Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
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Ringraziamo Barbara Goricnick e Nadja Hinterreiter per il loro aiuto nella coltura cellulare e nella preparazione di soluzioni sperimentali. Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario del Gruppo di formazione della ricerca 1910 "Chimica medicinale dei ligandi SElettivi di GPCR" finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) con il numero di sovvenzione 222125149. JAS è particolarmente grato per una borsa di studio concessa dal Programma bavarese per l'uguaglianza di genere.

1. Semina cellulare su array di elettrodi
NOTA: La selezione del layout degli elettrodi è un compromesso tra sensibilità e numero di cellule in studio. Più piccolo è l'elettrodo, più sensibile è la misura, ma minore è il numero di cellule in fase di studio. Per le cellule che mostrano forti fluttuazioni di impeditto nel tempo in condizioni di base, sono preferibili elettrodi più grandi o interdigitati.
<ol><li>Preriscaldare tutte le soluzioni necessarie per il passaggio e il semina d...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Questo protocollo descrive un metodo per le misurazioni di impeditto senza etichetta per determinare la relazione dose-risposta dell'attivazione GPCR indotta da agonisti in assenza o presenza di antagonisti specifici per lo stesso recettore. La prova di concetto di questo metodo è stata presentata in una recente pubblicazione12. Per quanto ne sappiamo, è il primo studio che descrive l'istituzione di una curva dose-risposta completa di attivazione GPCR mediata da agonisti utilizzando un singolo s...

