Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

हम सेल पुलिया और प्रयोगात्मक समाधान तैयार करने के साथ उनकी मदद के लिए बारबरा Goricnick और Nadja Hinterreiter शुक्रिया अदा करते हैं । लेखक कृतज्ञता से अनुसंधान प्रशिक्षण समूह 1910 द्वारा वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं "चयनात्मक GPCR ligands के औषधीय रसायन" अनुदान संख्या 222125149 के तहत जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (DFG) द्वारा वित्त पोषित। JAS बवेरियन लैंगिक समानता कार्यक्रम द्वारा दी गई छात्रवृत्ति के लिए विशेष रूप से आभारी है।

1. इलेक्ट्रोड सरणी पर सेल सीडिंग
नोट: इलेक्ट्रोड लेआउट का चयन अध्ययन के तहत संवेदनशीलता और कोशिकाओं की संख्या के बीच एक व्यापार बंद है। इलेक्ट्रोड जितना छोटा होगा, माप उतना ही संवेदनशील होता ह...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल लेबल-मुक्त बाधा मापन के लिए एक विधि का वर्णन करता है ताकि एक ही रिसेप्टर के लिए विशिष्ट विरोधी की अनुपस्थिति या उपस्थिति में एगोनिस्ट-प्रेरित जीपीसीआर सक्रियण की खुराक-प्रतिक्रिया संबंध...

