Name: stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00
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Agradecemos a Barbara Goricnick e Nadja Hinterreiter pela ajuda com o culturing celular e a preparação de soluções experimentais. Os autores reconhecem com gratidão o apoio financeiro do Grupo de Treinamento de Pesquisa 1910 Química medicinal de ligas seletivas do GPCR financiadas pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) o número de subvenção 222125149. Jas é particularmente grato por uma bolsa de estudos concedida pelo Programa de Igualdade de Gênero bávaro.

1. Semeade celular em matrizes de eletrodos
NOTA: A seleção do layout do eletrodo é uma troca entre sensibilidade e número de células em estudo. Quanto menor o eletrodo, mais sensível é a medida, mas menor é o número de células em estudo. Para as células que mostram fortes flutuações de impedância ao longo do tempo em condições de linha de base, eletrodos maiores ou interdigitados são preferíveis.
<ol><li>Pré-aqueça todas as soluções necessárias para a passagem e semea...

<ol>
	<li>Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+G-protein-coupled+receptors.">The structure and function of G-protein-coupled receptors.</a> Nature. 459, 356-363 (2009).</li><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptors+as+Targets+for+Approved+Drugs:+How+Many+Targets+and+How+Many+Drugs.">G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.</a> Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).</li><li>Kaitin, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+drug+development+process:+The+new+face+of+innovation.">Deconstructing the drug development process: The new face of innovation.</a> Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).</li><li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+assays+as+portals+to+seven-transmembrane+receptor-based+drug+discovery.">Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).</li><li>Zhang, R., Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+GPCR+drug+discovery.">Tools for GPCR drug discovery.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).</li><li>Scott, C. W., Peters, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+whole-cell+assays:+expanding+the+scope+of+GPCR+screening.">Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening.</a> Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells.">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366, 591-592 (1993).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophysical Journal. 91, 16 (2006).</li><li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function:+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements.">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li><li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+versus+conventional+cellular+assays:+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor.">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li><li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol.">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10 (2019).</li></ol>

Este protocolo descreve um método para medições de impedância sem rótulos para determinar a relação de dose-resposta da ativação gpcr induzida por agonistas na ausência ou presença de antagonistas específicos para o mesmo receptor. A prova de conceito desse método foi apresentada em uma publicação recente12. Para nosso conhecimento, é o primeiro estudo descrevendo o estabelecimento de uma curva completa de resposta de dose da ativação GPCR mediada por agonistas usando uma única ...

