliseerde impedantie en plot de individuele tijdcursussen om de maxima in impedantie na elke toevoegingsstap te identificeren.Stel een gegevensblad samen met deze waarden en plot de waarden van maximale impedantieverandering als functie van de agonistische concentratie. Gebruik vervolgens een data-fitting routine om de half-maximale effectieve concentraties en maximale respons te bepalen met behulp van de vier-parameter logistieke model. In dit representatieve experiment werden 10 oplossingen met toenemende histamineconcentraties om de 15 minuten achtereenvolgens aan de cellen toegevoegd en werd de verandering in impedantie op elk moment gemeten.De impedantieveranderingen kunnen dan worden uitgezet als functie van de histamineconcentratie en de overdrachtsfunctie van een logistiek model met vier parameters dat is gemonteerd op de experimentele gegevenspunten uit zeven putten. Om rekening te houden met mogelijke histamine receptor downregulation, cel desensibilisatie, of overstimulatie, kan het gegevensbereik voor de analyse worden verminderd, zoals getoond voor dit enkele seriële doseren experiment. Optimalisatie met drie parameters kan vervolgens worden toegepast op de gegevens, wat een half-maximale effectieve concentratie van 0,75 plus of min 0,12 micromolar biedt voor deze analyse.De toevoeging van de histamine receptor antagonistische difenhydramine 20 minuten voor de eerste histamine resulteert in een vertraagde toename van impedantie binnen de seriële dosering regeling, wat overeenkomt met de noodzaak van een hogere agonist om een celrespons uit te lokken. In de dosisresponsrelatie wordt het effect van de antagonist uitgedrukt als een rechtse verschuiving van de krommen, wat overeenkomt met een toename van de half-maximale effectieve concentratie, mits de antagonist een concurrerende ligand is ten opzichte van de agonist. Succesvolle toepassing van de seriële doseerschema is technisch eenvoudig, maar vereist doordachte planning, omdat het een uitdaging is om alle stappen met de juiste timing uit te voeren.Seriële doseren heeft de weg vrijgemaakt voor het uitvoeren van concentratieresponsstudies met andere uitleessystemen die beperkt zijn met betrekking tot het aantal parallel gevolgde monsters. De bijzondere voordelen van seriële doseren maken de studie van receptor-gemedieerde signaaltransductie mogelijk met volledig nieuwe uitlezingen die gevoelig zijn voor andere fenotypische veranderingen, zoals cytomechanica. Draag handschoenen en veiligheidsbrillen bij het voorbereiden van de voorraadoplossingen van de receptoradester, omdat ze gevaarlijk kunnen zijn bij inademing of ingeslikt.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Een snel verhoogd tethered-swimming maximum protocol voor cardiorespiratoire beoordeling van zwemmers

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In vitro Karakterisering van Histone Chaperones met behulp van Analytische, Pull-Down en Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...