यह रिपोर्ट लेबल-फ्री बाधा मापन द्वारा अनुयायी विकसित कोशिकाओं में लिगांड-प्रेरित जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) सक्रियण के परिमाणीकरण के लिए विकसित एक धारावाहिक अतिरिक्त प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रस्तुत करती है । जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआरएस) शारीरिक कार्यों और मानव रोगों की एक भीड़ में शामिल हैं1। इस वजह से और सेल की सतह पर उनकी अच्छी पहुंच, GPCRs सबसे महत्वपूर्ण दवा लक्ष्यों में से एक हैं । यह आकलन जीपीसीआरएस को लक्षित करने वाली ~ 700 अनुमोदित दवाओं की अनुमानित संख्या में परिलक्षित होता है, जो सभी विपणनवालीदवाओं 2 पर ~ 35% हिस्सेदारी के बराबर है।
नई दवाओं के विकास में दो केंद्रीय प्रक्रियाएं शामिल हैं: (i) जैविक लक्ष्य अणुओं की पहचान और कार्यात्मक लक्षण वर्णन, और (ii) नए लीड पदार्थों की खोज और प्रशासनीय दवाओं में उनके विकास। दोनों प्रक्रियाओं में, दवा-लक्ष्य बातचीत और बाद में जैविक डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रिया का मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए कुशल तरीकों की आवश्यकता होती है। पूर्व नैदानिक दवा विकास प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में दवा और लक्ष्य के बीच जैव आणविक बातचीत अध्ययन से लेकर, संस्कृति में कोशिकाओं पर कार्यात्मक अध्ययन पर, उत्पादित अंग सामग्री या पूरे जानवरों पर प्रयोगों के लिए विश्लेषण के विभिन्न तरीकों का उपयोग करते हैं। दोनों, शारीरिक महत्व और जैविक जटिलता पूर्व से बाद3तक बढ़ जाती है । हालांकि यह पशु प्रयोगों को कम करने के लिए समग्र लक्ष्य है, प्रयोगशाला जानवरों या यहां तक कि पूरे जानवरों से अलग अंगों का उपयोग कर औषधीय अध्ययन व्यापक रूप से नई दवा उंमीदवारों की विशेषता अपरिहार्य माना जाता है । विश्लेषणात्मक readout के संदर्भ में, अंग फार्माकोलॉजी अध्ययन उच्चतम शारीरिक प्रासंगिकता की एक जिला, एकीकृत "समग्र" कार्यात्मक प्रतिक्रिया प्रदान करते हैं। इस तरह के प्रयोगों की एक खामी यह है कि वे तकनीकी और नैतिक कारणों के लिए उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के अनुकूल नहीं हैं और इन विट्रो सेल संस्कृति4के आधार पर अध्ययनों द्वारा काफी हद तक प्रतिस्थापित किए गए हैं ।
सेल संस्कृतियों में जीपीसीआर सक्रियण की मात्रा निर्धारित करने के तरीकों में विभिन्न लेबल-आधारित रासायनिक परख शामिल हैं, जो विशेष रूप से दूसरे दूतों का पता लगाते हैं, डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग प्रोटीन की फॉस्फोरिलेशन स्थिति, कुछ ट्रांसक्रिप्शन कारकों या लिगांड-प्रेरित इंट्रासेलर रिसेप्टर तस्करी4,5के माध्यम से ट्रांसक्रिप्शन सक्रियण। इस तरह के लेबल आधारित परखों की एक खामी संभावित हानिकारक रंगों या रेडियोधर्मी मार्कर के साथ कोशिकाओं लेबल करने की आवश्यकता है । यह अक्सर एक जोखिम समय है कि एक प्राथमिकताओंनिर्दिष्ट किया जाना है के लिए एक अंत बिंदु निर्धारण के रूप में परख चलाने की आवश्यकता है । लेबल-आधारित एंडपॉइंट परखों का उपयोग प्रयोग के इस बहुत ही सीमित और पक्षपातपूर्ण समय से ग्रस्त है और यह जोखिम कि रासायनिक लेबल और जांच नियमित सेल फिजियोलॉजी में हस्तक्षेप कर सकते हैं - संभावित रूप से प्रयोगकर्ता द्वारा किसी का ध्यान नहीं गया।