Este relatório apresenta uma descrição detalhada de um protocolo de adição serial desenvolvido para a quantificação da ativação do receptor acoplado por proteínaG induzida por ligand (GPCR) em células cultivadas aderentamente por medições de impedância sem rótulo. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) estão envolvidos em uma infinidade de funções fisiológicas e doenças humanas1. Por causa disso e sua boa acessibilidade na superfície celular, os GPCRs são um dos alvos mais importantes de drogas. Esta avaliação se reflete em um número estimado de ~700 medicamentos aprovados visando GPCRs, equivalente a uma participação de ~35% em todas as drogas comercializadas2.
O desenvolvimento de novas drogas compreende dois processos centrais: (i) a identificação e caracterização funcional de moléculas-alvo biológicas, e (ii) a descoberta de novas substâncias de chumbo e seu desenvolvimento em drogas administradas. Em ambos os processos, métodos eficientes são necessários para avaliar quantitativamente as interações medicamentosas-alvo e a resposta biológica subsequente a jusante. Diferentes estágios do processo pré-clínico de desenvolvimento de medicamentos fazem uso de diferentes métodos de análise que vão desde estudos de interação biomolecular entre medicamentos e alvos, além de estudos funcionais sobre células na cultura, até experimentos sobre material de órgãos excizados ou animais inteiros. Tanto, a significância fisiológica quanto a complexidade biológica aumentam do primeiro para o último3. Embora seja o objetivo global de minimizar os experimentos com animais, estudos farmacológicos usando órgãos isolados de animais de laboratório ou mesmo animais inteiros são considerados inevitáveis para caracterizar de forma abrangente novos candidatos a medicamentos. Em termos de leitura analítica, estudos de farmacologia de órgãos fornecem uma resposta funcional distal e integrativa "holística" de maior relevância fisiológica. Uma desvantagem desses experimentos é que eles não são compatíveis com triagem de alto desempenho por razões técnicas e éticas e foram amplamente substituídos por estudos baseados na cultura celular in vitro4.
Métodos para quantificar a ativação do GPCR nas culturas celulares incluem diferentes ensaios químicos baseados em rótulos, que detectam especificamente segundo mensageiros, estado de fosforilação de proteínas de sinalização a jusante, ativação transcricional através de certos fatores de transcrição ou tráfico de receptor intracelular induzido por ligand4,5. Uma desvantagem desses ensaios baseados em rótulos é a necessidade de rotular as células com corantes potencialmente prejudiciais ou marcadores radioativos. Isso muitas vezes requer executar o ensaio como uma determinação de ponto final para um tempo de exposição que tem que ser especificado um priori. O uso de ensaios de ponto final baseados em rótulos sofre desse timing muito limitado e tendencioso do experimento e do risco de que rótulos químicos e sondas possam interferir na fisiologia celular regular – potencialmente despercebida pelo experimentador.
Nos últimos anos, ensaios sem rótulos para monitoramento da ativação do GPCR surgiram, como técnicas baseadas em impedância ou métodos ópticos que aplicam grades ressonantes de guia de onda5,6. A rotulagem das células não é experimentalmente necessária com essas abordagens. Como essas leituras físicas operam em sinais de baixa amplitude, tais métodos são considerados não invasivos, permitem o monitoramento contínuo celular potencialmente em tempo real e o tempo de observação é limitado apenas pela cultura celular não pela leitura. Semelhante às leituras de órgãos inteiros, abordagens sem rótulos comumente relatam respostas de células holísticas, muito a jusante da ativação do receptor quando a integração ao longo de toda a rede de sinalização leva a mudanças dependentes do tempo, mas sim inespecíficas na morfologia celular ou redistribuição em massa. Considerando que ensaios baseados em impeção medem a assinatura dielétrica de mudanças na forma celular7,8, as medidas usando grades ressonantes de guia de onda são sensíveis a alterações no índice refrativo na interface do substrato celular decorrentes da redistribuição dinâmica de massa (DMR)9. O caractere integrativo torna os métodos livres de rótulos extremamente sensíveis aos eventos mediados por receptores, independentemente do tipo(s) de proteína G (Gq , Gi/0, G12/13) ou β-arrestin envolvido na cascata de sinalização 6 e adequado para níveis endógenos de expressão do receptor.
Em um ensaio baseado em impedância sem rótulo padrão, as células são cultivadas em placas multi-bem com eletrodos de filme de ouro coplanar depositados na parte inferior de cada poço10. Essas matrizes de eletrodos estão conectadas a um analisador de impedância e as respostas das células a um estímulo experimental são registradas a partir de poços individuais por leituras de impedância resolvidas pelo tempo. Em um ensaio típico gpcr um ligand é adicionado em concentrações individualmente diferentes para cada bem individual. As alterações induzidas no curso de tempo de impedância são então analisadas em relação a características de curva característica, como mudança máxima de sinal, área a curva, mudança de sinal dentro de um determinado intervalo de tempo ou inclinação da curva em um ponto de tempo especificado, a fim de quantificar a potência e eficácia do ligand11.
O custo das matrizes de eletrodos pode limitar a aplicação dessa técnica em campanhas de triagem de alto nível (HTS). Além disso, com o aumento do número de amostras a serem seguidas em paralelo, o número de medições individuais aumenta e, assim, reduz a resolução de tempo disponível para cada poço gradualmente - mesmo para gravações multicanais de última geração. Nessas condições, respostas rápidas e transitórias das células podem escapar da medição. Além disso, o convencional bem – uma abordagem de concentração impõe um fator de tempo e custo significativo sem recursos perfundidos em desenvolvimentos de órgãos-on-chip ou body-on-chip em relação à sua adequação na análise de interação ligand-GPCR.
Por essa razão, desenvolvemos um protocolo de dosagem stepwise que permite a gravação de curvas completas de resposta de dose da ativação gpcr induzida por ligand em monocamadas de células cultivadas, monitorando continuamente a impeância de um único poço enquanto a concentração agonista é aumentada stepwise. O protocolo de adição agonista em série aumenta significativamente o throughput por poço de uma concentração para 10 ou mais concentrações, como mostrado no exemplo atual das células U-373 MG humanas, que expressam endógenamente o receptor histamina 1 (H1R). Assim, o método tem o potencial de melhorar significativamente o throughput em estudos de dose-resposta sem rótulos, enquanto a resolução de tempo é mantida no máximo instrumental.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>Marienfeld (Lauda-K&#246;nigshofen, Germany)</td>
			<td>640210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flasks 25 cm2</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>690175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Heraeus 1S-R)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenhydramine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D3630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Impedance Instrument (ECIS Z&#952;)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well electrode arrays (96W1E+ PET)</td>
			<td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td>
			<td>\</td>
			<td>PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Biochrom (Berlin, Germany)</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Carl Roth (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td>4017.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood (Herasafe, KS 12)</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>51022515</td>
			<td>class II safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39; L-15 medium</td>
			<td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette large (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>704778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot)</td>
			<td>Nikon (D&#252;sseldorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, serological</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (accu-jet pro)</td>
			<td>Brandt (Wertheim, Germany)</td>
			<td>26300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany)</td>
			<td>T4174</td>
			<td>in PBS with 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube, 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td>
			<td>210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-373 MG cells</td>
			<td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td>
			<td>ATCC HTB-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath (TW21)</td>
			<td>Julabo (Seelbach, Germany)</td>
			<td>\</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stepwise dosing protocol for increased throughput in label-free impedance-based gpcr assays

