Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Vi takker Barbara Goricnick og Nadja Hinterreiter for deres hjelp med cellekulturing og utarbeidelse av eksperimentelle løsninger. Forfatterne anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Research Training Group 1910 "Medisinsk kjemi av selektive GPCR ligands" finansiert av Den tyske forskningsstiftelsen (DFG) under tilskuddsnummer 222125149. JAS er spesielt takknemlig for et stipend gitt av det bayerske likestillingsprogrammet.

1. Cellesåing på elektrodearrayer
MERK: Valg av elektrodelayout er en avveining mellom følsomhet og antall celler under studier. Jo mindre elektroden er, desto mer følsom er målingen, men jo mindre er antall celler under studier. For celler som viser sterke impedanssvingninger over tid under baselineforhold, er større eller interdigitalerte elektroder å foretrekke.
<ol><li>Forhåndsvarm alle løsninger som trengs for standard cellepassering og såing i et 37 ° C vannbad. For analyser...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en metode for etikettfrie impedansmålinger for å bestemme doseresponsforholdet mellom agonist-indusert GPCR-aktivering i fravær eller tilstedeværelse av spesifikke antagonister for samme reseptor. Bevis på begrepet denne metoden ble presentert i en nylig publikasjon12. Så vidt vi vet er det den første studien som beskriver etableringen av en full doseresponskurve av agonist-mediert GPCR-aktivering ved hjelp av et enkeltcellelag in vitro. Tilnærmingen krever uunn...