हाल के वर्षों में, जीपीसीआर सक्रियण की निगरानी के लिए लेबल-मुक्त परख उभरा है, जैसे बाधा आधारित तकनीकया ऑप्टिकल तरीके गूंजते तरंग मार्गदर्शक झंझरी5,6लागू करते हैं । इन दृष्टिकोणों के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग की प्रायोगिक रूप से आवश्यकता नहीं है। चूंकि ये भौतिक रीडआउट कम आयाम संकेतों पर काम करते हैं, इस तरह के तरीकों को गैर-आक्रामक माना जाता है, वे वास्तविक समय में संभावित रूप से निरंतर सेल निगरानी के लिए अनुमति देते हैं और अवलोकन समय केवल कोशिका संस्कृति द्वारा सीमित नहीं है। पूरे अंगों से readouts के समान, लेबल मुक्त दृष्टिकोण आमतौर पर समग्र सेल प्रतिक्रियाओं पर रिपोर्ट, रिसेप्टर सक्रियण के अभी तक डाउनस्ट्रीम जब पूरे सिग्नलिंग नेटवर्क के साथ एकीकरण समय पर निर्भर है, लेकिन सेल आकृति विज्ञान या बड़े पैमाने पर पुनर्वितरण में अविशिष्ट परिवर्तन की ओर जाता है । जबकि बाधा आधारित परख सेल आकार7,8में परिवर्तन के डाइइलेक्ट्रिक हस्ताक्षर को मापते हैं, अनुनाद तरंग मार्गदर्शक झंझरी का उपयोग करमाप गतिशील जन पुनर्वितरण (डीएमआर)9से उत्पन्न सेल-सब्सट्रेट इंटरफेस पर अपवर्तक सूचकांक में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होते हैं। एकीकृत चरित्र लेबल-मुक्त तरीकों को जी प्रोटीन (जीक्यू,जीआई/0,जीएस,जी12/13)के प्रकार (एस) की परवाह किए बिना रिसेप्टर-मध्यस्थता की घटनाओं के प्रति अत्यंत संवेदनशील बनाता है या रिसेप्टर के एंडोजेनस अभिव्यक्ति स्तरों के लिए सिग्नलिंग झरना6 और अच्छी तरह से अनुकूल में शामिल है।
एक मानक लेबल-मुक्त बाधा आधारित परख में कोशिकाओं को प्रत्येक अच्छी तरह से10के तल पर जमा coplanar सोने फिल्म इलेक्ट्रोड के साथ बहु अच्छी तरह से प्लेटों में उगाया जाता है । ये इलेक्ट्रोड सरणी एक बाधा विश्लेषक से जुड़े होते हैं और एक प्रयोगात्मक उत्तेजना के लिए सेल प्रतिक्रियाएं समय-हल बाधा रीडिंग द्वारा व्यक्तिगत कुओं से दर्ज की जाती हैं। एक ठेठ GPCR परख में एक ligand प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से अलग सांद्रता में जोड़ा जाता है । बाधा समय पाठ्यक्रम में लिगांड-प्रेरित परिवर्तनों का विश्लेषण विशिष्ट वक्र सुविधाओं जैसे अधिकतम सिग्नल परिवर्तन, वक्र के तहत क्षेत्र, एक निश्चित समय अंतराल या एक निर्दिष्ट समय बिंदु पर वक्र की ढलान के भीतर संकेत परिवर्तन के संबंध में किया जाता है, ताकि लिगांड की शक्ति और प्रभावकारिता11की मात्रा निर्धारित की जा सके।
इलेक्ट्रोड सरणी की लागत उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) अभियानों में इस तकनीक के आवेदन को सीमित कर सकती है। इसके अलावा, नमूनों की बढ़ती संख्या के साथ समानांतर रूप से पालन किया जाएगा, व्यक्तिगत माप की संख्या बढ़ जाती है और इस तरह प्रत्येक अच्छी तरह से धीरे-धीरे के लिए उपलब्ध समय संकल्प को कम कर देता है - यहां तक कि कला मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग के राज्य के लिए। ऐसी स्थितियों के तहत तेजी से और क्षणिक सेल प्रतिक्रियाएं माप से बच सकती हैं। इसके अलावा, पारंपरिक एक अच्छी तरह से - एक एकाग्रता दृष्टिकोण लिगांड-जीपीसीआर इंटरैक्शन विश्लेषण में उनकी उपयुक्तता के संबंध में छिद्रित अंग-ऑन-चिप या शरीर-ऑन-चिप विकास पर एक महत्वपूर्ण समय और लागत कारक लगाता है।
इस कारण से, हमने एक स्टेपवाइज खुराक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो सुसंस्कृत सेल मोनोलेयर में लिगांड-प्रेरित जीपीसीआर सक्रियण की पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया घटता की रिकॉर्डिंग को लगातार एक अच्छी तरह से की बाधा की निगरानी करके सक्षम बनाता है जबकि पीड़ावादी एकाग्रता में कदम से वृद्धि होती है। धारावाहिक एगोनिस्ट इसके अलावा प्रोटोकॉल काफी अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 10 या अधिक सांद्रता के लिए बढ़ जाती है, के रूप में मानव U-373 MG कोशिकाओं के वर्तमान उदाहरण पर दिखाया गया है, जो ईर्ष्या से हिस्टामाइन 1 रिसेप्टर (H1R) व्यक्त करते हैं । इस प्रकार, विधि में लेबल-मुक्त खुराक-प्रतिक्रिया अध्ययनों में थ्रूपुट में काफी सुधार करने की क्षमता है, जबकि समय संकल्प को महत्वपूर्ण अधिकतम पर बनाए रखा जाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

