Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

אנו מודים לברברה Goricnick ו-Nadja Hinterreiter על עזרתם בהכנת תאים והכנת פתרונות ניסיוניים. המחברים מכירים בהכרת תודה את התמיכה הפיננסית של קבוצת ההדרכה למחקר 1910 "כימיה מרפא של בררני GPCR ליגנדס" הממומן על ידי קרן המחקר הגרמני (DFG) תחת מספר 222125149. JAS מודה במיוחד על מלגה שניתנה על ידי תוכנית השוויון המגדרית הבווארית.

1. שזריעת תאים במערכים אלקטרודה
הערה: בחירת פריסת האלקטרודה היא החלפה בין רגישות לבין מספר התאים בלמידה. ככל שאלקטרודה קטנה יותר, המדידה רגישה יותר, אך קטנה יותר היא מספר התאים הנמצאים במחקר. עבור תאים המראים תנודות עכבה חזקות לאורך זמן בתנאים בסיסיים, מעדיפים אלקטרודות גדולו...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור מדידות עכבה ללא תווית כדי לקבוע את הקשר המינון-תגובה של agonist המושרה הפעלת GPCR בהעדר או נוכחות של יריבים ספציפיים לאותו קולטן. הוכחת המושג של שיטה זו הוצגה בפרסום האחרון12. לידיעתנו שלנו הוא המחקר הראשון המתאר את הקמתה של עקומת מינון מלא-תגובה של אגוניס?...