Questo rapporto presenta una descrizione dettagliata di un protocollo di addizione seriale sviluppato per la quantificazione dell'attivazione del recettore accoppiato con proteina G (GPCR) indotta dal ligando (GPCR) nelle cellule coltivate con aderenza mediante misurazioni di impedimento senza etichette. I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono coinvolti in una moltitudine di funzioni fisiologiche e malattie umane1. A causa di questo e della loro buona accessibilità sulla superficie cellulare, i GPCR sono uno dei più importanti bersagli farmacologici. Questa valutazione si riflette in un numero stimato di 700 dollari di farmaci approvati destinati ai GPCR, pari a una quota del 35% su tutti i farmaci commercializzati2.
Lo sviluppo di nuovi farmaci comprende due processi centrali: (i) l'identificazione e la caratterizzazione funzionale delle molecole bersaglio biologiche e (ii) la scoperta di nuove sostanze di piombo e il loro sviluppo in farmaci amministrativi. In entrambi i processi, sono necessari metodi efficienti per valutare quantitativamente le interazioni farmaco-bersaglio e la successiva risposta biologica a valle. Diverse fasi del processo di sviluppo di farmaci preclinici fanno uso di diversi metodi di analisi che vanno da studi di interazione biomolecolare tra farmaco e bersaglio, su studi funzionali sulle cellule in coltura, a esperimenti su materiale di organi ascisi o animali interi. Entrambi, il significato fisiologico e la complessità biologica aumentano dal primo al secondo3. Sebbene sia l'obiettivo generale di ridurre al minimo gli esperimenti sugli animali, gli studi farmacologici che utilizzano organi isolati di animali da laboratorio o persino animali interi sono considerati inevitabili per caratterizzare in modo completo nuovi farmaci candidati. In termini di lettura analitica, gli studi di farmacologia degli organi forniscono una risposta funzionale "olistica" dissintesa e integrativa di massima rilevanza fisiologica. Uno svantaggio di tali esperimenti è che non sono compatibili con lo screening ad alta produttività per motivi tecnici ed etici e sono stati in gran parte sostituiti da studi basati sulla coltura delle cellule in vitro4.
I metodi per quantificare l'attivazione di GPCR nelle colture cellulari includono diversi saggi chimici basati su etichette, che rilevano specificamente i secondi messaggeri, lo stato di fosforolalazione delle proteine di segnalazione a valle, l'attivazione trascrizionale tramite determinati fattori di trascrizione o il traffico di recettori intracellulari indotti dal ligando4,5. Uno degli inconvenienti di tali analisi basate su etichette è la necessità di etichettare le cellule con coloranti potenzialmente dannosi o marcatori radioattivi. Ciò richiede spesso l'esecuzione dell'espressione come endpoint-determinazione per un tempo di esposizione che deve essere specificato a priori. L'utilizzo di analisi endpoint basate su etichette soffre di questa tempistica molto limitata e di parte dell'esperimento e del rischio che etichette chimiche e sonde possano interferire con la fisiologia cellulare regolare – potenzialmente inosservata dallo sperimentatore.
Negli ultimi anni sono emersi saggi senza etichette per il monitoraggio dell'attivazione di GPCR, come tecniche basate su impedimento o metodi ottici che applicano griglie di guida d'onda risonanti5,6. L'etichettatura delle cellule non è richiesta sperimentalmente con questi approcci. Poiché queste letture fisiche operano su segnali a bassa ampiezza, tali metodi sono considerati non invasivi, consentono un monitoraggio continuo delle cellule potenzialmente in tempo reale e il tempo di osservazione è limitato solo dalla coltura cellulare non dalla lettura. Simile alle letture da organi interi, gli approcci senza etichetta segnalano comunemente risposte olistiche cellulari, a valle dell'attivazione del recettore quando l'integrazione lungo l'intera rete di segnalazione porta a cambiamenti dipendenti dal tempo ma piuttosto non specifici nella morfologia cellulare o nella ridistribuzione di massa. Mentre i saggi basati su impedimenti misurano la firma dielettrica delle variazioni della forma cellulare7,8, le misurazioni utilizzando griglie di guida d'onda risonanti sono sensibili ai cambiamenti nell'indice di rifrazione nell'interfaccia cellulare-substrate derivanti dalla ridistribuzione dinamica della massa (DMR)9. Il carattere integrativo rende i metodi privi di etichetta estremamente sensibili agli eventi mediati dal recettore indipendentemente dal tipo(s) di proteina G (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) o z-arrestin coinvolti nella cascata di segnalazione6 e adatti per i livelli di espressione endogeni del recettore.
In un saggio standard senza etichetta basato su impedance le cellule sono coltivate aderentemente in piastre multi-bene con elettrodi coplanari a pellicola d'oro depositati sul fondo di ogni pozzo10. Questi array di elettrodi sono collegati a un analizzatore di impedimenti e le risposte cellulari a uno stimolo sperimentale sono registrate da singoli pozzi da letture di impedimenti risolti nel tempo. In un tipico saggio GPCR un ligando viene aggiunto in concentrazioni singolarmente diverse ad ogni singolo pozzo. Le variazioni indotte dal ligando nel corso del tempo impedibile vengono quindi analizzate rispetto alle caratteristiche della curva come il cambio massimo del segnale, l'area sotto la curva, la variazione del segnale entro un determinato intervallo di tempo o pendenza della curva in un determinato punto temporale, al fine di quantificare la potenza e l'efficacia del ligando11.
Il costo degli array di elettrodi può limitare l'applicazione di questa tecnica nelle campagne di screening ad alta produttività (HTS). Inoltre, con un numero crescente di campioni da seguire in parallelo, il numero di singole misurazioni aumenta e quindi riduce gradualmente la risoluzione del tempo disponibile per ogni pozzo , anche per le registrazioni multicanale all'avanguardia. In tali condizioni le risposte cellulari rapide e transitorie possono sfuggire alla misurazione. Inoltre, quello convenzionale bene – un approccio di concentrazione impone un fattore di tempo e di costo significativo sugli sviluppi perfusi organo su chip o corpo su chip per quanto riguarda la loro idoneità nell'analisi dell'interazione ligand-GPCR.
Per questo motivo, abbiamo sviluppato un protocollo di dosaggio stepwise che consente la registrazione di curve di risposta alla dose completa dell'attivazione GPCR indotta dal ligando in monostrati cellulari coltivati monitorando continuamente l'impedimento di un singolo pozzo mentre la concentrazione agonista aumenta di passo. Il protocollo di addizione agonista seriale aumenta significativamente la produttività per bene da una concentrazione a 10 o più concentrazioni, come mostrato nell'attuale esempio di cellule umane U-373 MG, che endogenamente esprimono il recettore dell'istamina 1 (H1R). Pertanto, il metodo ha il potenziale per migliorare significativamente la produttività negli studi di risposta alla dose senza etichette, mentre la risoluzione del tempo viene mantenuta al massimo strumentale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