Ensaios baseados em impedância sem rótulos são cada vez mais usados para estudar contraato sinuoso ativado rGP em experimentos de cultura celular. A abordagem fornece monitoramento celular em tempo real com uma resolução de tempo dependente do dispositivo até várias dezenas de milissegundos e é altamente automatizada. No entanto, quando os números de amostra ficam altos (por exemplo, estudos de dose-resposta para várias ligas diferentes), o custo para as matrizes de eletrodos descartáveis, bem como a resolução de tempo disponível para gravações sequenciais bem-por-bem podem se tornar limitadoras. Portanto, apresentamos aqui um protocolo de adição agonista em série que tem o potencial de aumentar significativamente a produção de ensaios GPCR sem rótulos. Usando o protocolo de adição agonista serial, um agonista gpcr é adicionado sequencialmente em aumentar as concentrações em uma única camada celular enquanto monitora continuamente a impedância da amostra (modo agonista). Com essa abordagem serial, agora é possível estabelecer uma curva completa de resposta de dose para um agonista GPCR de apenas uma camada de célula única. O protocolo de adição agonista serial é aplicável a diferentes tipos de acoplamento GPCR, Gq Gi/0 ou Gs e é compatível com níveis de expressão recombinantes e endógenos do receptor em estudo. O bloqueio de receptores por antagonistas gpcr também é avaliado (modo antagonista).

Um esquema típico para preparar as várias soluções agonistas é mostrado para um experimento usando matrizes de eletrodos de 8 poços com histamina como agonista nas tabelas 1-4. Tabela 1 e Tabela 2 apresentam volumes e concentrações para um experimento utilizando o modo de adição 1 (cf., Figura 1),enquanto a Tabela 3 e a Tabela 4 apresentam volumes e concentrações para um experime...

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Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Este protocolo demonstra o registro em tempo real de relações completas de resposta a dose para ativação gpcr induzida por agonista a partir de uma única camada celular cultivada em um único microeletrodo usando medidas de impedância sem rótulo. O novo esquema de dosagem aumenta significativamente o throughput sem perda na resolução de tempo.

Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

Este protocolo permite o registro de uma relação completa de resposta de concentração funcional do agonista GPCR de uma população celular e fornece caracterização agonista detalhada mesmo para números de amostras de células baixas. A principal vantagem da dosagem serial é o aumento da produtividade, uma vez que um único poço é suficiente para uma análise completa de resposta de concentração. Esta técnica é adequada para estudar transdução única em modelos biológicos raros e complexos, como formatos de órgãos em chip em recipientes microfluidos fechados.O protocolo não é de difícil execução, desde que o equipamento adequado esteja disponível. Preparar as várias soluções de ligante GPCR na concentração certa é a chave para o sucesso. Michael Skiba, um estudante de pós-graduação, e Anne Mildner, uma estudante de graduação, do nosso laboratório demonstrarão o procedimento.Para semeadura celular nas matrizes de eletrodos, adicione a concentração apropriada de células aos poços de cada matriz de eletrodos e permita que as células se acomodem homogêneamente nas partes inferiores do poço por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de pelo menos 36 horas em uma incubadora de cultura celular padrão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, inspecione as camadas celulares por microscopia de contraste de fase para garantir uma cobertura completa de cada eletrodo com células. Em seguida, substitua o meio de cultura celular em cada poço pelo volume apropriado de meio pré-aquecido e sem soro.Para iniciar uma gravação de impedância, coloque a matriz de eletrodo no suporte de matriz de conexão do analisador de impedância e confirme um contato adequado de baixa impedância entre os eletrodos e o analisador de impedância. Selecione o formato de eletrodo e/ou multi-bem na interface de usuário do software. Se os modos de aquisição de dados de frequência única e múltipla estiverem disponíveis e o número de poços a serem analisados for baixo ou a resolução de tempo não for crítico, selecione várias gravações de frequência.Para garantir uma resolução de tempo máxima, selecione uma única frequência de monitoramento. Em seguida, inicie a aquisição dos dados do curso de tempo e selecione a pasta de dados para onde salvar os dados. As leituras de impedância serão registradas no número especificado de frequências para cada poço Para iniciar o protocolo de adição serial no modo agonista para uma matriz de oito poços, adicione 30 microliters da menor concentração do agonista de interesse para as células.Em seguida, deixe as células responderem e equilibrarem-se durante o período de tempo predefinido antes de adicionar 30 microliters da próxima maior concentração até que cada diluição serial do agonista tenha sido adicionada. Para analisar os dados, subtrair a impedância do último ponto de dados antes da primeira adição da solução agonista, e definir o tempo de adição zero para normalizar os valores de impedância. Traçar o curso temporal de impedância normalizada e traçar os cursos de tempo individuais para identificar a máxima em impedância após cada etapa de adição.Compor uma ficha técnica com esses valores e traçar os valores de máxima impedância em função da concentração agonista. Em seguida, use uma rotina de ajuste de dados para determinar as concentrações efetivas semi-máximas e a resposta máxima usando o modelo logístico de quatro parâmetros. Neste experimento representativo, 10 soluções com o aumento das concentrações de histamina foram adicionadas sequencialmente às células a cada 15 minutos, e a mudança de impedância foi medida em cada ponto de tempo.As mudanças de impedância poderiam então ser traçadas em função da concentração de histamina e da função de transferência de um modelo logístico de quatro parâmetros instalado nos pontos de dados experimentais de sete poços. Para explicar a possível redução do receptor de histamina, dessensibilização celular ou superestimulação, o intervalo de dados para a análise pode ser reduzido, como mostrado para este único experimento de dosagem serial. A otimização de três parâmetros pode então ser aplicada aos dados, fornecendo uma concentração efetiva semi-máxima de 0,75 mais ou menos 0,12 micromolar para esta análise.A adição do antagonista do receptor de histamina difenidramina 20 minutos antes da primeira histamina resulta em um aumento retardado de impedância dentro do esquema de dosagem serial, correspondendo à necessidade de um agonista mais alto para obter uma resposta celular. Na relação de resposta à dose, o efeito do antagonista é expresso como uma mudança para a direita das curvas, correspondendo a um aumento na concentração efetiva meia-máxima, desde que o antagonista seja um ligante competitivo em relação ao agonista. A aplicação bem-sucedida do esquema de dosagem serial é tecnicamente fácil, mas requer um planejamento atencioso, pois é desafiador executar todas as etapas com o tempo correto.A dosagem serial abriu caminho para a realização de estudos de resposta à concentração com outros sistemas de leitura limitados em relação ao número de amostras monitoradas em paralelo. As vantagens particulares da dosagem serial permitem o estudo da transdução de sinal mediada por receptores com leituras completamente novas que são sensíveis a outras alterações fenotípicas, como a citomecânica. Por favor, use luvas e óculos ao preparar as soluções de estoque do agonista receptor, pois elas podem ser perigosas quando inaladas ou engolidas.

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