דו ח זה מציג תיאור מפורט של פרוטוקול התוספת הטורית שפותחה עבור כימות החלבון המושרה G-חלבונים בשילוב קולטן (GPCR) הפעלה בתאים מגודלים על ידי תווית ללא מדידות עכבה. מצמידים בחלבון G (GPCRs) מעורבים בהמון תפקודים פיזיולוגיים ומחלות אנושיות1. בגלל זה והנגישות הטובה שלהם במשטח התאים, GPCRs הן אחת ממטרות הסמים החשובות ביותר. הערכה זו משתקפת במספר מוערך של ~ 700 תרופות שאושרו על-ידי GPCRs, שוות ערך ל-~ 35% שיתוף בכל התרופות המשווקים2.
התפתחות התרופות החדשות כוללת שני תהליכים מרכזיים: (i) האפיון ההזדהות והפונקציונלי של מולקולות היעד הביולוגי ו-(ii) גילוי של חומרי הובלה חדשים והתפתחותם לתרופות בניהול. בשני התהליכים, נדרשות שיטות יעילות כדי להעריך את האינטראקציות של מטרות הסמים ואת תגובת המטה הביולוגית הבאה. בשלבים שונים של תהליך פיתוח תרופות טרום-קליני לעשות שימוש בשיטות ניתוח שונות החל ממחקרים ביוקולריות האינטראקציה בין התרופה והיעד, על פני מחקרים פונקציונליים על תאים בתרבות, לניסויים על חומר האיבר המגורש או בעלי חיים שלמים. הן, המשמעות הפיזיולוגית והמורכבות הביולוגית, מגדילות מהראשון ל-3האחרון. למרות שזו המטרה הכוללת למזער ניסויים בבעלי חיים, מחקרים פרמקולוגיים המשתמשים באברים מבודדים מבעלי חיים מעבדתיים או אפילו בעלי חיים שלמים נחשבים בלתי נמנעים למאפיינים מקיפים של מועמדים חדשים לסמים. במונחים של הבדיקה האנליטית, לימודי האיברים הפרמקולוגיה מספקים תגובה פונקציונלית מההוליסטית ואינטגרטיבית של הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר. חיסרון של ניסויים כאלה הוא שהם לא תואמים הקרנת תפוקה גבוהה עבור טכני, כמו גם סיבות אתיות כבר הוחלף ברובו על ידי מחקרים המבוססים על התרבות תא מבחנה4.
שיטות כדי לכמת gpcr הפעלה בתרבויות תאים כוללים שונים מבוססי תוויות כימיים assays, אשר במפורש לזהות שליחים השני, המדינה זרחון במורד החלבונים איתות, הפעלת הפעלה דרך גורמים שעתוק מסוימים או ליגקין המושרה סחר הקולטן תאיים4,5. החיסרון של התווית המבוססת על תוויות הוא הצורך לתייג את התאים עם צבעים שעלולים להזיק או סמנים רדיואקטיביים. זה דורש לעיתים קרובות להפעיל את התשובה כקביעת נקודת קצה-הגדרה לזמן חשיפה שיש לציין א פריורי. שימוש בנקודת קצה מבוססת תווית סובל מתזמון מאוד מצומצם ומוטה של הניסוי והסיכון שתוויות כימיות והבדיקות עלולות לשבש את הפיזיולוגיה של התא הרגיל – שעלולים להבחין בידי הניסוי.
בשנים האחרונות, לייבל ללא תווית עבור ניטור gpcr הפעלה התפתחה, כמו מבוססי עכבה טכניקות או שיטות אופטיות החלת מדריך גלהתהודההדרכה 5,6. התוויות של התאים הינם ניסויים שאינם נדרשים בגישות אלה. כמו אלה הקריאות הפיזיות לפעול על אותות משרעת נמוכה, שיטות כאלה נחשבות לא פולשנית, הם מאפשרים ניטור תאים רציף פוטנציאלי בזמן אמת וזמן התצפית מוגבל רק על ידי תרבות התא לא על ידי הבדיקה. בדומה לקריאות מאיברים שלמים, גישות ללא תווית בדרך כלל לדווח על תגובות התא הוליסטי , במורד הזרם של הפעלת הקולטן כאשר אינטגרציה לאורך כל רשת איתות מוביל לשינויים תלויי זמן אך לא ספציפיים במבנה התא או הפצה המוניים. בעוד מבוסס עכבה מבוססת למדוד את החתימה מדידות של שינויים בצורה תא7,8, מדידות באמצעות מדריך גל התהודה המדורגים רגישים לשינויים במדד השבירה בממשק התא-מצע הנובע מפצה דינמית המסה (dmr)9. התו האינטגרטיבי הופך שיטות ללא תוויות רגישות מאוד לאירועים בתיווך הקולטן ללא קשר לסוג (s) של G חלבון (Gq, gi/0, gs, g12/13) או β-מעורב בדירוג איתות6 ומתאים היטב לרמות ביטוי אנדוגני של הקולטן.
בתוך שיטת העכבה הסטנדרטית ללא תווית, התאים גדלים בגדול בצלחות מרובות-היטב עם אלקטרודות לסרט זהב ישור שהופקדו בתחתית כל באר10. אלה מערכי אלקטרודה מחוברים מנתח עכבה ואת התגובות התאים לגירוי ניסיוני נרשמים מבארות בודדות על ידי קריאות העכבה שנפתרו זמן. ב שיטת GPCR טיפוסית ליגונה מתווסף ריכוזים שונים בנפרד לכל אדם היטב. השינויים המושרה בקורס לאחר העכבה מנותח לאחר מכן ביחס לתכונות עקומות אופייני כגון שינוי האות המקסימלי, שטח תחת עיקול, שינוי האות בתוך מרווח זמן נתון או מדרון של עקומת בנקודת זמן מוגדר, על מנת לכמת את העוצמה של ligand יעילות11.
עלות מערכי האלקטרודה עשויה להגביל את היישום של טכניקה זו בקמפיינים של הקרנת תפוקה גבוהה (hts). יתר על כן, עם מספר גדל והולך של דגימות להיות במקביל, המספר של מדידות בודדות עולה ובכך מפחית את רזולוציית הזמן הזמין עבור כל היטב בהדרגה-אפילו עבור הקלטות רב ערוצי האמנות. תחת תנאים כאלה מהיר התגובות התא ארעי עשוי לברוח מדידה. בנוסף, המקובל אחד היתרונות – גישה ריכוז אחת מטיל משמעות משמעותית הזמן והעלות על מעשה הגוף על שבב או על שבבים התפתחויות על שבב ביחס להתאמה שלהם בניתוח האינטראקציה LIGAND-gpcr.
מסיבה זו, פיתחנו פרוטוקול מינון חורג המאפשר הקלטה של מינון מלאה-תגובה עקומות של הפעלה GPCR המושרה של ליגיום בתוך מונאולאיירס תא תרבותי על ידי ברציפות ניטור עכבה של באר אחת בעוד ריכוז אגוניסט הוא מוגבר צעד. פרוטוקול התוספת של האגוניסט הטורי מגביר באופן משמעותי את התפוקה לכל היותר מריכוז אחד ועד 10 ריכוזים או יותר, כפי שמוצג בדוגמה הנוכחית של התאים האנושיים U-373 MG, אשר מבטאים באופן מובהק את הקולטן להיסטמין 1 (H1R). לפיכך, לשיטה יש פוטנציאל לשפר באופן משמעותי את התפוקה במחקרים של מינון ללא תווית, בעוד שרזולוציית הזמן נשמרת במקסימום האינסטרומנטלי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