I saggi basati su impedimenti senza etichetta sono sempre più utilizzati per studiare in modo non invasivo l'attivazione di GPCR indotta dal ligando negli esperimenti di coltura cellulare. L'approccio fornisce il monitoraggio delle celle in tempo reale con una risoluzione temporale dipendente dal dispositivo fino a diverse decine di millisecondi ed è altamente automatizzato. Tuttavia, quando i numeri di esempio diventano elevati (ad esempio, studi di risposta alla dose per vari ligandi diversi), il costo per gli array di elettrodi usa e getta e la risoluzione del tempo disponibile per le registrazioni sequenziali bene-bene possono diventare limitanti. Pertanto, noi qui presentiamo un protocollo di addizione agonista seriale che ha il potenziale per aumentare significativamente la produzione di saggi GPCR senza etichette. Utilizzando il protocollo di aggiunta agonista seriale, un agonista GPCR viene aggiunto in sequenza nell'aumentare le concentrazioni a un singolo strato di cellule, monitorando continuamente l'impedimento del campione (modalità agonista). Con questo approccio seriale, è ora possibile stabilire una curva completa dose-risposta per un agonista GPCR da un solo strato di cella singola. Il protocollo di addizione agonista seriale è applicabile a diversi tipi di accoppiamento GPCR, Gq Gi/0 o Gs ed è compatibile con i livelli di espressione ricombinanti ed endogeni del recettore in fase di studio. Anche il blocco del recettore da parte degli antagonisti del GPCR è valutabile (modalità antagonista).

Uno schema tipico per la preparazione delle varie soluzioni agonista è mostrato per un esperimento utilizzando 8-well array di elettrodi con istamina come agonista nelle tabelle 1-4. La tabella 1 e la tabella 2 presentano i volumi e le concentrazioni per un esperimento che utilizza la modalità di addizione 1 (cfr., figura 1), mentre la tabella 3 e la tabella 4 presentano volumi e concentra...

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Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Questo protocollo dimostra la registrazione in tempo reale delle relazioni dose-risposta completa per l'attivazione GPCR indotta da agonisti da un singolo strato di cellule coltivato su un singolo microelettrodo utilizzando misurazioni di impeditto senza etichetta. Il nuovo schema di dosso aumenta significativamente la velocità effettiva senza perdita di risoluzione del tempo.

Protocollo di dosing stepwise per aumentare la velocità effettiva nei dati GPCR basati su impeditto per etichetta