Denne rapporten presenterer en detaljert beskrivelse av en seriell addisjonsprotokoll utviklet for kvantifisering av ligand-indusert G protein-koblet reseptor (GPCR) aktivering i tett dyrkede celler ved etikettfrie impedansmålinger. G protein-koblet reseptorer (GPCRs) er involvert i en rekke fysiologiske funksjoner og menneskelige sykdommer1. På grunn av dette og deres gode tilgjengelighet på celleoverflaten, gpcrs er en av de viktigste narkotika mål. Denne vurderingen gjenspeiles i et estimert antall ~ 700 godkjente legemidler rettet mot GPCRs, tilsvarende en ~ 35% andel på alle markedsførte legemidler2.
Utviklingen av nye legemidler består av to sentrale prosesser: (i) identifisering og funksjonell karakterisering av biologiske målmolekyler, og (ii) oppdagelsen av nye blystoffer og deres utvikling til administrable narkotika. I begge prosessene er det nødvendig med effektive metoder for å kvantitativt evaluere interaksjoner mot legemiddelmål og den påfølgende biologiske nedstrømsresponsen. Ulike stadier av den prekliniske legemiddelutviklingsprosessen benytter seg av ulike analysemetoder som spenner fra biomolekylære interaksjonsstudier mellom legemiddel og mål, over funksjonelle studier på celler i kultur, til eksperimenter på utskåret organmateriale eller hele dyr. Både fysiologisk betydning og biologisk kompleksitet øker fra den tidligere til de siste3. Selv om det er det overordnede målet å minimere dyreforsøk, er farmakologiske studier ved hjelp av isolerte organer fra laboratoriedyr eller til og med hele dyr ansett uunngåelig for å fullstendig karakterisere nye legemiddelkandidater. Når det gjelder analytisk avlesning, gir organfarmakologistudier en distale, integrerende "helhetlig" funksjonell respons av høyeste fysiologiske relevans. En ulempe med slike eksperimenter er at de ikke er kompatible med høy gjennomstrømningsscreening av tekniske så vel som etiske grunner og har i stor grad blitt erstattet av studier basert på in vitro cellekultur4.
Metoder for å kvantifisere GPCR-aktivering i cellekulturer inkluderer forskjellige etikettbaserte kjemiske analyser, som spesifikt oppdager andre budbringere, fosforyleringstilstand av nedstrøms signalproteiner, transkripsjonsaktivering via visse transkripsjonsfaktorer eller ligandindusert intracellulær reseptorsmugling4,5. En ulempe med slike etikettbaserte analyser er nødvendigheten av å merke cellene med potensielt skadelige fargestoffer eller radioaktive markører. Dette krever ofte å kjøre analysen som et endepunktbestemmelse for en eksponeringstid som må angis som en priori. Ved hjelp av etikettbaserte endepunktanalyser lider av denne svært begrensede og partiske timingen av eksperimentet og risikoen for at kjemiske etiketter og sonder kan forstyrre den vanlige cellefysiologien – potensielt ubemerket av eksperimentereren.
I de senere årene har etikettfrie analyser for overvåking av GPCR-aktivering dukket opp, som impedansbaserte teknikker eller optiske metoder som bruker resonant bølgeguide rister5,6. Merking av cellene er eksperimentelt ikke nødvendig med disse tilnærmingene. Ettersom disse fysiske avlesningene opererer på lave amplitudesignaler, anses slike metoder som ikke-invasive, de tillater kontinuerlig celleovervåking potensielt i sanntid, og observasjonstiden er bare begrenset av cellekulturen som ikke er av lesningen. I likhet med avlesninger fra hele organer, label-free tilnærminger ofte rapportere om holistiske cellesvar, langt nedstrøms av reseptor aktivering når integrasjon langs hele signalnettverket fører til tidsavhengige, men heller uspesifikke endringer i celle morfologi eller masse omfordeling. Mens impedansbaserte analyser måler dielektrisk signatur av endringer i celleform7,8, er målinger ved hjelp av resonant waveguide rister følsomme for endringer i brytningsindeks ved cellesubstratgrensesnittet som oppstår fra dynamisk masseomfordeling (DMR)9. Det integrerende tegnet gjør etikettfrie metoder ekstremt følsomme for reseptormedierte hendelser uavhengig av type(er) av G-protein (Gq, Gi/0,Gs,G12/13)eller β-arrestin involvert i signalkaskade6 og godt egnet for endogene uttrykksnivåer av reseptoren.
I en standard etikettfri impedansbasert analyse dyrkes cellene tett i multi-brønnplater med coplanar gullfilmelektroder avsatt på bunnen av hver brønn10. Disse elektrodearrayene er koblet til en impedansanalysator, og celleresponsen på en eksperimentell stimulans registreres fra individuelle brønner ved tidsløstimpedansmålinger. I en typisk GPCR analyse en ligand er lagt i individuelt forskjellige konsentrasjoner til hver enkelt brønn. De ligand-induserte endringene i impedanstidskurset analyseres deretter med hensyn til karakteristiske kurvefunksjoner som maksimal signalendring, område under kurven, signalendring innen et gitt tidsintervall eller helling av kurven på et bestemt tidspunkt, for å kvantifisere ligandens styrke og effekt11.
Kostnaden for elektrodearrayene kan begrense anvendelsen av denne teknikken i høy gjennomstrømningsscreening (HTS)-kampanjer. Videre, med økende antall prøver som skal følges parallelt, øker antall individuelle målinger og reduserer dermed tilgjengelig tidsoppløsning for hver brønn gradvis - selv for toppmoderne flerkanalsopptak. Under slike forhold kan raske og forbigående celleresponser unnslippe målingen. I tillegg pålegger den konvensjonelle en brønn – en konsentrasjonstilnærming en betydelig tid og kostnadsfaktor på perfundert organ-on-chip- eller body-on-chip-utvikling med hensyn til deres egnethet i ligand-GPCR interaksjonsanalyse.
Av denne grunn utviklet vi en trinnvis doseringsprotokoll som muliggjør registrering av full doseresponskurver av ligand-indusert GPCR-aktivering i kultiverte cellemonolag ved kontinuerlig å overvåke impedansen til en enkelt brønn mens den pinefulle konsentrasjonen økes trinnvis. Den serieagonist addisjonsprotokollen øker gjennomstrømningen betydelig per brønn fra en konsentrasjon til 10 eller flere konsentrasjoner, som vist på det nåværende eksempelet på humane U-373 MG-celler, som endogene uttrykker histamin 1 reseptoren (H1R). Dermed har metoden potensial til å forbedre gjennomstrømningen betydelig i etikettfrie doseresponsstudier, mens tidsoppløsningen beholdes på det instrumentelle maksimumet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