लेबल-मुक्त बाधा आधारित परखों का उपयोग सेल संस्कृति प्रयोगों में लिगांड-प्रेरित जीपीसीआर सक्रियण का गैर-आक्रामक अध्ययन करने के लिए किया जाता है। दृष्टिकोण एक डिवाइस पर निर्भर समय संकल्प के साथ वास्तविक समय सेल निगरानी प्रदान करता है मिलीसेकंड के कई दसियों के लिए नीचे और यह अत्यधिक स्वचालित है । हालांकि, जब नमूना संख्या उच्च हो (जैसे, विभिन्न विभिन्न लिगांड के लिए खुराक-प्रतिक्रिया अध्ययन), डिस्पोजेबल इलेक्ट्रोड सरणी के लिए लागत के साथ-साथ अनुक्रमिक अच्छी तरह से अच्छी तरह से रिकॉर्डिंग के लिए उपलब्ध समय संकल्प सीमित हो सकता है। इसलिए, हम यहां एक धारावाहिक एगोनिस्ट अतिरिक्त प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें लेबल-फ्री जीपीसीआर परखके उत्पादन में काफी वृद्धि करने की क्षमता है। धारावाहिक एगोनिस्ट अतिरिक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके, एक जीपीसीआर एगोनिस्ट को नमूने की बाधा (एगोनिस्ट मोड) की लगातार निगरानी करते हुए एक कोशिका परत में सांद्रता बढ़ाने में क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है। इस सीरियल अप्रोच के साथ अब सिर्फ एक ही सेल लेयर से जीपीसीआर एगोनिस्ट के लिए फुल डोज-रिस्पांस कर्व स्थापित करना संभव है । धारावाहिक एगोनिस्ट इसके अलावा प्रोटोकॉल विभिन्न जीपीसीआर युग्मन प्रकारों, जीक्यू जीआई/0 या जीएस पर लागू होता है और यह अध्ययन के तहत रिसेप्टर के पुनः संयोजन और अंतःप्रयोज्य अभिव्यक्ति स्तरों के साथ संगत है। जीपीसीआर विरोधी द्वारा रिसेप्टर अवरुद्ध करना मूल्यांकन योग्य है (विरोधी मोड)।