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Questo protocollo consente la registrazione di una relazione completa di risposta alla concentrazione funzionale dell'agonista GPCR da una popolazione cellulare e fornisce una caratterizzazione agonista dettagliata anche per numeri di campione a celle basse. Il principale vantaggio del dosing seriale è l'aumento della produttività poiché un singolo pozzo è sufficiente per un'analisi completa della risposta alla concentrazione. Questa tecnica è adatta per studiare la trasduzione singola in modelli biologici rari e complessi, come i formati organ-on-chip in contenitori microfluidici chiusi.Il protocollo non è difficile da eseguire, a condizione che sia disponibile l'attrezzatura appropriata. Preparare le varie soluzioni di ligando GPCR alla giusta concentrazione è la chiave del successo. Michael Skiba, una studentessa laureata, e Anne Mildner, una studentessa universitaria, del nostro laboratorio dimostreranno la procedura.Per la semina cellulare sugli array di elettrodi, aggiungere la concentrazione appropriata di cellule ai pozzi di ogni array di elettrodi e consentire alle celle di depositarsi in modo omogeneo sui fondi del pozzo per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Dopo almeno 36 ore in un incubatore di coltura cellulare standard a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, ispezionare gli strati cellulari mediante microscopia a contrasto di fase per garantire una copertura completa di ogni elettrodo con cellule. Quindi sostituire il mezzo di coltura cellulare in ogni pozzo con il volume appropriato di mezzo pre-riscaldato e privo di siero.Per avviare una registrazione di impedenza, posizionare l'array di elettrodi nel supporto dell'array di collegamento dell'analizzatore di impedenza e confermare un corretto contatto a bassa impedenza tra gli elettrodi e l'analizzatore di impedenza. Selezionare il tipo di elettrodo e/o il formato multi-pozzo nell'interfaccia utente del software. Se sono disponibili modalità di acquisizione dati a frequenza singola e multipla e il numero di pozzi da analizzare è basso o la risoluzione del tempo non è critica, selezionare registrazioni a più frequenze.Per garantire una risoluzione del tempo massima, selezionare una singola frequenza di monitoraggio. Quindi iniziare l'acquisizione dei dati del corso di tempo e selezionare la cartella dei dati per dove salvare i dati. Le letture di impedenza verranno registrate al numero specificato di frequenze per ogni pozzo Per avviare il protocollo di addizione seriale in modalità agonista per un array di otto pozzi, aggiungere 30 microlitri della concentrazione più bassa dell'agonista di interesse alle celle.Quindi lasciare che le cellule rispondano ed equilibrano per il periodo di tempo predefinito prima di aggiungere 30 microlitri della successiva concentrazione più alta fino a quando non è stata aggiunta ogni diluizione seriale dell'agonista. Per analizzare i dati, sottrarre l'impedenza dell'ultimo punto dati prima della prima aggiunta della soluzione agonista e impostare il tempo di aggiunta zero per normalizzare i valori di impedenza. Traccia il corso di tempo dell'impedenza normalizzata e traccia i singoli corsi di tempo per identificare i massimi in impedenza dopo ogni fase di addizione.Comporre una scheda dati con questi valori e tracciare i valori della variazione di impedenza massima in funzione della concentrazione agonista. Utilizzare quindi una routine di adattamento dati per determinare le concentrazioni effettive semi-massime e la massima risposta utilizzando il modello logistico a quattro parametri. In questo esperimento rappresentativo, 10 soluzioni con concentrazioni crescenti di istamina sono state aggiunte sequenzialmente alle cellule ogni 15 minuti e il cambiamento di impedenza è stato misurato in ogni momento.I cambiamenti di impedenza potrebbero quindi essere tracciati in funzione della concentrazione di istamina e della funzione di trasferimento di un modello logistico a quattro parametri montato sui punti dati sperimentali da sette pozzi. Per tenere conto di possibili downregolazioni del recettore dell'istamina, desensibilizzazione cellulare o sovrastimolazione, l'intervallo di dati per l'analisi può essere ridotto, come mostrato per questo singolo esperimento di dosing seriale. L'ottimizzazione a tre parametri può quindi essere applicata ai dati, fornendo una concentrazione effettiva semi-massima di 0,75 più o meno 0,12 micromolare per questa analisi.L'aggiunta della difenidramina antagonista del recettore dell'istamina 20 minuti prima della prima istamina provoca un aumento ritardato dell'impedenza all'interno dello schema di dosazione seriale, corrispondente alla necessità per un agonista più alto di ottenere una risposta cellulare. Nella relazione di risposta alla dose, l'effetto dell'antagonista è espresso come uno spostamento verso destra delle curve, corrispondente ad un aumento della concentrazione effettiva semi-massima, a condizione che l'antagonista sia un ligando competitivo rispetto all'agonista. L'applicazione riuscita dello schema di dosing seriale è tecnicamente semplice, ma richiede una pianificazione ponderata, in quanto è difficile eseguire tutti i passaggi con la tempistica corretta.Il dosing seriale ha spianato la strada all'esecuzione di studi di risposta alla concentrazione con altri sistemi di lettura limitati rispetto al numero di campioni monitorati in parallelo. I particolari vantaggi del dosing seriale consentono lo studio della trasduzione del segnale mediata dal recettore con letture completamente nuove che sono sensibili ad altri cambiamenti fenotipici, come la citomeccanica. Si prega di indossare guanti e occhiali quando si preparano le soluzioni stock dell'agonista del recettore, in quanto potrebbero essere pericolosi quando inalati o inghiottiti.

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