מבוסס על תווית חינם מבוססי בחני משמשים יותר ויותר לפני באופן פולשני ליגולי מחקר המושרה gpcr בניסויים בתרבות התא. הגישה מספקת ניטור התא בזמן אמת עם רזולוציית הזמן תלויי התקן עד כמה עשרות אלפיות הראשונה והוא אוטומטי מאוד. עם זאת, כאשר מספרים לדוגמה לקבל גבוה (כגון, מחקרים מינון עבור ליגניות שונות), את העלות של מערכי האלקטרודה החד, כמו גם את רזולוציית הזמן הזמין עבור הקלטות היטב-by-היטב עשוי להיות מגביל. לכן, אנו כאן הצגת פרוטוקול אגוניסט טורי התוספת אשר יש את הפוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את הפלט של gpcr-התווית חינם. באמצעות פרוטוקול התוספת הטורית אגוניסט, אגוניסט gpcr נוסף ברצף בריכוזים גוברת לשכבת תא אחת ברציפות ניטור העכבה של המדגם (מצב אגוניסט). עם גישה טורית זו, כעת ניתן ליצור עקומת מינון מלא של תגובה עבור אגוניסט gpcr מתוך שכבת תא אחת בלבד. פרוטוקול התוספת הטורית של האגוניסט חל על סוגי צימוד מסוג GPCR שונים, Gq g/0 או g והוא תואם לרמות ביטוי רקומביננטי ואנדוגני של הקולטן תחת המחקר. חסימת הקולטן על ידי האנטוניסטים GPCR הוא הניתן גם (מצב היריב).

ערכה טיפוסית להכנת פתרונות אגוניסט שונים מוצג לניסוי באמצעות 8-היטב מערכי אלקטרודה עם היסטמין כמו אגוניסט בטבלאות 1-4. טבלה 1 ו- table 2 להציג כרכים וריכוזים עבור ניסוי באמצעות מצב חיבור 1 (cf., איור 1), בעוד טבלה 3 וטבלה 4 להציג ...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

פרוטוקול זה מדגים הקלטה בזמן אמת של יחסים מינון-תגובה מלאה עבור agonist-המושרה GPCR הפעלה משכבת תא אחת גדל על מיקרואלקטרודה אחת באמצעות תווית ללא מדידות עכבה. ערכת המינון החדשה מגדילה באופן משמעותי את התפוקה ללא הפסד ברזולוציית הזמן.