Etikettfrie impedansbaserte analyser brukes i økende grad til å ikke-invasivt studere ligandindusert GPCR-aktivering i cellekultureksperimenter. Tilnærmingen gir sanntidscelleovervåking med en enhetsavhengig tidsoppløsning ned til flere titalls millisekunder, og den er svært automatisert. Men når prøvetallene blir høye (f.eks. doseresponsstudier for ulike ligander), kan kostnaden for engangselektrodearrayene samt tilgjengelig tidsoppløsning for sekvensielle brønn-for-brønn-opptak bli begrensende. Derfor presenterer vi her en seriell agonist addisjonsprotokoll som har potensial til å øke produksjonen av etikettfrie GPCR-analyser betydelig. Ved hjelp av den seriell agonist additiv additusjonsprotokollen, legges en GPCR-agonist sekvensielt i økende konsentrasjoner til et enkelt cellelag mens du kontinuerlig overvåker prøvens impedans (agonistmodus). Med denne seriell tilnærmingen er det nå mulig å etablere en full doseresponskurve for en GPCR-agonist fra bare ett enkeltcellelag. Den serieagonist addisjonsprotokollen gjelder for ulike GPCR-koblingstyper, Gq Gi/0 eller Gs, og den er kompatibel med rekombinant- og endogene uttrykksnivåer av reseptoren under studien. Reseptorblokkering av GPCR-antagonister kan også vurderes (antagonistmodus).

En typisk ordning for å forberede de ulike agonist løsningene er vist for et eksperiment ved hjelp av 8-brønnelektrode arrays med histamin som agonist i tabeller 1-4. Tabell 1 og tabell 2 presenterer volumer og konsentrasjoner for et eksperiment ved hjelp av addisjonsmodus 1 (jf., figur 1),mens tabell 3 og tabell 4 presenterer volumer og konsentrasjoner for et eksperiment etter ti...

Watch this Scientific Journal Video about Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays at JoVE.com

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Denne protokollen demonstrerer sanntidsregistrering av full doseresponsrelasjoner for agonist-indusert GPCR-aktivering fra et enkeltcellelag dyrket på en enkelt mikroelektrode ved hjelp av etikettfrie impedansmålinger. Den nye doseringsordningen øker gjennomstrømningen betydelig uten tap i tidsoppløsning.