विभिन्न एगोनिस्ट समाधान तैयार करने के लिए एक विशिष्ट योजना को टेबल 1-4में एगोनिस्ट के रूप में हिस्टामाइन के साथ 8-अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड सरणी का उपयोग करके प्रयोग के लिए दिखाया गया है। इसके...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

यह प्रोटोकॉल लेबल-मुक्त बाधा मापन का उपयोग करके एक माइक्रोइलेक्ट्रोड पर उगाई जाने वाली एक कोशिका परत से एगोनिस्ट-प्रेरित जीपीसीआर सक्रियण के लिए पूर्ण खुराक-प्रतिक्रिया संबंधों की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग को दर्शाता है। नई खुराक योजना काफी समय संकल्प में नुकसान के बिना थ्रूपुट बढ़ जाती है ।

लेबल-फ्री बाधा-आधारित जीपीसीआर अखस में वृद्धि थ्रूपुट के लिए स्टेपवाइज डोजिंग प्रोटोकॉल

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

यह प्रोटोकॉल एक सेल आबादी से जीपीसीआर एगोनिस्ट के पूर्ण कार्यात्मक एकाग्रता प्रतिक्रिया संबंध की रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है और कम सेल नमूना संख्या के लिए भी विस्तृत एगोनिस्ट लक्षण प्रदान करता है। सीरियल डोजिंग का मुख्य लाभ थ्रूपुट में वृद्धि है क्योंकि एक भी कुआं पूर्ण एकाग्रता प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए पर्याप्त है। यह तकनीक दुर्लभ और जटिल जैविक मॉडलों में एकल ट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जैसे बंद माइक्रोफ्लुइडिक कंटेनरों में अंग-ऑन-चिप प्रारूप।प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल नहीं है, बशर्ते उचित उपकरण उपलब्ध है। सही एकाग्रता पर विभिन्न जीपीसीआर लिगांड समाधान तैयार करना सफलता की कुंजी है। माइकल Skiba, एक स्नातक छात्र, और ऐनी मिल्डनर, एक स्नातक छात्र, हमारी प्रयोगशाला से प्रक्रिया का प्रदर्शन करेंगे ।इलेक्ट्रोड सरणी पर सेल सीडिंग के लिए, प्रत्येक इलेक्ट्रोड सरणी के कुओं में कोशिकाओं की उचित एकाग्रता जोड़ें, और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 10 से 15 मिनट के लिए कुएं के नीचे से समरूप रूप से व्यवस्थित करने की अनुमति दें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कम से कम 36 घंटे के बाद, कोशिकाओं के साथ प्रत्येक इलेक्ट्रोड का पूरा कवरेज सुनिश्चित करने के लिए चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल परतों का निरीक्षण करें। फिर सेल कल्चर मीडियम को प्रत्येक कुएं में प्री-वार्म्ड, सीरम-फ्री मीडियम की उचित मात्रा के साथ बदलें ।एक बाधा रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए, इलेक्ट्रोड सरणी को बाधा विश्लेषक के कनेक्टिंग सरणी धारक में रखें, और इलेक्ट्रोड और बाधा विश्लेषक के बीच उचित कम बाधा संपर्क की पुष्टि करें। सॉफ्टवेयर के यूजर इंटरफेस में इलेक्ट्रोड टाइप और/या मल्टी-वेल फॉर्मेट का चयन करें । यदि एकल और एकाधिक आवृत्ति डेटा अधिग्रहण मोड उपलब्ध हैं और विश्लेषण किए जाने वाले कुओं की संख्या कम है या समय संकल्प महत्वपूर्ण नहीं है, तो कई आवृत्ति रिकॉर्डिंग का चयन करें।अधिकतम समय समाधान सुनिश्चित करने के लिए, एक एकल निगरानी आवृत्ति का चयन करें। फिर समय पाठ्यक्रम डेटा का अधिग्रहण शुरू करें, और डेटा को बचाने के लिए डेटा फ़ोल्डर का चयन करें। बाधा रीडिंग हर अच्छी तरह से एक आठ अच्छी तरह सरणी के लिए एगोनिस्ट मोड में धारावाहिक इसके अलावा प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए आवृत्तियों की निर्दिष्ट संख्या में दर्ज किया जाएगा, कोशिकाओं के लिए ब्याज की पीड़ाकार्य की सबसे कम एकाग्रता के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें ।फिर कोशिकाओं को जवाब दें और अगले उच्चतम एकाग्रता के 30 माइक्रोलीटर जोड़ने से पहले समय की पूर्वनिर्धारित अवधि के लिए संतुलन जब तक कि प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने वाला नहीं जोड़ा जाता है। डेटा का विश्लेषण करने के लिए, एगोनिस्ट समाधान के पहले अतिरिक्त से पहले पिछले डेटा बिंदु की बाधा को घटाएं, और बाधा मूल्यों को सामान्य करने के लिए अतिरिक्त शून्य का समय निर्धारित करें। सामान्यीकृत बाधा के समय पाठ्यक्रम को प्लॉट करें, और प्रत्येक अतिरिक्त चरण के बाद बाधा में मैक्सिमा की पहचान करने के लिए व्यक्तिगत समय पाठ्यक्रमों को प्लॉट करें।इन मूल्यों के साथ एक डेटा शीट की रचना करें, और अधिकतम बाधा परिवर्तन के मूल्यों को एगोनिस्ट एकाग्रता के कार्य के रूप में प्लॉट करें। फिर चार पैरामीटर लॉजिस्टिक मॉडल का उपयोग करके आधे-अधिकतम प्रभावी सांद्रता और अधिकतम प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए डेटा-फिटिंग दिनचर्या का उपयोग करें। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, हर 15 मिनट में कोशिकाओं में हिस्टामिन सांद्रता बढ़ाने वाले 10 समाधानों को क्रमिक रूप से जोड़ा गया था, और हर समय बिंदु पर बाधा में परिवर्तन को मापा गया था।बाधा परिवर्तन तो हिस्टामाइन एकाग्रता के एक समारोह और सात कुओं से प्रयोगात्मक डेटा अंक के लिए फिट एक चार पैरामीटर रसद मॉडल के हस्तांतरण समारोह के रूप में साजिश रची जा सकती है । संभावित हिस्टामाइन रिसेप्टर डाउनरेगुलेशन, सेल डिसेन्सिटाइजेशन या ओवरस्टिमुलेशन के लिए खाते में, विश्लेषण के लिए डेटा रेंज को कम किया जा सकता है, जैसा कि इस एकल धारावाहिक डोजिंग प्रयोग के लिए दिखाया गया है। इसके बाद डेटा पर तीन पैरामीटर अनुकूलन लागू किया जा सकता है, जो इस विश्लेषण के लिए 0.75 प्लस या माइनस 0.12 माइक्रोमोलर की आधा-अधिकतम प्रभावी एकाग्रता प्रदान करता है।हिस्टामाइन रिसेप्टर विरोधी के अलावा डिफेनहाइड्रामाइन 20 मिनट पहले पहले हिस्टामाइन के परिणामस्वरूप धारावाहिक डोजिंग योजना के भीतर बाधा की देरी से वृद्धि होती है, जो सेल प्रतिक्रिया को प्रकाश में लाने के लिए एक उच्च एगोनिस्ट की आवश्यकता के अनुरूप है । खुराक प्रतिक्रिया संबंध में, विरोधी का प्रभाव घटता के एक दक्षिणपंथी बदलाव के रूप में व्यक्त किया जाता है, जो आधे अधिकतम प्रभावी एकाग्रता में वृद्धि के अनुरूप होता है, बशर्ते विरोधी एगोनिस्ट के सापेक्ष एक प्रतिस्पर्धी लिगांड हो। धारावाहिक डोजिंग योजना का सफल अनुप्रयोग तकनीकी रूप से आसान है, लेकिन विचारशील योजना की आवश्यकता है, क्योंकि सही समय के साथ सभी चरणों को करना चुनौतीपूर्ण है।धारावाहिक खुराक अन्य readout सिस्टम है कि समानांतर में निगरानी नमूनों की संख्या के संबंध में सीमित कर रहे हैं के साथ एकाग्रता प्रतिक्रिया अध्ययन प्रदर्शन के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। धारावाहिक डोजिंग के विशेष फायदे रिसेप्टर-मध्यस्थता संकेत ट्रांसडक्शन के अध्ययन को पूरी तरह से नए रीडआउट के साथ अनुमति देते हैं जो साइटोमेचनिक्स जैसे अन्य फेनोटाइपिक परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील होते हैं। रिसेप्टर एगोनिस्ट के स्टॉक समाधान तैयार करते समय दस्ताने और चश्मे पहनें, क्योंकि साँस लेने या निगलने पर वे खतरनाक हो सकते हैं।