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

פרוטוקול זה מאפשר הקלטה של קשר תגובת ריכוז תפקודי מלא של אגוניסט GPCR מאוכלוסיית תא אחד ומספק אפיון ייסורים מפורט אפילו עבור מספרי דגימה של תאים נמוכים. היתרון העיקרי של מנון סדרתי הוא העלייה בתפוקה שכן באר אחת מספיקה לניתוח תגובת ריכוז מלא. טכניקה זו מתאימה היטב לחקר התברואה יחידה במודלים ביולוגיים נדירים ומורכבים, כמו פורמטים של איברים על שבב במיכלים מיקרופלואידיים סגורים.הפרוטוקול אינו קשה לביצוע, בתנאי שהציוד המתאים זמין. הכנת פתרונות הליגנד השונים של GPCR בריכוז הנכון היא המפתח להצלחה. מייקל סקיבה, סטודנט לתואר שני, ואן מילדנר, סטודנטית לתואר ראשון, מהמעבדה שלנו ידגימו את ההליך.עבור זריעת תאים על מערכי האלקטרודה, הוסף את הריכוז המתאים של תאים ל הבארות של כל מערך אלקטרודה, ולאפשר לתאים להתיישב הומוגנית על תחתיות הבאר במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר לפחות 36 שעות באינקובטור סטנדרטי לתרבות תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, בדקו את שכבות התא לפי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבטיח כיסוי מלא של כל אלקטרודה עם תאים. לאחר מכן החליפו את מדיום תרבות התאים בכל באר בנפח המתאים של מדיום מחומם מראש, נטול סרום.כדי להתחיל הקלטת מבוי סולדנס, מקם את מערך האלקטרודה במחזיק המערך המחבר של מנתח ההימנעות, ואשר מגע תקין של מבוי סולדנס נמוך בין האלקטרודות לבין מנתח ההימנעות. בחר את סוג האלקטרודה ו/או תבנית מרובת בארות בממשק המשתמש של התוכנה. אם מצבי רכישת נתונים בתדר יחיד ותדירות מרובה זמינים ומספר בארות שיש לנתח נמוך או שרזולוציית הזמן אינה קריטית, בחר הקלטות תדרים מרובים.כדי להבטיח רזולוציית זמן מרבית, בחר תדר ניטור יחיד. לאחר מכן התחל ברכישת נתוני קורס הזמן ובחר את תיקיית הנתונים עבור היכן לשמור את הנתונים. קריאות בלתי מוגבלות יירשמו במספר התדרים שצוין עבור כל באר כדי ליזום את פרוטוקול התוספת הטורית במצב אגוניסט עבור מערך שמונה בארות, להוסיף 30 microliters של הריכוז הנמוך ביותר של אגוניסט של עניין לתאים.לאחר מכן תן לתאים להגיב ולהצייד לתקופה מוגדרת מראש של זמן לפני הוספת 30 microliters של הריכוז הגבוה הבא עד כל דילול סדרתי של אגוניסט נוסף. כדי לנתח את הנתונים, הפחת את ההפחתה של נקודת הנתונים האחרונה לפני התוספת הראשונה של פתרון אגוניסט והגדר את הזמן של אפס חיבור כדי לנרמל את ערכי ההפחתה. להתוות את מהלך הזמן של מכשול מנורמל, ולתכנן את קורסי הזמן האישיים כדי לזהות את מקסימום ב מכשול לאחר כל צעד נוסף.חבר גליון נתונים עם ערכים אלה והתווה את הערכים של שינוי מבוי סביל מרבי כפונקציה של הריכוז היוניסטי. לאחר מכן השתמשו בשגרה של התאמת נתונים כדי לקבוע את הריכוזים היעילים החצי-מקסימליים ואת התגובה המרבית באמצעות המודל הלוגיסטי בן ארבעת הפרמטרים. בניסוי מייצג זה נוספו לתאים 10 פתרונות עם הגדלת ריכוזי היסטמין ברצף כל 15 דקות, והשינוי בהיכל נמדד בכל נקודת זמן.לאחר מכן ניתן היה לתוות את שינויי ההיסדנס כפונקציה של ריכוז היסטמין ואת פונקציית ההעברה של מודל לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים המותאם לנקודות הנתונים הניסיוניות משבע בארות. כדי להסביר את הפחתת קולטן היסטמין אפשרי, רגישות התא, או overstimulation, טווח הנתונים לניתוח ניתן להפחית, כפי שמוצג עבור ניסוי מינון סדרתי יחיד זה. לאחר מכן ניתן להחיל אופטימיזציה של שלושה פרמטרים על הנתונים, מתן ריכוז יעיל חצי מקסימלי של 0.75 פלוס או מינוס 0.12 מיקרומולר לניתוח זה.התוספת של דיפנהידרמין אנטגוניסט קולטן היסטמין 20 דקות לפני ההיסטמין הראשון תוצאות עלייה מאוחרת של עכבה בתוך ערכת מינון סדרתי, בהתאם לצורך אגוניסט גבוה יותר כדי להפוך תגובה התא. ביחסי תגובת המינון, ההשפעה של היריב באה לידי ביטוי כתזוזה ימינה של העקומות, המתאימה לעלייה בריכוז היעיל החצי מקסימלי, בתנאי שהאנטגוניסט הוא ליגנד תחרותי ביחס לאגוניסט. יישום מוצלח של ערכת מנון סדרתי הוא קל מבחינה טכנית אבל דורש תכנון מתחשב, כפי שהוא מאתגר לבצע את כל השלבים עם העיתוי הנכון.מינוי סדרתי סלל את הדרך לביצוע מחקרי תגובת ריכוז עם מערכות קריאה אחרות המוגבלות ביחס למספר הדגימות המנוטרות במקביל. היתרונות הספציפיים של מינוי סדרתי מאפשרים את המחקר של משכן אותות מתווך קולטן עם readouts חדשים לחלוטין רגישים לשינויים פנוטיפיים אחרים, כמו ציטומכניקה. נא ללבוש כפפות ומנועים בעת הכנת פתרונות המלאי של אגוניסט הקולטן, כפי שהם עלולים להיות מסוכנים כאשר בשאיפה או בלע.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

פרוטוקול מקסימלי בעל שחייה בצמיחה מהירה באמצעות שחיה על הערכת שחיינים

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...