Trinnvis Doseringsprotokoll for økt gjennomstrømming i etikettfrie impedansbaserte GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Denne protokollen muliggjør registrering av et komplett funksjonelt konsentrasjonsresponsforhold av GPCR-agonist fra en cellepopulasjon og gir detaljert agonistisk karakterisering selv for lave celleprøvenumre. Den største fordelen med serielldosering er økningen i gjennomstrømning siden en enkelt brønn er tilstrekkelig for en full konsentrasjonsresponsanalyse. Denne teknikken er godt egnet til å studere enkelttransduksjon i sjeldne og komplekse biologiske modeller, som organ-on-chip formater i lukkede mikrofluidiske beholdere.Protokollen er ikke vanskelig å utføre, forutsatt at riktig utstyr er tilgjengelig. Å forberede de ulike GPCR ligand-løsningene ved riktig konsentrasjon er nøkkelen til suksess. Michael Skiba, en utdannet student, og Anne Mildner, en lavere student, fra vårt laboratorium vil demonstrere prosedyren.For cellesåing på elektrodearrayene, legg til riktig konsentrasjon av celler til brønnene til hver elektrodematrise, og la cellene bosette seg homogent på brønnbunnene i 10 til 15 minutter ved romtemperatur. Etter minst 36 timer i en standard cellekultur inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, inspiser cellelagene etter fasekontrastmikroskopi for å sikre en fullstendig dekning av hver elektrode med celler. Erstatt deretter cellekulturmediet i hver brønn med riktig volum av forvarmet, serumfritt medium.For å starte et impedansopptak plasserer du elektrodematrisen i tilkoblingsmatriseholderen på impedansanalysatoren, og bekrefter en riktig kontakt med lav impedans mellom elektrodene og impedansanalysatoren. Velg elektrodetype og/eller flerbrønnsformat i brukergrensesnittet til programvaren. Hvis enkelt- og flerfrekvensdatainnsamlingsmoduser er tilgjengelige og antall brønner som skal analyseres, er lavt eller tidsoppløsningen ikke er kritisk, velger du flere frekvensopptak.Velg én enkelt overvåkingsfrekvens for å sikre maksimal tidsoppløsning. Start deretter innhenting av tidsforløpet, og velg datamappen for hvor dataene skal lagres. Impedansavlesningene vil bli registrert ved det angitte antallet frekvenser for hver brønn For å initiere seriell addisjonsprotokoll i agonistmodus for en åtte-brønns array, legg til 30 mikroliter av den laveste konsentrasjonen av agonist av interesse for cellene.La deretter cellene reagere og likevekt i den forhåndsdefinerte tidsperioden før de tilsetter 30 mikroliter av den nest høyeste konsentrasjonen til hver seriell fortynning av agonisten er tilsatt. Hvis du vil analysere dataene, trekker du fra impedansen til det siste datapunktet før det første tillegget av agonistløsning, og angir tidspunktet for tilsetning null for å normalisere impedansverdiene. Plott tidsforløpet av normalisert impedans, og plott de enkelte tidskursene for å identifisere maxima i impedans etter hvert tilleggstrinn.Skriv et datablad med disse verdiene, og plott verdiene for maksimal impedansendring som en funksjon av den agonistiske konsentrasjonen. Bruk deretter en datatilpasset rutine for å bestemme de halvmaksimale effektive konsentrasjonene og maksimal respons ved hjelp av fireparameterlogistikkmodellen. I dette representative eksperimentet ble 10 løsninger med økende histaminkonsentrasjoner sekvensielt lagt til cellene hvert 15.Impedansendringene kan deretter plottes som en funksjon av histaminkonsentrasjon og overføringsfunksjonen til en fireparameterlogistikkmodell montert på de eksperimentelle datapunktene fra syv brønner. For å ta høyde for mulig histaminreseptornedregulering, celledesensibilisering eller overstimulering, kan dataområdet for analysen reduseres, som vist for dette enkelt serielldoseringseksperimentet. Treparameteroptimalisering kan deretter brukes på dataene, noe som gir en halv maksimal effektiv konsentrasjon på 0,75 pluss eller minus 0,12 mikromos for denne analysen.Tilsetningen av histaminreseptorantagonisten difenhydramin 20 minutter før det første histamin resulterer i en forsinket økning av impedans i den serielle nedsedringsordningen, tilsvarende behovet for en høyere agonist for å fremkalle en cellerespons. I doseresponsforholdet uttrykkes effekten av antagonisten som et høyreskifte av kurvene, tilsvarende en økning i halvmaksimal effektiv konsentrasjon, forutsatt at antagonisten er en konkurransedyktig ligand i forhold til agonist. Vellykket bruk av seriell dosering ordningen er teknisk enkelt, men krever gjennomtenkt planlegging, som det er utfordrende å utføre alle trinnene med riktig timing.Serienummer har banet vei for å utføre konsentrasjonsresponsstudier med andre avlesningssystemer som er begrenset med hensyn til antall prøver som overvåkes parallelt. De spesielle fordelene med seriell dosing tillater studiet av reseptormediert signaltransduksjon med helt nye avlesninger som er følsomme for andre fenotypiske endringer, som cytomekanikk. Bruk hansker og vernebriller når du tilbereder lagerløsningene til reseptoragonisten, da de kan være farlige ved innånding eller svelging.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiqitinering og Deubiquitination analyser av Nucleosomal Histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Overvåking GPCR-β-arrestin1/2 interaksjoner i Real time levende systemer for å akselerere Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunutfelling masse massespektrometri arbeidsflyt for stor skala kjernefysisk Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

En raskt inkremet tethered-svømming maksimal protokoll for kardiorespiratorisk vurdering av svømmere

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Opprette svært spesifikke kjemisk indusert protein Dimerization Systems av trinnvis Phage utvalg av Kombinatorisk single-Domain antistoff bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallell avhør av β-Arrestin2 Rekruttering for Ligand Screening på en GPCR-wide Scale ved hjelp av PRESTO-Tango Analyse

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

In vitro Karakterisering av Histone Chaperones ved hjelp av analytiske, nedtrekkbare og chaperoning analyser

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...