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

स्वचालित ध्वनिक शक्ति निर्धारण assays में पेप्टाइड agonists के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए वितरण

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

इन विट्रो Ubicuitination और न्यूक्लिओसोमल हिस्टोन्स के Deubiquitination परख

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

निगरानी GPCR-जेड-arrestin1/2 ड्रग डिस्कवरी में तेजी लाने के लिए वास्तविक समय रहने वाले सिस्टम में बातचीत

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

बड़े पैमाने पर परमाणु इंटरैक्टूम प्रोफाइलिंग के लिए लेबल-फ्री इम्यूनोप्रिसिप्रिशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ्लो

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

तैराकों के कार्डियोरेस्पिरेटरी मूल्यांकन के लिए एक तेजी से वेतन वृद्धिशील Tethered-तैराकी अधिकतम प्रोटोकॉल

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

एक संयोजन एकल डोमेन एंटीबॉडी लाइब्रेरी के स्टेपवाइज फाग चयन द्वारा अत्यधिक विशिष्ट रासायनिक प्रेरित प्रोटीन डामरीकरण सिस्टम बनाना

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

सफल क्रिस्टलीकरण के लिए विजुअल जीपीसीआर-मिनी-जी प्रोटीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की रणनीतिक स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

PRESTO-टैंगो परख का उपयोग कर एक GPCR-वाइड पैमाने पर लिगांड स्क्रीनिंग के लिए 2 भर्ती के समानांतर पूछताछ

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

इन विट्रो विश्लेषणात्मक, पुल-डाउन और चैपरोनिंग परख का उपयोग करके हिस्टोन चैपरोन का लक्षण वर्णन

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...